一文读懂免疫组化步骤结果分析及注意事项

一文读懂  免疫组化步骤、结果分析及注意事项、、、导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟:“想拿高分文章,不学免疫组化怎么行？”免疫组化王子毛博旁边插话:“就是这个理,今天我就豁出去,将我十多年的心得与经验奉献给小师弟您了。”小师弟感激涕零,唯诺细听两位前辈的教诲、、、、、、

免疫组化,免疫组织化学技术(immunohistochemistry),就是一项利用抗原抗体反应,通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原,对蛋白定位,定性的实验技术。免疫组化主要用的就是组织标本与细胞标本两大类,组织标本包括石蜡切片(病理切片与组织芯片)与冰冻切片。石蜡切片,对组织形态保存好,保存时间也长,虽然对组织抗原暴露有影响,但可以抗原修复,所以石蜡切片仍然就是首选的标本制作方法。免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候,我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但就是却不知道如何正确地分析,得出理想的结果。这实在就是一件憾事。如下图,正常的结果应该就是这样的:镜下细胞核呈蓝色,阳性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法,阳性着色细胞计数法与评分法。前者就是在40*光镜下,随机10个视野下计数阳性着色细胞;后者则就是在光学显微镜下按染色程度(0分阴性着色,1分淡黄色,2分浅褐色,3分深褐色)与阳性范围(1分0-25%,2分26-50%,3分51-75%,4分76-100%)评分,最终分

数相加。

免疫组化结果分析就是毛博的特长,以下就是她传授的独门

绝技。

1、对照染色

与做实验的时候必须设立对照组一样,免疫组化也必须设立

对照染色。没有对照染色的免疫组化结果就是不可信的。对照一般有阳性组织对照,阴性组织对照,阴性试剂对照,自身对照。一般来说,有一个阳性组织对照与一个阴性组织对照就足够了。

2、定位

抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上;CK应定位在细胞浆内;PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色,不能视为确切的阳性结果。有可能就是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。

3、半定位

现在一般用图像分析系统进行定量。如果您的实验室不幸没有那么高大上的话,就只好赶鸭子上架,用肉眼定一下量了。因为人为主观性比较强,所以只能称作半定量。免疫组化的半定量一般就分为三级:弱(+),中(++),强(+++)。以绿色免疫荧光为例,则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光与亮绿色耀眼荧光。弱(+)=1,中(++)=2,强(+++)=3。至少随机观察5-10个HPF。

然后根据(+)% x 1 +(++)% x 2 +(+++)% x 3计算出数值;总数值1、5者为(+++)。4、图像分析仪

如果要进行精确定量的话,就要用到图像分析仪。图像分析仪类型很多。这里就不一一介绍了。其实毛博最想隆重推荐的就是一款图像分析软件:Image J。毛博当年在米国做博士猴的时候,就就是用的这款软件。这就是NIH开发的免费软件。一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。现在已经开发到了1、50版。网上可以免费下载。其界面非常简洁,如下图所示。现在,根据一个实例来瞧瞧如何用Image J来进行图像分析。如下图所示,我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。那么,如何用Image J来计数细胞的个数呢？首先,要把彩色的图像转换成黑白图像。步骤如下:Image→Type→16-bit。转换成黑白图像后,将要计数的部分用高亮标示出来。步骤如

下:Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标,直到所有的细胞被标示出来。有时候2个细胞靠得比较紧密,会被计数为1个细胞。这个时候可以采用Image J的水洗功能。步骤如下:Image→Binary→Watershed。如下图的蓝色箭头所示,这些就是本来计数成一个的细胞,经过水洗之后,更加精确地被计数成了2个细胞。然后,就可以正式开始分析了。步骤如

下:Analyze→Analyze Particles。在得出最后的结果之前,还有一些选项需要选择。如果想要计数全部的细胞,那么Size项里面选择“0-infinity”。Circularity的默认值为“0、00-1、00”。