水稻TOS17突变体库的创建与应用

1文献综述

1.1水稻基因组学研究现状

水稻全基因组测序

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮食作物之一，全世界有一半的人口食用它，水稻年总产量占世界粮食作物产量第三位，维持较多人口的生活。亚洲是世界水稻主产区，近年稻米产量占世界的90%以上，年产量占亚洲的38%。大米作为我国主要粮食种类，在养活我国13亿人口和改善我国居民营养结构中具有举足轻重的影响。同时，水稻又以其基因组相对较小(～430Mbp)，高效的遗传转化体系，与玉米、大麦和小麦等其它禾本科作物在基因组上存在明显的共线性，而成为研究单子叶植物的模式植物。

国际水稻基因组计划(IRGSP)启动于1998年，以粳稻品种(japonica)日本晴(Nipponbare)为模式材料，由中国、日本、美国等是十个国家参与，所采用的方法为逐步克隆策略(clone by clone sequencing)，随后在2002年由日本和中国科学家率先公布了第1、4染色体的精确序列(Feng et al., 2002; Sasaki et al., 2002; Consortium 2003)；2003年9月第10条染色体的全长序列由美国Clemson大学公布(Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium, 2003)。2005年8月水稻全基因组精确序列在Nature发表(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。IRGSP公布的水稻“日本晴”精确序列经过分析表明：(1) 水稻“日本晴”基因组大小为389Mb，IRGSP公布的序列能够覆盖其全基因组的95%，并包含了所有的常染色质和两个完整的着丝粒；(2) 整个基因组中包含大约37544个非转座相关基因，其中71%的基因可能在拟南芥中有同源基因；(3)通过与拟南芥基因组序列对比分析发现，拟南芥90%的基因在水稻中可能存在同源物；(4) 水稻中预测的37544个基因中，29%是属于成簇的基因家族；(5) 水稻基因组中转座元件的数目和种类与玉米和高粱基因组共线性区段的扩张是一致的；(6) 有证据证明基因能从细胞器中转移到细胞核(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。

另外的一些科学研究部门和公司也分别启动了各自的水稻测序计划。如华大基因在2005年宣布完成籼稻品种“93-11”的全基因组序列测序，其所采用的方法为鸟枪法。Syngenta公司也于2002年宣布完成了粳稻品种“日本晴”的全基

因组序列测序。

随着目前水稻基因组已测序完成，以及构建了水稻高密度的遗传图谱和高质量的物理图谱(Chen et al., 2002)。同时获得了超过25万条来源于水稻不同组织的ESTs及28000条全长cDNA序列(Kikuchi et al., 2003)。人们对有益基因的定位、克隆、转移和聚合越来越关注。因此，可以说对水稻生命科学的研究步入到后基因组时代即对基因功能大规模研究的时代(Jeon et al., 2000)，其核心内容是植物功能基因组学。因此，接下来的任务就是利用水稻功能基因组学，诠释全基因组测序所获得的遗传信息，分析基因的功能。

基于突变体的水稻功能基因组研究

目前来讲克隆分析基因最有效的方法，就是利用突变体来研究分析基因的功能。其基本原理是通过破坏植物基因内部或邻近位点，造成基因的突变。然后再利用各种方法分离被破坏的基因。目前构建饱和的基因突变群体，通过突变体分析鉴定基因已经成为最直接最有效的方法。在水稻测序完成之前，植物学家利用一些自然产生的突变体及利用物理和化学等方法产生的突变体，克隆了一些控制水稻重要农艺性状的基因(Yoshimura et al., 1996; Yoshimura et al., 1998; Yano et al., 2000)，但自然界自发产生的突变很少，频率仅有10-5。所以目前有很多的方法通过人为的手段提高突变频率，满足与构建大规模饱和突变题库的需要。目前大规模构建突变体库的主要的方法有：物理和化学诱变法，T-DNA、转座子及反转绿转座子插入突变等。

物理和化学诱变

物理和化学诱变主要是利用一些物理和化学的手段如快中子(Fast neutron)、伽玛射线(Gamma ray)、双环氧丁二烯(Diepoxybutane, DEB)、甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS) 等方法处理种子，然后通过播种处理的种子来筛选突变表型。快中子轰击法是物理方法中被认为是非常有效的一种方法，快中子轰击往往导致基因组片段的缺失。而以EMS诱导为代表的化学诱变的方法，往往导致DNA中的碱基转换，如G到A的转换。物理和化学诱变的方法非常简单，快速和经济且不存在组织培养或遗传转化汇总基因型的限制，被广泛应用于大型突变体库的创建，如Li等(2001)利用Deletegene系统，在水稻中构建了含24,660个快中子轰击群体，筛选到5个基因位点，得到一个位点发生缺失的突变体。而使用EMS作为化学诱变剂同样也可以得到遗传稳定的点突变体，而且已经被广泛

用于水稻等植物诱变育种。但是物理和化学的方法处理得到突变体，只能通过图位克隆的方法克隆基因，需要构建庞大的克隆群体，精细的遗传图谱，费时费力，无法适应大规模筛选鉴定突变体的要求。

构建插入突变体库

利用T-DNA、转座子和反转录转座子等插入元件，通过插入元件插入到植物基因组中，是植物基因不能正常的转录和翻译，达到破坏基因的效应产生突变体，而且可以通过插入元件很容易找到被插入元件的位点，目前构建插入突变体是最有效的构建大规模饱和突变体库的方法。

元件的插入效应是多样的。Krysan等(1999)探讨了元件插入到植物基因组中后引起的靶位点基因功能的变化的几种情况：当插入元件插入到靶位点基因的编码区或启动子区就有可能使被插入的基因功能完全敲除，产生功能缺失性的突变体，即无义突变(null mutant)；当插入到启动子或3’端的非翻译区就有可能使靶位点基因表达量下降；当元件接上一个35S的启动子的时候，插入到基因的启动子区域，就可以使基因表达量上升；当插入基因编码区时，还有可能无法看到表型的缺失，因为高等植物中存在大量基因冗余的现象，突变基因的功能被其它同家族的基因补偿；在植物基因组内部存在多个拷贝的元件插入是，有可能多个基因被同时敲除掉，使多个基因同时失活；元件的插入还有可能导致插入位点附近的染色体重排的现象，本实验室张健同学的一个突变体就是由于插入位点附件的染色体重排，而引起植物出现一个不育的突变表型（私下交流）。

图1.植物基因组中中由T-DNA插入引起靶基因表达的不同效应（Kryson et al，1999）

Fig1. The insertion of a T-DNA into a plant genome chromosome can lead to many different outcomes

T-DNA(Transferred DNA)是农杆菌(Agrobacterium)的Ti质粒(Tumor-inducing Plasmid)上一段DNA序列，它可以从农杆菌中转移并稳定的整合到植物核基因组当中。农杆菌介导的T-DNA转化技术已被广泛的应用于构建拟南芥和水稻的插入失活突变体库(Azpiroz-Leehan and Feldmann, 1997)。如在拟南芥中已经建立饱和的插入突变体库(Alonso et al., 2003)。随着水稻粳稻的高效遗传转化体系的建立(Hiei Y et al., 1994)，水稻中的T-DNA插入突变体库开始大量建立如本室已经建立了超过120,000个含有T-DNA标签的独立的转化子，平均每个突变体含有约为个T-DNA拷贝，并且能稳定遗传(Wu et al., 2003)，并且通过对突变体的筛选，克隆到了一系列的重要基因如RID1(Wu et al., 2008)。而其它的一些研究机构也纷纷建立了大型的T-DNA插入突变体库，如韩国的POSTECH研究所，法国的Genoplant研究所。T-DNA在拟南芥中的插入被认为是一个随机的过程(Sallaud et al., 2004)，而在水稻中的插入则存在热点，如比较倾向于插入水稻中较大的染色体，倾向于插入远离着丝粒的区域，倾向于插入基因区，在基因的间隔区插入比较均一，倾向于插入基因编码区(Zhang et al., 2007)。而且T-DNA插

入也有一些缺点如：可能会引起插入位点的重排、插入过程中T-DNA的边界序列容易缺失，并且组织培养容易激活其它元件如Tos17。

Tos17是水稻中的一个内源性的反转录转座子，全长4114bp，在栽培稻中含有1-5个拷贝(Cheng et al., 2006)，并且在日本晴中有两个原始拷贝，一个位于第7染色体上，具有转座子活性，另一个位于第10染色体上，没有转座子活性活性，而现在认为第10染色体上一段20bp的碱基缺失，造成其转座活性的缺失。Hirochika 等(1996)在1996年发现了15个水稻品种“日本晴”中的反转录转座子，其中Tos10，Tos17，Tos19在组培的条件下被激活，经过详细研究后发现Tos17具有以下特点：在组培的条件下激活，分化成植株后失活，因此Tos17插入引起的突变可以稳定遗传；的拷贝数随着组培的时间而增多，经5个月的组培后，可平均产生10个拷贝，可以通过组培时间的长短来控制转座的拷贝数；3.突变体产生过程不涉及转基因。是水稻内源性的反转录转座子，因此在插入植物基因组内部时，一般不会产生片段的缺失和改变，而且相对于T-DNA，Tos17突变体的侧翼序列的分离相对容易。因此Hirochika认为Tos17很适合用来构建插入突变体库。并构建了超过50,000个独立的再生植株，大约含有500,000个插入位点，并对M2代突变产生的表型进行了详细的分类(Miyao et al., 2003; 2007)，发现后代中大约50%的家系出现至少一个突变表型，在田间出现最多的表型是不育和矮化。但是Tos17突变体库也有一些缺点如其插入的拷贝数多，对以后的遗传分析不利；其产生的突变体只有10%是真正由Tos17的插入引起的，其余的突变体是在组培的情况下或是由其它的未知的转座子专座产生的。

Miyao等(2003)通过大量的Tos17的插入位点的分析发现，Tos17在水稻中的插入事件并不是一个随机的过程，存在热点，Tos17偏向于插入水稻中的较大的染色体，且插入密度和染色体大小高度相关。在染色体两端分布较多，在着丝粒附近和染色体中部分部较少。偏向于插入基因区，而极度不偏向插入转座子相关基因和基因间隔区以及基因调控区。偏爱于插入基因的编码区。并且偏爱于“Motor”, “Signal transducer”, “Transcription regulator” “Transporter”等4类功能基因（Miyao et al., 2003; Piffanelli et al., 2007），因此利用Tos17比较容易获得饱和突变体库。

Ac/Ds转座子是McClintock于1948年在玉米中发现的。Ac是具有自主转座活性的元件，Ds是没有自主转座活性，需要Ac元件提供转座酶。因为Ac元件具有自

主转座活性，因此产生的突变遗传不稳定，不利于基因的分析，而Ds元件本身没有转座活性。因此人们提出了双组分系统。将Ac和Ds分别导入不同的植株，Ac经过了改造只能提供转座酶而无法转座，通过杂交的方法，将Ac元件导入含有单拷贝Ds的植株中，使Ds元件转座，然后再自交筛选不含Ac元件的后代。从理论上讲Ac/Ds元件是最理想的水稻插入突变体构建体系。产生的突变体通常是Ds元件的单拷贝的插入，大大方便了突变体表型的分析和基因的鉴定；Ds可以在导入转座酶的情况下重新转座，验证突变是由Ds的插入引起的；Ac/Ds双因子系统可用于转基因效率较低的籼稻品种，因为突变体是从Ac转座酶株系和Ds植株的有性杂交后代中筛选的，不需要大量的转基因工作；但是Ac驱动下的Ds可能发生的多次跳动所形成的痕迹(footprint)也可能影响突变表型的分析。

构建Gene Trap突变体

利用插入元件构建插入突变体同样存在一定的缺点，如：插入元件插入到一些植物生长发育的关键基因时，往往会导致插入致死；而且植物基因组存在大量是功能冗余的基因，敲除掉一个基因并不能产生表型的变化。针对这些情况人们通过对T-DNA进行一定的修饰，利用不同的原理进行基因功能研究。

Gene trap系统是基于报告基因的表达模式而研究外源DNA插入位点基因的表达及其功能的方法(Campisi et al., 1999; Jeon et al., 2000)，主要有三种类型：Enhancer trap，Gene trap和Promoter trap。在Enhancer trap 中，报告基因连接了一个小型的弱启动子，这个启动子通常包含一个TATA box 和一个转录启始位点，它并不能独立启动报告基因的表达，但是可以被邻近的增强子所激活。Promoter trap 和gene trap的报告基因不含启动子，因此只有当插入位点在转录单位内部并且位于正确的起始位点时报告基因才能表达。Promoter trap的报告基因的表达要求它插入到一个外显子中，从而形成一个可以转录的融合基因。Gene trap 中的报告基因安装了一个或几个剪接受点，因此即使报告基因插入到内含子中也能得到表达。相比而言，Enhancer trap中报告基因表达不像Gene trap和Promoter trap那样需正确方向插入，所以报告基因表达频率相对要高。但Enhancer trap存在远距离激活基因表达，不如Gene trap和Promoter trap容易鉴定和分离基因。本室已利用修饰的酵母转录因子GAL4/VP16成功地构建了水稻的Enhancer trap系，并且检测到报告基因GUS在各种组织中的表达率为25-59%(Wu

et al., 2003)。Ito等(2002)利用Ac/Ds 系统构建了水稻的Enhancer trap系，同时检测到10%的报告基因在各种器官的表达。

图2. Enhancer trap, Gene tarp和Promoter trap 载体结构示意图(Springer，2000)

Fig2. Structure of enhancer, gene and promoter trap vectors

构建Activation tagging突变体

拟南芥和水稻测序完成后，拟南芥大约有三分之二的基因组是由染色体的大片段复制而来的，而且，大约由4000个基因是串联重复成两个或多个拷贝(Arabidopsis Genome Initiative, 2000)。在水稻不同的染色体上，其基因的重复比例约为et al., 2002)。因此T-DNA或转座子插入到这些基因内很可能得不到相应的表型。为了研究这类基因的功能，植物学家将T-DNA的边界构建了多个CaMV 调节序列35S Enhancers和Promotors，来启动相邻基因的表达而得到功能获得性突变体(Hayashi et al., 1992; Suzuki et al., 2001)。一般认为，Activation tagging产生的突变体为显性或半显性的。这种基因的激活会引起一些新的表型，因此无论是功能冗余基因还是发育相关基因都能够通过表型来鉴定。目前，在水稻和拟南芥中都已经建立了Activation tagging的突变体库(Weigel et al., 2000; Jeong et al., 2002)，Zubko等(2002)用这种策略在矮牵牛中分离了与细胞色素合成相关的Sho

基因。拟南芥中也用该方法克隆了一些基因(Kakimoto et al., 1996; Kardailsky et al., 1999; Ito and Meyerowitz, 2000; Vander et al., 2000; Huang et al., 2001; Zhao et al., 2001)。

Fox-hunting突变体也是将基因超表达，从而获得显性和半显性突变体的一种方法。其原理是将全长cDNA，连接到含有强启动子的T-DNA载体上，从而使基因超量表达。Nakamura(2007)收集了水稻中的13980条独立的全长cDNA，在玉米的Ubiquitin-1的启动子下超量表达。得到了超过12000个独立的转化株系。大约%的株系出现了突变表型，并且从中克隆一个新的赤霉素-2-氧化酶。

. 4 突变表型的筛选

功能基因组的研究方法很多，归纳起来分为两类：一类，即正向遗传学(Forward genetics)，从一个突变体的表型开始，研究其基因是什么；反向遗传学(Reverse genetics)，从一个突变体的序列开始，研究引起什么样的表型的改变。. 正向遗传学筛选

插入突变体库构建完成后，就可以利用正向遗传学和反向遗传学进行基因的鉴定，而正向的突变体的筛选是一件很费时费力的事。Tos17是目前应用最为成功的反转录转座子，但多拷贝的插入是突变体的表型鉴定和分子鉴定较为困难，且只有10%左右的突变是真正由Tos17的转座产生的。Hirochika（2007）对其超过50,000份的Tos17突变体进行了大规模的表型筛选，将其突变表型分为53个大类。

反向遗传学筛选

利用反向遗传学筛选方法主要包括两种：一种是建立大型的侧翼序列信息库；一种是根据已知基因的保守序列设计一条基因特异引物，同对应的插入元件边界的特异引物组合扩增，如果外源片段插入到了目标基因内就应该可以得到PCR的扩增产物。该方法首先是在果蝇中应用，后来大范围的应用到各种生物中(Krysan et al., 1999)。现在主要是利用三维或二维的DNA混合池的方法来进行PCR筛选。如Kaneko等(2004)利用在大麦糊粉层细胞中分离的转录因子(GAMYB)的保守引物设计引物，筛Tos17突变体的DNA混合池，成功的分离到了在水稻中同源的GAMYB基因。

水稻插入突变体的侧翼序列的分离方法

热循环不对称PCR(Themal Asymmetric Interlaced PCR，简称Tail-PCR)

TAIL-PCR又叫巢式PCR，是目前比较流行的分离侧翼序列的方法。由

Liu(1995)等首先报道使用，其原理是通过利用三条嵌套配对的能与插入元件特异配对的引物，和1条具有低Tm值的短的随机简并引物(Arbitary degenerate primer，简称AD)相组合，根据引物的长短和特异性差异，设计不对称的热循环，通过分级反应来选择性的扩增特异片段。目前日本NIAS研究所的Tos17突变体库和本室的水稻T-DNA突变体库都采用了TAIL-PCR技术来分离侧翼序列

TAIL-PCR有很多优点，它通过PCR反应来分离侧翼序列，操作简单快捷，灵敏度高，不需要经过酶切反应，对模板质量要求不高，并且产物的特异性高，扩增效率好(Liu and Whittier，1995)。但是，由于TAIL-PCR使用的是AD引物和复杂的反应条件，因此其产物容易产生公共带，而且测序效率不稳定。

反向PCR

1988年，Ochman研究组和Triglia研究小组首先报道了反向PCR技术(Triglia., 1998；Ochman et al., 1988)。反向PCR的原理是：用限制性内切酶酶切模板DNA，然后用DNA连接酶将酶切产物连接成环状DNA分子，再用转座元件载体序列左右边界上的一对PCR引物进行扩增，即可获得插入元件位点附近的基因组序列。而且为了提高扩增产物的特异性，往往还要利用另外一对左右边界的嵌套引物，来进行第二轮扩增，以提高产物的特异性。反向PCR的优点是：它利用两条可以和插入元件特异匹配的引物进行PCR扩增，不易产生非特异性扩增，并且操作简单，可以进行批量大规模的分离侧翼序列。但是其涉及酶切和连接反应，因此对模板的质量要求比较高，相对于TAIL-PCR反应时间也长。而且如果插入位点附件没有或酶切位点离插入位点过长，都无法将侧翼序列扩出。因此对于限制性内切酶的选择十分重要。韩国POSTECH研究所的T-DNA插入突变体库分离侧翼序列的方法就采用了反向PCR的方法，而且本实验室在分离T-DNA侧翼序列时也采用了反向PCR的方法。

图3. Tail-PCR扩增流程示意图(Liu and Whittier 1995)

Fig 3. Schematic diagram of TAIL-PCR controlling the amplification of

target fragment)

接头PCR (ADAPTER LIGATION-MEDIATED PCR,简称接头PCR)

1990年，Rosenthal等首先报道了一种新的分离侧翼序列的方法—接头PCR(Rosenthal and Jones 1990)。由于接头PCR不稳定而且容易产生非特异性扩

增，所以研究者对其进行了一系列的改进(Lagerstrom et al., 1991; Nthangeni et al., 2005)。目前比较成熟的接头PCR的原理为：首先用能够产生粘性末端的限制性内切酶酶切基因组DNA，然后用DNA连接酶在酶切产物的两端加上能和粘性末端特异结合的接头。接头(Ligate adapters)是由一长一短两条链组成。首先利用可以和转座元件特异匹配的一条引物，做单边扩增，补平接头的“缺口”。然后利用一条特异和短链“缺口”处匹配的特异引物，一条特异和转座元件载体序列特异匹配的引物，进行PCR扩增，将插入位点附近的基因组序列扩增出。有时为了提高产物的特异性，也可以利用第二对巢式引物，进行第二轮扩增(Ronan et al., 2007)。接头PCR以其稳定，高效的特点，被广泛用于侧翼序列的分离。

图5. 接头PCR扩增示意图(Ronan et al., 2007)

Fig 5. The procedure of adapter ligation-mediated PCR.

水稻突变体库现状

目前在水稻中已经构建了超过了2,000,000独立的水稻插入突变体，分离侧翼序列数目超过200,000条。并且建立了很多水稻侧翼序列数据库，通过数据库的检索可以很容易的检索到目的基因的突变体并进行基因克隆。如韩国

POSTECH研究所分离到84,680条水稻T-DNA插入突变体的侧翼序列，收录于RISD数据库中，日本的NIAS研究所分离到34,844条水稻Tos17侧翼序列，收录于数据库中，武汉华中农业大学国家植物基因研究中心分离到了16,158条水稻T-DNA侧翼序列，收录于RMD中，除此之外，我国上海植物生理生态研究所，我国台湾地区的IPMB研究所，澳大利亚的CSIRO研究所，法国的Genoplanter 研究所，美国的UCDavis大学等研究机构都在开展水稻突变体侧翼序列的分离工作，详细的侧翼序列信息如表1所示。

表1. 水稻突变体资源和侧翼序列数据库(Krishnan et al., 2009) Table 1. Rice mutant resources and flanking sequence databases

Institution Genotype Mutagen Mutated

Loci FSTs/Screen FSTLines

Availability

Database Web Site Contact

CIRAD-INRA-I RD-CNRS,

Génoplante, FR Nipponbare T-DNA ET

Tos17

45,000

100,000

14,137

13,745

17,414 11,488

(March 2009)

Guiderdoni

CSIRO Plant Industry, AU Nipponbare Ac-Ds GT/ET16,000611Approximately 50%

lines no seed

Upadhyaya

EU-OSTID, EU Nipponbare Ac-Ds ET25,0001,3801,300Guiderdoni

IRRI, PH IR64Fast neutron

γ-ray DEB,

EMS 500,000Deletion

database:

400 genes

Selected lines Leung

Gyeongsang National University, KR Dongjin

Byeo

Ac-Ds GT30,0004,8204,820KRDD Han

NIAS, JP Nipponbare Tos17500,00034,84434,844Hirochika

NIAS, JP Nipponbareγ-ray ion beam15,000 M2

7,000 M2

DNA pools Selected lines M. Nishimura

POSTECH, KR Dongjin,

Hwayoung T-DNA ET/AT

Tos17

150,000

400,000

84,68058,943RISD An

13

HuazhongAgricul tural University, CN Zhonghua 11

Zhonghua 15

Nipponbare

T-DNA ET113,262

14,197 1,101

16,15826,000 Dec. 2008RMD Zhang

SIPP, CN Zhonghua 11T-DNA ET97,5008,8408,840 FST + 11,000

lines

Fu

Temasek

Lifesciences, SG

Nipponbare Ac-Ds GT20,0003,5002,000R. Srinivasan

IPMB, Academia

Sinica, TW

Tainung 67T-DNA A T30,00018,38231,000TRIM Hsing

University of California, Davis Nipponbare Ac-Ds GT

Spm/dSpm

20,000Ds 4,735

dSpm 9,469

4,630 9,036Sundaresan

University of California, Davis Nipponbare Sodium azide

+ MNU

6,000TILLING

screen

Selected lines Comai

Zhejiang University, CN Nipponbare

Zhonghua 11

T-DNA1,0091,009Wu

Zhejiang University, CN Kasalath

SSBM

γ-ray EMS40,000Selected lines Wu

14

2.本研究的目的和意义

本研究在通过在水稻粳稻品种中花11为材料构建Tos17插入突变体库，运用接头PCR的方法分离Tos17插入侧翼序列，筛选后代突变体观察突变表型并且进行共分离的验证。本研究的目的和意义在于：1) 构建水稻中花11 Tos17插入突变体库，分离侧翼序列，为水稻突变体的正反向遗传学研究搭建平台。2) 通过侧翼序列的生物学分析，研究Tos17插入位点的特征。3) 对突变体后代进行表型和基因型的共分离鉴定，为克隆水稻基因提供材料。4) 与我室T-DNA插入突变体库形成互补，研究我室T-DNA插入突变体库中的Tos17转座情况。

3材料和方法

材料

植物材料

材料为水稻粳稻品种中花11号，由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供。

试剂

限制性内切酶、外切酶、rTaq、DNA连接酶，组培所用试剂均由Takara公司提供。

PCR引物由英杰公司合成。

其余试剂均为国产分析纯

方法

T0代植株的创建

将野生型中花11种子脱壳，干燥-20℃保存。

将野生型中花11种子，于75%酒精中消毒15min，10%HgCl2消毒30min，转移到诱导培养基中。待30天后愈伤长出，为防止产生的后代Tos17突变体之间有相同的突变位点，所以每一颗种子诱导出的愈伤仅取一颗转移到继代培养基中，继代培养3个月，每30天更换培养基一次。共计诱导种子32000颗，产生愈伤25365颗。将经过3个月继代培养的愈伤转移到分化培养基中，分化产生T0代突变植株。每一个愈伤上诱导出的植株只取一株，夏季种于武汉华中农业大学试验田，共计产生T0代Tos17突变体15,543株。培养基配方见林拥军博士论文。

3.2.2DNA抽提小样（CTAB法）

本研究中共分离检测所用样品DNA使用CTAB小样法抽提。取3cm左右长的新鲜水稻叶片，在800μl×CTAB中研碎，56℃水浴30min，上下颠倒数次，加入600μl氯仿：异戊醇（体积比24：1），摇30min，11,500rpm室温离心10

分钟，吸上清450μl，加入2倍体积预冷的95%乙醇，-20℃冰箱中20min以上，12，000rpm离心15min；倒掉上清，用75%乙醇浸洗沉淀，自然风干，DNA沉淀溶于100μl无菌水中。

侧翼序列用DNA样品分离（CTAB法）

取水稻新鲜叶片叶尖(3cm)3-4片，在-20℃预冷的研钵中磨至粉末状转入预冷的2ml离心管中，加入约半管。每管加入600μl 2% CTAB混合液（2% CTAB、NaCl，20mM EDTA、100mM Tris-HCl、15μl RNA酶、%β-巯基乙醇），上下颠倒摇匀，于65℃水浴锅中水浴15min，11,000rpm 离心5min，吸上清约500μl。加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下颠倒轻摇5min。11，000rpm离心5min，吸上清400μl。加入异丙醇400μl，上下颠倒轻摇沉淀DNA。离心5000rpm，30sec 沉淀DNA，丢弃上清。加入500μl 75%乙醇，洗沉淀，离心10s，弃上清，自然风干，DNA沉淀溶于50μl无菌水中。

Tos17插入植株的侧翼序列的分离

本室采用接头PCR的方法分离侧翼序列，所用引物见表2

接头(AD)制备方法：等体积混合引物AD-L (100mM)和引物AD-S (100mM)，

最终反应浓度为50mM，在95%水浴锅中水浴10min，自然冷却至室温。具体的反应步骤和反应程序如下：

第一步：模板DNA的酶切和连接。体系：取用分离侧翼序列用CTAB法分离的模板DNA样品1μl，接头(50mM) μl，10×M buffer 1μl，10×T4 DNA连接酶buffer 1μl，Dra? (15U/μl) μl, T4 DNA 连接酶(10U/μl) μl，补ddH2O水到10μl。反应置于25℃（室温）反应约16-20h。

第二步：PCR反应第一步。第一步反应产物1μl，10×PCR buffer 2μl，2mM dNTPs μl 25mM MgCl2μl，ADS-1(50mM) μl,

3’端或5’端特异引物（TRB1或TosRP2），rTaq DNA polymerase（Takara 公司）μl, 补充ddH2O到20μl。反应程序：94℃4min；94℃30sec，72℃3min，7cycles；94℃30sec，67℃3min，32cycles；67℃7min；25℃10sec。

第三步：PCR反应第二步。第一步PCR反应产物1μl，10×PCR buffer 2μl，2mM dNTPs μl，25mM MgCl2μl, ADS-2(50mM) μl, 3’端或5’端特异引物（TRB2或TosRP3），rTaq DNA polymerase（Takara 公司）μl, 补充ddH2O到20μl。反应程序：94℃4min；94℃30sec，72℃3min，5cycles；94℃30sec，67℃3min，35cycles；67℃7min；25℃10sec。

表2. 接头PCR所用引物及其用途

Tab primer sequences used for Adapter-PCR.

Primer Usage Sequence(5’-3’)

AD-L 接头CTAATACGAGTCACTATAGCGCTCGAGCGGCCGCCGGGGAGGT

AD-S 接头P-ACCTCCCC-NH2

ADS-1 接头特异引物PCR1:GGATCCTAATACGAGTCACTATAGCGC

ADS-2 接头特异引物PCR2: CTA TAGCGCTCGAGCGGC

TosRP 2 Tos17左端引物PCR1: TACAAGTCGCTGATTTCTTCACCAAGGC

TosRP3 Tos17左端引物PCR2: CGGTTACATCTTCTCAAACTCAATGTGGTAGA

TRB1 Tos17右端引物PCR1: GCATCTTTCACACGTTCTCATTGTCAG

TRB2 Tos17右端引物PCR2: CGGTTACATCTTCTCAAACTCAATGTG

接头PCR产物的测序：取5μl第二步反应产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳，选取大于250bp的产物，采用酶消化法对PCR产物进行纯化：PCR产物5μl，10×PCR buffer μl，25mM MgCl2 μl，SAP(2U/μl，Takara) μl，Exonuclease ? (20 U/μl，New England Biolabs) μl，加ddH2O至8μl，37℃1hr，80℃水浴10min。纯化产物送到上海国家基因研究中心测序。测序采用双脱氧链末端终止法，所以试剂为BigDye Terminator Cycle Sequence (Applied Biosystems，CA，USA)。测序仪型号为ABI3730xl (Applied Biosystems, CA, USA)。

DNA抽提大样(CTAB)

取水稻新鲜叶片3-4片，迅速放到冰中，带回实验室-20℃保存。将叶片在-20℃预冷的研钵中，用液氮磨至粉末状，转入10ml离心管中。在离心管中加入预热至95℃的×CTAB 15-20ml，上下颠倒混匀，于56℃水浴锅中水浴30min。每管加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，手摇30-45min至溶液上下分三层。4000 rpm 离心20min，倒出上清液至另外一离心管中，每管加已预热(56℃)的10×CTAB 约2ml，再加一倍体积的氯仿：异戊醇(24：1)。轻摇约30min。常温，4000rpm 离心20min，吸出上清400ml，加等体积的1×CTAB, 旋转20下左右，即可见絮状DNA。5000rpm离心30sec，倒去上清，加入500μl的Nacl (1mol/l)和1μl 的RNA酶(1mg/L)，56℃水浴溶解DNA，DNA经预冷的95%乙醇沉淀，75%乙醇清洗，微干后溶解在ddH2O中备用。

Southern杂交

取用DNA抽提大样法抽提的样品的DNA5μg，用Xba?酶切过夜，跑1%TAE 凝胶电泳，然后转移到尼龙膜上，详细操作步骤参照张健博士毕业论文（张健，2007）；杂交探针长度为600bp，杂交探针引物为：TosL：5'-GCT ACCCGTTCTTG GACTAT-3'；TosR：5'-CTGAAATCGGAGCACTGACA-3'；探针合成PCR反应体系：野生型中花11样品DNA5ng，10×PCR Buffer 2μl，2mmol/L dNTP μl, 10μmol/L引物μl, 10U/μl Taq酶μl。PCR反应程序：94℃5min；94℃45sec，55℃45sec，72℃，1min，30cycles；72℃，7min；25℃30sec；

T1代表型筛选

2009年4月在华中农业大学实验田播种Tos17突变体T1代家系1,883个，5月20日，每个家系以×的密度随机取20株移栽大田，分苗期，分蘖期，临近抽穗期，成熟期四个时期观察表型。记载产生突变的家系的编号，并且对突变表型拍照。

T1共分离检测

根据侧翼序列的信息在Tiger (上检索，确定Tos17插入的位点，根据插入位点附近的侧翼序列信息，利用Premier5设计引物，通过PCR反应验证插入位点是否正确。具体原理如下：在插入位点两端设计特异引物，通过两条能和基因组特异匹配的引物以及一条能和Tos17特异匹配的引物和一条基因组特异匹配的引物配对扩增来确定插入位点是否正确。如果Tos17在该位点插入是纯合的，那么用一条基因组特异匹配的引物和一条能和Tos17特异匹配的引物来配对扩增时，能够得到目的条带。但是由于Tos17的插入，使两条基因组之间的距离变大，当使用两条基因组引物来配对扩增时就不能得到目的条带；如果Tos17在该位点的插入是杂合的，则用两条特异和基因组匹配的引物配对以及一条特异和基因组匹配的引物和一条和Tos17特异匹配的引物配对扩增，都能扩增出目的条带。从而很容易验证后代植株的基因型，通过基因型与后代植株突变表型的之间的是否符合，来判断后代植株的突变表型是否与该位点的插入共分离。PCR反应在

ABI9700PCR仪(Applied Biosystem)上进行，反应体系如下：模板DNA 5ng，10×PCR Buffer 2μl，2mmol/L dNTP μl, 10μmol/L引物μl, 10U/μl Taq酶μl。PCR反应程序：94℃5min；94℃45sec，55℃45sec，72℃，1min，30cycles；72℃，7min；

25℃30sec；

表3 共分离检测引物

Tab 3. The primer used for co-segregation analysis.

Primer Sequence(5’-3’) Primer Sequence(5’-3’)

AD56L TACTGTCCCCAAATCCAAA AH77L GAATAAGGGCAGCGAATG

AD56R CAACACCAAAGCATATTCCA AH77R GGCAAGAATAATAGACGAAATAC AF4L GCAAGGTTTATCTGAGTTCC AH77BL TGGCTAACGACTTTCACTCA

AF4R GCAGTTGTGGCAGGTGT AH77BR GAATCACGACATTTCTCCCT

AF90L GTTCAGTTCTATCCAAAATCCC AM32L GTTGATGATTTGCTTTGTGC

AF90R AAGACGACAGGAATGGCTC AM32R CTGTGCGTGGATGCTGTA

AF91L CACCTTCAGACGCAAAACA AM86L CTCTTATGCGGAACTATGGC

AF91R GCCGAACAAACAGAAACG AM86R TGGGGATTTCGGGTTG

AF91BL GTTTCGGACTGCGTCTTC AO40L GTGGGAATGTGAAATACGG

AF91BR TCAATCCACTGCTTGCTTAC AO40R AGGAGGGCAGGAAGTGA

AF92L GTCGTTTTAGGCGTGGCT AO41L GAGGTTGGGCTGCTGTT

AF92R CGTTTTGGAGTCCGTGTT AO41R GGATTGTAGATCGGATGAGTAA