实验十静脉淋巴系统
MTT方法测定脾淋巴细胞转化(20070727)
MTT方法测定脾淋巴细胞转化实验 1.实验步骤： 1.1.调整淋巴细胞浓度： a)小鼠断颈椎处死后，放入75%酒精液浸泡5min； b)用无菌镊子取出小鼠，手术剪剪开腹腔，取脾脏，以1ml无菌注射器将 脾在研钵中磨碎，用3.5ml预冷的Hank’s液悬浮，过筛入无菌平皿，研 钵中再次加入3.5ml Hank’s液，过筛入平皿，将7ml细胞悬液移入塑料 离心管； c)离心1500rpm, 5min； d)用Hank’s液洗2次； e)以2ml完全培养液悬浮细胞，转0.1ml细胞入3.9ml 1.5%冰醋酸，混匀 后计数；其余细胞均放于4℃冰箱预冷，防止细胞死亡； f)根据细胞计数，调整细胞浓度到1*107/ml。（假定4个大方格内总数为N，则 该细胞悬液的浓度为n=105*N） 1.2.刺激物的配备用细胞培养液将各种培养刺激物按2*终浓度稀释，混匀。以 100μl/孔加入96孔细胞培养板中。（PHA和ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS主要刺激B细胞增殖。）ConA 的常用浓度为0.1-15μg/ml，LPS的常用浓度为0.1-10μg/ml , 具体情况要根据细胞浓度和反应时间而定。不同品种的动物也有一定的不同。 1.3.加样在以上各孔中加入工作浓度的淋巴细胞悬液100μl/孔（边加边摇匀，防 止滴加过程中淋巴细胞发生沉淀。细胞培养板具体设计根据具体试验而定，设培养液对照孔。 1.4.培养将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，培养72小时。每过24小时需取 出细胞培养板，在倒置显微镜中查看培养孔中是否出现细菌污染。 1.5.MTT培养结束前4小时，以50ul/孔添加MTT稀释液，继续培养至72小时。 1.6.处理停止细胞培养，离心（1500rpm，10min）使淋巴细胞沉淀，轻轻倾去 细胞培养液，纸巾吸干。加入DMSO，150ul/孔。充分振荡后，避光放置10-15min（直至蓝色颗粒充分溶解） 1.7.检测充分振荡后，570nm单波长酶标仪检测。
淋巴系统
二、淋巴结 1.淋巴结的形态 淋巴结为是哺乳类特有的周围淋巴器官。为大小不等（米粒大小）的圆形或椭圆形小体，（豆形），质软，色灰红，共约450个，位于淋巴回流的通路上。淋巴回流时常含有大分子抗原或微生物，淋巴结对淋巴液进行滤过，对病毒、细菌、异物甚至癌细胞等，进行清除或阻截；淋巴结产生淋巴细胞进行免疫反应。 2.淋巴结微细结构 淋巴结的大小、结构及内含成分与机体的免疫功能状态密切相关。淋巴结一侧凹陷，一侧凸出，几条淋巴管从凸侧进入即输入淋巴管，淋巴结内也有管道及淋巴窦，淋巴管与淋巴窦相通，淋巴液入淋巴结后，经淋巴窦走出，即1~2条淋巴输出管，一个淋巴结的输出管即另一个淋巴结的输入管。 淋巴结表面有结缔组织构成的被膜，数条输入淋巴管穿越被膜与被膜下淋巴窦相连。一侧凹陷为门部，有输出淋巴管、神经、血管出入。被膜和门部的结缔组织伸入实质形成相互连接的小梁，构成淋巴结的粗网架；在粗网架之间由网状组织构成淋巴结的细网架，网眼中填充大量淋巴细胞、巨噬细胞、交错突细胞等。实质可分为浅层的皮质和深层的髓质两部分。 （1）皮质：位于被膜下方，由浅层皮质、副皮质区及皮质淋巴窦构成，是淋巴结的主要构成部分，各部分的结构和厚度随免疫状态的不同而有很大变化。 ①浅层皮质：紧贴被膜下窦，含淋巴小结及小结之间的弥散淋巴组织，为B 细胞区。受抗原刺激后，浅层皮质内出现淋巴小结，此层增厚，当淋巴小结发育成次级淋巴小结，体积增大，深入到深层副皮质区，并出现大的生发中心，这时的淋巴小结分成三部分：帽、明区、暗区。淋巴小结之间的弥散淋巴组织为小结间区，含有较多的初始B细胞，是淋巴结最先接受抗原刺激的部位，可诱生新的淋巴小结。 ②副皮质区 位于皮质深层，为较大片的弥散淋巴组织，其淋巴细胞主要为 T细胞，又称胸腺依赖区。有毛细血管后微静脉，是血液中淋巴细胞进入淋巴组织的重要通道。此处的内皮细胞胞质内常见穿越细胞。血流经过此处时，约10%的淋巴细胞穿越内皮进入副皮质区，再迁移至淋巴结其它部位。 ③皮质淋巴窦 包括被膜下淋巴窦和小梁周窦，小梁周窦的末端为盲端，仅部分与髓质淋巴窦直接相通。 淋巴窦壁由内皮细胞围成，内皮外有薄层基质、少量网状纤维和一层扁平网状细胞，窦内有星状内皮细胞作支架，其中有巨噬细胞和淋巴细胞，淋巴在窦内缓慢流动，有利于巨噬细胞清除异物和处理抗原。当大量抗原物质进入淋巴结内，巨噬细胞即大量增多。 淋巴内的各种细胞和淋巴浆不断穿过或渗过内皮，进人皮质淋巴组织；而淋巴组织中的细胞等成分也不断进人淋巴，这样淋巴组织便成为一种动态的结构，
淋巴细胞转化试验(MTT)
一、淋巴细胞转化试验（MTT） （一）原理： 四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。 （二）材料： MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原 （三）方法： 1、脾细胞制备： （1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上； （2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏； （3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml Hanks液的培养皿中； （4）制备脾细胞悬液 ①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。调整细胞浓度为 5 105/ml。 ②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入
T淋巴细胞转化试验步骤及注意事项
淋巴增殖实验: 第一种，取外周血和脾脏分离淋巴细胞用于淋巴增殖实验,具体步骤如下 ⑴雏鸡翅下釆血2mL,加入1mL抗凝血和1mLPBS的混合液,混合均匀后,缓缓加入装有2mL淋巴细胞分离液的无菌透明的大离心管中,不要摇晃,注意血液与淋巴细胞分离液不要混合,2000rpm,离心20min,可以看见中间有层白色雾状白细胞,吸取白细胞至2inL离心管中,2000rpm离心5min取沉淀; (2)向离心管中加入1mL 1640清洗2遍,2000rpm离心5min取沉淀; ⑶将沉淀悬于1mL DMEM,细胞计数板计数,取 1 xlO7个细胞悬于ImLPBS中,置于37°C培养箱中用CFSE (终浓度2gM)避光染色lOmin,每隔2-3min上下颠倒一次; (4)DMEM洗漆细胞2次,每次1mL,2000rpm离心6-7min; (5)悬于1mL DMEM 中; (6)取5xl05个细胞置于96孔板,同时加入20μ30μg/m的Con A,DMEM补齐至200μL,4℃二氧化碳培养箱诱导3d; (7)流式专用buffer洗涤2次,2000r离心5min,200μbuffer悬起,流式细胞仪检测。 取1小块脾脏加入1mL 1640研磨,脾脏细胞先用200μL红细胞裂解液作用5min,2000rpm离心5min,计数,之后重复上述步骤。
第三种，外周血液 T、B 淋巴细胞增殖功能测定——MTT 测定法 1. 外周血液淋巴细胞悬液的制备无菌采取外周血液，以淋巴细胞分离液密度梯度离心法(2000r/min，20min)分离淋巴细胞，再用 RPMI1640 培养液离心洗涤(1500r/min，10min)淋巴细胞 3 次，用台盼兰拒染法检测细胞活率＞95％，同时进行细胞计数，用 RPMI-l640 完全培养液调细胞浓度至1×107/ml。 2. 外周血液 T 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板每孔加入50μl含20μg/m1 ConA 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液。向每孔中加入淋巴细胞悬液50μl，培养物总体积为100μl，细胞终浓度为 0.5×107/m1，Con A 终浓度为10μg/m1，设 3 重复孔。细胞置 40℃、％CO2、饱和湿度条件下培养 21h。每孔加 5mg/m1MTT 溶液10μl，继续培养3h 后，加入100μl DMSO溶液，置于37℃培养箱恒温作用 15min，取出后用酶联免疫检测仪检测，以空白对照孔调零，检测 590nm 波长下的吸光度值（A590nm），结果以 3 重复孔平均值表示。 3. 外周血液 B 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板中每孔加入50μl 含10μg/m1LPS 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液50μl，设 3 重复孔。每孔中
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案
实验方案 实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、实验目的 1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。 3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其 识别。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。 染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。 在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。 正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。 染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。 表1 人染色体组型及其特征
淋巴系统解剖
淋巴系统的解剖 一、淋巴系统总论 淋巴系统是由人体内淋巴管道、淋巴组织和淋巴器官三大部分组成的，在淋巴管道内流动的 无色透明的液体，称之为淋巴或淋巴液。淋巴组织主要分布在人体消化道和呼吸道等部的黏膜内，淋巴器官是以淋巴组织为主要成分所构成的器官，包括淋巴结，脾、胸腺以及扁桃体等。 当血液流经组织的毛细血管时，血浆中的水及营养物质透过毛细血管滤出进入组织间隙内，形成组织液。组织液在与细胞进行物质交换后，绝大部分水分和代谢产物又从毛细血管的静脉端回流入静脉，小部分的水分和大分子物质，可以经毛细淋巴管管壁进入到毛细淋巴管内，而称为淋巴。 淋巴是一种无色透明的液体，它可以沿着全身各级淋巴管道，向心流动。在流动的过程中，要经过许多淋巴结的滤过，最终又汇入到静脉内，所以淋巴系统又可以看作是血液回流的辅助部分，人体的淋巴系统不仅可以协助静脉进行体液回流，淋巴器官和淋巴组织还具有产生淋巴细胞，滤过淋巴液，产生抗体，参与人体免疫反应的功能。 在淋巴管道内流动的无色透明液体为淋巴或淋巴液，请问体内的淋巴是如何产生的？又是如何循环呢？ 二、淋巴管道 淋巴管道是体内输送淋巴液的管道系统的总称，包括毛细淋巴管、淋巴管、淋巴干和淋巴导管等部分。 （一）毛细淋巴管 毛细淋巴管是淋巴管道的起始部分，毛细淋巴管以膨大的盲端起始于组织间隙内，而且彼此之间可以吻合交织形成网状。毛细淋巴管的管径粗细不均匀，一般要比毛细血管略粗一些，它的管壁由单层扁平内皮细胞呈叠瓦状排列而成，没有基底膜。所以毛细淋巴管的管壁比毛细血管的管壁具有更大的通透性，可以允许水分和较大分子物质进入。 （二）淋巴管 淋巴管是由毛细淋巴管汇合而成的管道，其结构与小静脉类似，但管径比较细，淋巴管在向心行程过程中，通常要经过一个或多个淋巴结。 （三）淋巴干
13体循环的静脉、淋巴系统
(二)体循环的静脉脉 1.上腔静脉系包括上腔静脉及其属支，收集头颈、上肢和胸部的静脉血。 □上腔静脉 ◎组成：在右侧第1胸肋结合处后方由左、右头臂静脉合成，沿升主动脉右侧下行，至右侧第3胸肋关节下缘注入右心房。 左、右头臂静脉： ◎属支 奇静脉： ◎收集范围：收集头颈部、上肢和胸部（心和肺除外）等上半身静脉血。 □头臂静脉： ◎组成：由颈内静脉和锁骨下静脉在胸锁关节的后方汇合而成，汇合处的夹角称静脉角，有淋巴导管注入。 ◎属支：有椎静脉、胸廓内静脉、甲状腺下静脉。 (1)头颈部的静脉 1）颈内静脉：于颈静脉孔处续于乙状窦，在颈动脉鞘内下行沿颈内动脉和颈总动脉的外侧，至胸锁关节的后方与锁骨下静脉汇合。 ①颅内属支：通过硬脑膜窦收集脑膜、脑、颅骨、视器和前庭蜗器的静脉血。 ②颅外属支：面静脉、舌静脉、咽静脉、甲腺上、中静脉，收集同名器官的静脉血。 ◎面静脉:起自内此静脉，在面动脉的后方下行，在下颌角下方跨过颈内、外动脉表面注入颈内静脉。 ◎危险三角：鼻根至两侧口角的三角形区域（缺少静脉瓣）：面V 内眦静脉眼静脉颅内海绵窦 ◎下颌后静脉:由颞浅静脉和上颌静脉在腮腺内汇合而成，下行至腮腺下端分为前、后两支，前支汇入面静脉，后支续为颈外静脉。 2）颈外静脉:由下颌后静脉的后支与耳后静脉、枕静脉汇合而成，沿胸锁乳突肌的表面下行，在锁骨上方穿深筋膜注入锁骨下静脉。收集头皮和面部的静脉血。
◎意义：①儿科；输液、采血、注射；②右心衰时可见颈外静脉怒张 3）锁骨下静脉：于第1肋的外缘续于腋静脉，向内行于同名动脉的前内侧，至胸锁关节的后方于颈内静脉汇合，收集颈浅部和上肢的静脉血。 （2）上肢静脉 1）深静脉与同名动脉伴行。腋静脉收集上肢的所有浅、深静脉血。 2）浅静脉位于皮下，在手背形成手背静脉网。 ①贵要静脉:起自手背静脉网的尺侧，沿前臂的尺侧上行，至肘部转至前面，经肱二头肌内侧沟上行至臂中点平面，穿深筋膜注入肱静脉或腋静脉。 ②头静脉:起自手背静脉网的桡侧，沿前臂的桡侧、肘部的前面、肱二头肌外侧沟上行，经三角肌和胸大肌间沟至锁骨下方穿深筋膜注入腋静脉或锁骨下静脉。 ③肘正中静脉：连于头静脉和贵要静脉之间。 （3）胸部的静脉主要有胸廓内静脉和奇静脉等 1）胸廓内静脉由腹上壁静脉延续而成，与同名动脉伴行，向上注入头臂静脉，收纳同名动脉分布区的静脉血。 2）奇静脉： 行程：起于右腰升静脉，沿胸椎体右侧上行至第4胸椎高度，向前勾绕右肺根上方注入上腔静脉。 属支： ①半奇静脉:收纳左侧下半肋间后静脉和副半奇静脉 ②副半奇静脉：收纳左侧上半肋间后静脉的血 2．下腔静脉系：由下腔静脉及其属支组成，收集下半身的静脉血。 □下腔静脉 1）组成及行程：由左、右髂总静脉平第5腰椎右前方合成，沿腹主动脉右侧、脊柱右前方上行，经肝的腔静脉沟，穿膈腔静脉孔入胸腔，注入右心房。 2）属支：
06静脉淋巴
第四节静脉 目的与要求： 掌握： 1．体循环的静脉组成。 2．上腔静脉系的组成及收集范围；上腔静脉的位置与属支。 3．上肢浅静脉的起始、行径及注入部位； 4．下腔静脉系的组成及收集范围；下腔静脉的位置与属支。 5．下肢浅静脉的起止、行径要点及收集范围。 6．肝门静脉系的组成、收集范围及结构特征。 7．肝门静脉的组成、行径、分支、回流途径及属支。 8．肝门静脉系与上、下腔静脉系之间的吻合部位及临床意义。 熟悉： 1．肺静脉的起始及注入部位； 2．头臂静脉的属支及静脉角的位置；颈内静脉的行径、属支及颅内、外静脉的交通。 3．锁骨下静脉的行径、属支(名称、位置及收集区域)； 4．奇静脉的起止、行程、收集范围及临床意义；脊柱静脉的概念及临床意义。 5．髂总静脉、髂内静脉、髂外静脉的起止和收集范围。 6．肝门静脉系与上、下腔静脉系之间的交通途径。 了解： 1．静脉结构和配布特点； 2．髂总静脉、髂内静脉、髂外静脉的行程。 概述 （一）静脉结构和配布特点： 静脉是引导血液回心的血管，在向心汇集过程中，不断接受属支，特点如下： 1．腔大、壁薄、数量多。 2．有静脉瓣venous valve，可防止血液逆流。 3．有深、浅静脉之分，彼此互相交通。 4．吻合丰富，浅静脉相互吻合成网；深静脉相互吻合成丛；浅、深静脉通过交通支相互吻合。 一、肺循环的静脉 肺静脉pulmonary vein每侧两条，分别为左上、左下肺静脉和右上、右下肺静脉，起自肺门，经肺静脉口注入左心房。 二、体循环的静脉 体循环静脉是由上腔静脉系、下腔静脉系（包括肝门静脉系）和心静脉系（见心血管系统）组成。 （一）上腔静脉系 上腔静脉系是由上腔静脉及其属支组成，收集头颈部、上肢和胸部（心和肺除外）等上半身的静脉血。 1．头颈部静脉浅静脉包括面静脉、颞浅静脉、颈前静脉和颈外静脉，深静脉包括颅内静脉、颈内静脉和锁骨下静脉等。 （1）面静脉facial vein：与面动脉伴行。在口角平面以上通常无静脉瓣。与海绵窦、
练习18静脉、淋巴系
测试练习18 静脉、淋巴系统 一、名词解释 1.静脉角 2.乳糜池 3.静脉瓣 4.淋巴小结 二、填空题 1.上肢的浅静脉是临床上抽血或注射的常用部位，它们的名称是______、______、______。 2.大隐静脉起于______内侧，经内踝______，沿______和______内侧上行，在______下方注入______。 3.左睾丸静脉注入______，肾静脉注入______，肝静脉注入______。 4．当门静脉回流受阻时，主要通过_____与上腔静脉吻合；通过______与下腔静脉吻合；通过______网分别与上、下腔静脉吻合。 5．食管静脉丛可通过______流入门静脉，也可经过______和______流入上腔静脉。 6．直肠静脉丛可经______流入肠系膜下静脉，再经______流入门静脉；也可经______流入髂内静脉，再经______流入下腔静脉。 7．肝脏的1/4的血来自______动脉，3/4的血来自______静脉。 8．淋巴系包括______、______和______。 9．胸导管的起始部称______，向上经______入胸腔，最终注入______。它收纳的淋巴干有______、______、______、______、______、______。 10．右淋巴导管由______、______和______汇合而成，注入______。 11．腋淋巴结位于______，收集______、______、______、和______的淋巴。 12．颈内静脉起自颅底的______，至胸锁关节后方，与同侧的______汇合，两者所形成的夹角称______。 13．肝门静脉由______和______汇合而成，肠系膜下静脉往往直接注入______，肝门静脉收集腹腔内______的静脉血。 14．锁骨上淋巴结是______群的一部分，腹腔脏器的肿瘤，往往易转移至______，引起该淋巴结肿大。 15．腹腔成对脏器的淋巴回流入______干，不成对脏器的淋巴回流入______干，此三条淋巴干汇合成______，后者沿脊柱上行称为______，最终注入______。 三、单项选择题 1.不属于门静脉属支的是 A. 肠系膜上静脉 B. 脾静脉 C. 肝静脉 D. 肠系膜下静脉 E. 胃左静脉 2.有关大隐静脉的描述错误是 A. 起自足背静脉网 B. 行经内踝前方 C. 沿小腿内侧上行 D. 沿大腿内侧上行 E. 注入髂外静脉 3.胸导管通常注入 A. 左静脉角 B. 左头臂静脉 C. 上腔静脉 D. 奇静脉 E. 右静脉角
淋转试验
淋巴细胞转化试验 （一）原理： 四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。 （二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原 （三）方法： 2、淋巴细胞增殖反应：将5×105/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200ul/孔，每一份脾细胞悬液分装3n个孔，3（n-1）孔加ConA(5ug/mL)，另3个孔不加ConA作为对照。置5％CO2，37℃培养48-72h，在培养结束前4-6小时，于培养板各孔内加入5mg/ml MTT液，10ul/孔。37℃培养4-6小时。 4. 1000g 离心10分钟弃上清，各孔内加入150μl DMSO，溶解10min，30分钟内（或加2%SDS 100ul/孔，过夜。，或干燥后，各孔内加入0.01M盐酸—异丙醇100ul）用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。 实验结果将实验组和对照组三个复孔的OD值平均。转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。 注意事项（1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。（2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果
系统解剖学笔记之 淋巴
系统解剖学笔记之淋巴.txt爱情是彩色气球，无论颜色如何严厉，经不起针尖轻轻一刺。一流的爱人，既能让女人爱一辈子，又能一辈子爱一个女人！第十二章淋巴系统 第一节总论 淋巴系统由淋巴管道、淋巴组织和淋巴器官组成（图12-1）。淋巴沿淋巴管道和淋巴结的淋巴窦向心流动，最后流入静脉。因此，淋巴系统是心血管系统的辅助系统，协助静脉引流组织液。此外，淋巴器官和淋巴组织具有产生淋巴细胞，过滤淋巴和进行免疫应答的功能。 淋巴管道和淋巴结的淋巴窦内含有淋巴液，简称为淋巴。自小肠绒毛中的中央乳糜池至胸导管的淋巴管道中的淋巴因含乳糜微粒呈白色，其他部位的淋巴管道中的淋巴无色透明。血液流经毛细血管动脉端时，一些成分经毛细血管壁进入组织间隙，形成组织液。组织液与细胞进行物质交换后，大部分经毛细血管静脉端吸收入静脉，小部分水份和大分子物质进入毛细淋巴管，形成淋巴。 （一）淋巴管道 1．毛细淋巴管lymphatic capillary（图12-2）毛细淋巴管以膨大的盲端起始，互相吻合成毛细淋巴管网，然后汇入淋巴管。毛细淋巴管由很薄的内皮细胞构成，内皮细胞之间的间隙较大，基膜不完整。内皮细胞外面有纤维细丝牵拉，使毛细淋巴管处于扩张状态。因此，毛细淋巴管的通透性较大，蛋白质、细胞碎片、异物、细菌和肿瘤细胞等容易进入毛细淋巴管。上皮、角膜、晶状体、软骨、脑和脊髓等处无毛细淋巴管。 2．淋巴管lymphatic vessel 由毛细淋巴管吻合而成，管壁结构与静脉相似。淋巴管内有很多瓣膜，具有防止淋巴液逆流的功能。由于相邻两对瓣膜之间的淋巴管段扩张明显，淋巴管外观呈串珠状或藕节状。淋巴管分浅淋巴管和深淋巴管两类。浅淋巴管位于浅筋膜内，与浅静脉伴行。深淋巴管位于深筋膜深面，多与血管神经伴行。浅、深淋巴管之间存在丰富的交通。 3．淋巴干lymphatic trunk（图12-3）淋巴管注入淋巴结，由淋巴结发出的淋巴管在膈下和颈根部汇合成淋巴干。淋巴干包括腰干、支气管纵隔干、锁骨下干、颈干各2条和1条肠干，共9条。 4．淋巴导管lymphatic duct（图12-3）淋巴干汇合成两条淋巴导管，即胸导管和右淋巴导管，分别注入左、右静脉角。此外，少数淋巴管注入盆腔静脉、肾静脉、肾上腺静脉和下腔静脉。 （二）淋巴组织 淋巴组织分为弥散淋巴组织和淋巴小结两类。除淋巴器官外，消化、呼吸、泌尿和生殖管道以及皮肤等处含有丰富的淋巴组织，起着防御屏障的作用。 1．弥散淋巴组织主要位于消化道和呼吸道的粘膜固有层。 2．淋巴小结包括小肠粘膜固有层内的孤立淋巴滤泡和集合淋巴滤泡以及阑尾壁内的淋巴小结等。 （三）淋巴器官 淋巴器官包括淋巴结、胸腺、脾和扁桃体。 淋巴结lymph node（图12-4）为大小不一的圆形或椭圆形灰红色小体，一侧隆凸，另一侧凹陷，凹陷中央处为淋巴结门。与淋巴结凸侧相连的淋巴管称输入淋巴管，数目较多。淋巴结门有神经和血管出入，出淋巴结门的淋巴管称输出淋巴管。一个淋巴结的输出淋巴管可成为另一个淋巴结的输入淋巴管。淋巴结多成群分布，数目不恒定，青年人约有淋巴结400 ~ 450个。淋巴结按位置不同分为浅淋巴结和深淋巴结。浅淋巴结位于浅筋膜内，深淋巴结位于深筋膜深面。淋巴结多沿血管排列，位于关节屈侧和体腔的隐藏部位，如肘窝、腋窝、腘窝、腹股沟、脏器门和体腔大血管附近。淋巴结的主要功能是滤过淋巴、产生淋巴细胞和进行免疫应答。淋巴结内的淋巴窦是淋巴管道的一个组成部分，故淋巴结对于淋巴引流起着重
猪淋巴细胞转化实验
猪淋巴细胞转化实验 1.采集抗凝血每个10ml注射器吸入100ul肝素钠抗凝剂（20mg/ml），每个样品无菌采血5-8ml。（保存在4°环境，从猪场回来最好放在冰盒中） 2、淋巴细胞分离，采集的肝素抗凝外周血液（肝素用量20U/mL），可采用以下方法进行分离。 （1）Ficoll-Comray （聚蔗糖——泛影钠）分离淋巴细胞法： 用10毫升的试管，加入4毫升淋巴细胞分离液（比重介于1.0-1.090之间），在这种分层液的界面上，轻轻加入4毫升左右肝素化的血液，千万不要打乱两液间的液面。然后用1500rpm，离心15分钟。此时即可见到液体分为四层。最下层是红细胞和粒细胞，分层液在它的上层，最上层是血浆层。淋巴细胞在血浆层和分层液之间，淋巴细胞多时，可呈现一层乳白层。用移液器直接插入淋巴细胞分层液吸取淋巴细胞1.5mlEP管中，充分混匀，2000rpm离心10分钟，弃去上清，即获得纯淋巴细胞，可加入适量HanK’S液进行计数，应用浓度为1-2×106/mL，每份需用1毫升。 （2）红细胞裂解法 用10毫升的试管加入8ml的Tris-MH4C1红细胞裂解液，然后加入2-4ml抗凝血，室温放置20min（每各5min上下缓慢摇匀一次），后1500rpm离心10min，弃掉上清，用HanK’S液混悬细胞进行计数（如果红细胞很多，可以再用5ml裂解液裂解一次）。应用浓度为1-2×106/mL，每份需用1毫升。 3.流式细胞仪检测CD3/CD4/CD8步骤 待血液样品和灌注液样品都计数完毕后，吸取一定体积含有106的细胞悬液，1500rmp离心 3min，弃掉上清液，加入用PBS混匀的含有CD3/CD4/CD8混合抗体的反应液80ul，混匀后4℃反应30min。 待反应过后，1500rmp离心3min，用100ul移液器吸弃上清，然后加入0.5ml含有1-2%胎牛血清的PBS液，混合均匀，1500rmp离心3min，后用100ul移液器吸弃上清。 加入0.5ml含有4%多聚甲醛的PBS，4℃反应30min。 反应过后，1500rmp离心3min，用100ul移液器吸弃上清，然后加入0.5ml含有1-2%胎牛血清的PBS液，混合均匀，1500rmp离心3min，后用100ul移液器吸弃上清。 （最多4℃再用不含胎牛血清的PBS液洗涤一次，最后用200ulPBS液重悬细胞进行上机检测。 放置过夜） 4.MTT实验步骤 1）接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔100000个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul. 2:培养细胞：每个样品设置10个重复孔，其中5个孔加入10ul ConA(孔中终浓度5ug/ml),另外5个孔加入10ul培养液，同一般培养条件，培养68h，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS
血液系统讲义-淋巴系
第四章白细胞--淋巴系及其相关疾病 本章要点 1.掌握淋巴细胞的生成、构成和分布。 2.掌握淋巴细胞减少和增多的原因。 3.掌握淋巴细胞白血病的定义和诊断。 4.淋巴瘤分类、形态、免疫表型、分子遗传。 5.熟悉多发性骨髓瘤的定义、症状体征和实验室检查。 6.了解常用药物：糖皮质激素、甲氨蝶呤、巯嘌呤、门冬酰胺酶、环磷酰胺、 阿糖胞苷、阿霉素。 7.了解靶向治疗药物：美罗华、万柯。 8.了解淋巴细胞疾病的流式细胞术检查，原理和应用。 男性，16岁，发热，贫血，出血，肝、脾大，全血细胞减少，骨髓原始细胞占90%，过氧化物酶染色（-），非特异酯酶（-）。请问，该患者的可能诊断是什么？患者为什么出现全血细胞减少？如何进行进一步的诊断分层并开展精准治疗？ 第一节淋巴细胞 淋巴细胞是一种具有特异性免疫功能的细胞。淋巴细胞也称免疫细胞，在机体特异性免疫过程中起主要作用。所谓特异性免疫，是指淋巴细胞针对某一种特异性抗原，产生与之相对应的抗体或进行局部性细胞反应，以清除特异性抗原。淋巴细胞的主要功能包括参与体液免疫、细胞免疫和分泌淋巴因子。淋巴细胞主要包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞（Natural killer cell, NK）。T细胞产生于胸腺，主要在细胞介导的细胞毒性反应及迟发型超敏反应中发挥作用，T细胞还能产生调节免疫应答的细胞因子和辅助B细胞活化；B细胞能够凝聚并呈递抗原至T细胞，也是免疫球蛋白分泌型浆细胞的前体细胞；NK细胞主要负责自然免疫反应，是针对感染性病原体及移植抗原表达有所改变的转化细胞。
一、B淋巴细胞 1、B淋巴细胞的分化与发育 B淋巴细胞是由哺乳动物骨髓或鸟类法氏囊中淋巴样前体细胞分化成熟而来。哺乳类动物的B细胞在胚胎早期在胎肝，胚胎晚期至出生后则在骨髓内分化成熟。成熟的B细胞主要定居于周围淋巴组织，如淋巴结的皮质浅层的淋巴小结和脾脏红髓及白髓的淋巴小结内。在外周血中，B细胞约占淋巴细胞总数的10-20%。通常，B细胞是体内唯一能产生抗体的细胞，其特征性表面标志是膜表面免疫球蛋白（mIg），作为特异性B细胞抗原受体（BCR）的重要组成部分，通过识别不同抗原表位而使B细胞激活，分化为浆细胞，进而产生特异性抗体，发挥体液免疫功能。 早期B细胞分化和发育与骨髓造血微环境密切相关。B前提细胞在骨髓中必须经历选择过程，才能发育为成熟B细胞。B细胞分化的阶段可以分为在中枢免疫器官中的抗原非依赖期，和在外周免疫器官中的抗原依赖期。 （1）B细胞在中枢免疫器官—骨髓中的分化发育 骨髓多能造血干细胞（HSC）经多能前体细胞（MPP）分化为早期淋巴细胞前体（ELP），ELP分化为共同淋巴细胞前体（CLP），在骨髓中继续分化为祖B（pro-B）、前B细胞（pre-B），进一步分化为B细胞。B细胞的骨髓发育是抗原非依赖性的，可分为6个阶段，为早期祖B细胞（early pro-B cell）、晚期祖B细胞（late pro-B cell）、大前B细胞（large pre-B cell）、小前B细胞（small pre-B cell）、未成熟B细胞（immature B cell）和成熟初始B细胞（mature na?ve B cell）。 骨髓基质细胞（stromal cell）是B细胞发育的必要条件。首先，多能前体细胞（MPPs）表达受体酪氨酸激酶FLT3，与骨髓基质细胞表面的FLT 3配体相互作用传导信号，促使向共同淋巴细胞前体（CLP）分化；CLP通过黏附分子VLA-4与基质细胞表面VCAM-1相互紧密结合，又通过表达IL-7受体与基质细胞分泌的IL-7相互作用，促使向pro-B分化。同时，基质细胞分泌趋化因子SDF-1（CXCL12），有助于潴留CLP；在pro-B阶段，B细胞表面受体酪氨酸激酶Kit （CD117）与基质细胞表面干细胞因子SCF作用，诱导B细胞前体大量增殖，并向pre-B分化。
淋巴细胞功能测定
免疫学技术原理与应用 PAIT-12 淋巴细胞功能测定 孙汭 中国科技大学生命科学学院 免疫学研究所
PMIT-12 淋巴细胞功能测定 一、常用的淋巴细胞功能测定 二、T淋巴细胞功能测定 三、B淋巴细胞功能测定 四、NK细胞细胞毒试验 一、常用的淋巴细胞功能测定 1、淋巴细胞增殖试验 ① 3H-TdR掺入法 原理：淋巴细胞在丝裂原或特异性抗原刺激下转化为淋巴母细胞，发生转化过程中，细胞DNA合成大量增多。此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-Thymidine riboside, 3H-TdR), 使3H-TdR掺入新合成的DNA中，经β-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA 的3H-TdR掺入量，根据掺入细胞内的核素的量可判断淋巴细胞增殖的程度。 ② MTT比色法 原理：MTT（（3-4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑）是一种黄色可溶性噻唑盐，掺入细胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢过程，MTT代谢形成蓝色的甲攒（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。甲攒经异丙醇溶解后呈紫蓝色，借助酶标仪测定OD值，可反映细胞增殖水平。 2、细胞毒试验 ①51Cr释放法 原理：用放射性核素51Cr（Na251-CrO4，鉻酸钠）标记靶细胞，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合。然后将51Cr标记的靶细胞与待检细胞（效应细胞）共同孵育一定时间后，若待检细胞能够杀伤靶细胞，则51Cr从靶细胞释放出来。51Cr的释放量与效应细胞的活性成正相关。即靶细胞被杀伤的越多，释放到上清中的游离51Cr越多，用γ计数仪测定上清中51Cr的放射活性（cpm）值，以计算待检细胞的细胞毒活性。 （一）、用51Cr铬酸钠标记靶细胞 1．用RPMI-1640培养液洗涤107靶细胞，去上清液。用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入100μCi（3.7MBq）51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。 2．用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g 10分钟。用50ml RPMI-1640培养液悬浮细胞，置37℃水浴30分钟，以减少非特异的自然释放。 3．离心200×g 10分钟，去上清液。小心用RPMI-1640培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为0.5×105或1×105/ml备用。 （二）、4小时51Cr释放实验 1．在96孔圆底细胞培养板中加入51Cr标记的靶细胞，每孔加100μl。
混合淋巴细胞培养试验
混合淋巴细胞培养试验 文章目录*一、混合淋巴细胞培养试验的基本信息1. 定义2. 专科分类3. 检查分类4. 适用性别5. 是否空腹*二、混合淋巴细胞培养试验的正常值和临床意义1. 正常值2. 临床意义*三、混合淋巴细胞培养试验的检查过程及注意事项1. 检查过程2. 注意事项*四、混合淋巴细胞培养试验的相关疾病和症状1. 相关疾病2. 相关症状*五、混合淋巴细胞培养试验的不适宜人群和不良反应1. 不适宜人群2. 不良反应 混合淋巴细胞培养试验的基本信息 1、定义混合淋巴细胞培养试验(mixedlymphocyteculture,MLC)是一种测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容程度的试验方法,常用于器官移植前的组织配型。混合淋巴细胞培养将供者与受者的淋巴细胞做双向混合培养,或者灭活供者的淋巴细胞做向混合培养,细胞反应的程度与供-受者相容的程度呈负相关的试验。 2、专科分类生长发育检查 3、检查分类免疫检查 4、适用性别男女均适用
5、是否空腹非空腹 混合淋巴细胞培养试验的正常值和临床意义 1、正常值形态计数法: 转化率10%;同位素计数法:比较cpm 得出P0.05。 2、临床意义混合淋巴细胞培养试验为与供-受者相容的程度呈负相关的试验。异常结果:肾移植时,活体供肾者的转化率应10%;尸体供肾者的转化率应为10%。只能在同一批实验中选用低反应配组。淋巴细胞转化率10%者为不同两个体间的组织是相容的。淋巴细胞混合培养试验用以检测患者的免疫状态。T淋巴细胞数减少时,转化率也降低。可作为器官和骨髓移植的配型方法之一,用来选择合适的供体。如转化率高为供受者分歧用。转化率低,移植后的成功率高。 混合淋巴细胞培养试验的检查过程及注意事项 1、检查过程供体淋巴细胞的制备: 新鲜外周静脉血按1∶1比例加在装有比重为1.077的淋巴细胞分离液的离心管中,轻稳加在液面上。 2000 r/min离心20 min,吸取中间雾状淋巴细胞层。生理盐水洗涤2次。台盼蓝染色,计数板计数。调整细胞密度为2×109/L,分成3管,各自离
T淋巴细胞转化试验
T淋巴细胞转化试验 （T lynrphocyte transformation test） 正常机体的T淋巴细胞在体外培养过程中，受到特异性抗原或有丝分裂原（植物血凝素或刀豆素等）刺激，细胞的代谢和形态可发生一系列变化。主要表现为电荷的改变，细胞内蛋白质和核酸合成增加，及以细胞形态可转化为淋巴母细胞。为此，在体外利用各种刺激剂激发淋巴细胞，根据其转化程度可测定T淋巴细胞的应答功能。这类方法称为淋巴细胞转化试验（lymphocyte leansformstoin test）简称淋转试验，在临床上现已作为测定人体细胞免疫功能的指标之一。细胞免疫缺陷时，这种转化功能也降低。目前最常用植物血凝素（PHA）作为分裂原来检测淋巴细胞转化功能，称PHA刺激淋巴细胞转化试验。 体外引起T淋巴细胞转化的刺激物种类颇多，大致有以下几类： （1）非特异抗原刺激物，如从豆类中提了的植物血凝素（PHA）和刀豆素A（ConA）等，通称为促有丝分裂素（mitogen）。 （2）特异性抗原刺激物，如结核菌纯化蛋白衍生物（purifeg protein derivative 简称PPD）等。 （3）组织抗原和抗血清，如同种白细胞，抗淋巴细胞血清等。 上述各种刺激物中以PHA应用最广，在体外淋巴细胞培养中，可使正常人外周血液中T淋巴细胞几乎均起转化，其所引起的淋巴细胞转化率大大超过特异性抗原的作用。但这种反应与机体是否致敏无关，因此是属于非特异性的淋转试验。特异性抗原仅能使相应抗原致敏的淋巴细胞发生转化，转化率一般在5-30%左右。虽然T淋巴细胞对非特异性和特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，所发生的分裂和增殖反应却是相同的。因此根据PHA激活T淋巴细胞分列增殖反应的程度，可以推测T淋巴细胞识别特特异性抗原后的增植反应。从而利用PHA 刺激淋巴细胞转化试验一项非常特异性体外免疫学检测指标，在一定程度上可作为刺激原，因此一般称为PHA 淋巴细胞转化试验。 PHA淋转试验有形态计数法和同位素计数法两种，前者测定转化的淋巴母细胞百分率，后者测定放射性同位素标记的DNA前身掺入细胞合成DNA的量。 形态计数法的优点是不需要特殊设备，便于一般实验室采用，但判读结果主观因素影响较大，而且有相当数量的中等大小的淋巴细胞难于分类。此外，在培养过程中单核细胞相对增大，形成似转化的淋巴细胞，容易造成误计。加上此法的测定效率低，重现性较差，有被同位素掺入法取代的趋向，但要了解被激活淋巴细胞的比例和形态改变，则仍需应用形态观察法。 淋巴细胞转化试验的操作方法主要有两种： 1、形态学方法：加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细胞的百分数； 2、3H—胸腺嘧啶核苷掺入法：加分裂原共同培养结束前一定时间，加3H标记的胸腺嘧啶核苷，培养后测定镊入细胞内的放射性物质的相对数量，以间接了发转化程度。 形态学方法比较简单易行，不需特殊设备，但重复性和客观性较差；3H掺入法结果客观，准确性好，重复性好，但需要一定设备条件。 PHA淋转试验形态学检查法 一、目的： 1、了解本技术的原理。 2、掌握操作方法。 3、学会分辨几类细胞形态学上的特点。 二、原理： 将人外周血液或分离的白细胞和PHA混合进行体外培养数日后取培养细胞作涂片染色镜检，可见大部分淋巴细胞转化为体积较大的淋巴母细胞，细胞核内生成核仁，并有部分细胞发生分裂现象。由于PHA只激发T淋巴细胞转化，为此计数200个淋巴细胞，可计算出转化细胞的百分离，即得淋巴细胞转化率（简称转化率）。 在正常情况下，PHA淋巴细胞转化率为60-80%，50-60%则偏低，50%下则降低。 三、试验材料： 1、PHA溶液：PHA有粗制品两种。粗制品是含多糖的蛋白质成分，各为PHA-M。精制品为纯蛋白成分，名为PHA—P。国内虽有少数精制的PHA产品，但仍有待试剂标准化。 目前国内在临床检验中作淋转试验所用PHA一般均为粗制品，没有质量标准。原料来源不同，制备条件差异均可影响产品的活力。即使属于同一单位供应，各批产品的活力亦不相同。虽可参照说明书而决定其用量，按下述正式试验方法检测同一标本。如PHA加入量过多，对细胞有毒性；加入量少，不足以刺激淋巴细胞转化，一般最适浓度为50-200Ug/mL。 PHA粗制品亦可按下法自制：将广东红花云豆（Phaseolus Vulgaris）研磨成粉末，取10g粉末加生理盐水100ml，放置4℃冰箱浸泡48小时，每隔数小时稍加搅拌。取出后用滤纸过滤或在4℃离心（2，500转/分）30