CLASS-VP多点(外标法)校正标准曲线制作

岛津class-vp外标法标准曲线制作流程 1．定义峰。打开目标数据文件，点击define peaks或define Single peak

查看定义时间范围，选择合适时间窗（一般默认5%）等，点击OK。

2．编辑峰组表。

2.1点击method菜单下的peaks/groups。

2.2 弹出对话框（下图）中给出峰名， fit type项下选择linear，多点不过零点。Level1、level2等输入标准溶液浓度级别。

2.3保存方法文件。点击file\method\save as…命名该方法文件。

3通过后处理方式建立标准曲线（多点校正时需建立序列表）

3.1建立序列表 File/sequence/new

点击OK

3.2编辑sequence表：批表中调入方法文件（2.3中保存的方法文件）、数据文件（按照浓度顺序）、level（从上到下依次1、2、3等级别），Run type项第一行选择clear all Calibration 和begin calibration，最后一行end calibration

3.3 保存sequence表：file/sequence/save as，命名并保存序列表。

3.4运行sequence ：sequence菜单下process。执行Start。

4．查看标准曲线。Method/Review Calibration

弹出标准曲线及相关信息

5．定量未知样品

5.1 后处理未知样品定量

5.1.1打开未知样品数据文件（File/data/open）

点击打开

5.1.2查看外标报告。Reports/View/External Standard (Det A)

5.2、实时采集未知样品数据并计算结果

5.2.1未知样品进样 (Control/Single run)

点击Start，进样，采集数据

5.2.2查看结果（Reports/view/External Standard(Det A)）

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2009/6/16

内标法的计算.doc

内标法给人的印象总是让人头疼，何时选用内标法，如何选择内标物质，结果怎么计算，公式该如何理解，都是问题。 被问到过内标法的定量依据是什么，也就是在内标法里内标和待测物之间是什么关系。当时有点晕，说待测物和内标的比是一定的。到底是什么的比一定呢？你清楚吗？ 在此，撇开大家谈论过很多的内标法如何应用的问题，来谈谈内标法的计算。 先来分清两个概念，绝对校正因子和相对校正因子。以色谱分析为例，绝对校正因子是单位峰面积所相当的物质量，fi’=mi/Ai。而相对校正因子是某一组分与标准物质的绝对校正因子之比，f= fi′/ fs′=As?mi/Ai?ms。在内标法中，绝对校正因子主要由仪器的灵敏度决定，并且不易准确测量，也无法将内标物和待测物联系起来；而相对校正因子才是定量的基础，也是前文中提及的问题的答案，相对校正因子是那个一定的量，所谓待测物与内标的比一定也就是说待测物的质量与峰面积之比（即绝对校正因子fi’）和内标物的质量和峰面积之比(fs’)的比值一定（话比较绕，结合公式就一目了然啦）。文献上，标准上看到的校正因子也都是相对校正因子。相对校正因子也可以通过已知量的标准和内标混合后经实验测定获得。 对相对校正因子的公式进行简单变形，就能够得到待测物质量mi=Aifi’/Asfs’*ms=，进而通过C=mi/m得到待测物的浓度。 因此，再见到各类内标计算公式，我们就能够分辨其中的f到底是相对校正因子还是绝对校正因子了。比如 里，fi、fs就是指绝对校正因子。 而为了避免测定校正因子，常采用内标标准曲线法。它以mi= ms*fi*Ai /(fsAs) 为基础，但有一个前提是加入恒定量的内标物，且进样量相同（ms同），这样待测组分的含量就与Ai/As成正比了。mi=Ai/As*常数。 绘制内标标准曲线，先将待测组分的纯物质配成不同浓度的标准溶液，分别取一定量的标准溶液，加入相同量的内标物，混合后进样分析，测出Ai和As，以Ai/As为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标作图。分析待测试样，取与标准溶液相同量的待测试样和内标物，测出峰面积比，由标准曲线即可查出待测组分的含量。 利用内标标准曲线法定量，可以免去测定校正因子的麻烦，也可以减少与查阅到的校正因子仪器条件等不同造成的差异，适用于液体试样的常规分析。 总结起来有2点。一是在内标法中只有相对校正因子，也就是待测物与内标物的绝对校正因子的比值是一定的。二是内标标准曲线法能够避免测定校正因子，但使用上有一些限制。

考马斯亮蓝标准曲线制作

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。 二、蛋白质含量测定方法 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Folin-酚试剂法 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 （一）、试剂： 1、考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 2、标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl （0.9%NaCl）配制成100ug/ml蛋白溶液。 （二）、器材： 1、722S型分光光度计使用及原理（）。 2、移液管使用（）。 （三）、标准曲线制作： 1、 2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、

40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。 1）、利用标准曲线查出回归方程。 2）、用公式计算回归方程。 3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。 4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 （四）、蛋白质含量的测定： 样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。 （五）、注意事项： 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。 3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。 4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。

气相色谱法—内标法

什么叫内标法?怎样选择内标物?
     内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。
     内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。
    
     在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值?
    
     影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。
     由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。
     化学方面的因素包括：
     1、内标物在样品里混合不好；
     2、内标物和样品组分之间发生反应，
     3、内标物纯度可变等。
     对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定，
    
     在制作内标标准曲线时应注意什么?
    
     在用内标法做色话定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等)，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，

标准曲线

1、标准曲线的本质 分析检测中的标准曲线是指一系列已知含量（浓度/量）的物质与仪器响应/信号之间的关系，数学处理就是曲线方程，图形表示就是标准曲线（图1）。 标准曲线的目的是可以根据标准曲线查出待测物质的含量。当我们得到一系列已知含量的物质的响应后，就会去建立函数关系，数学上称曲线拟合，由于直线最为简单，所以常常用直线方程加以拟合，当然会用到多项式拟合等其他方式。 标准曲线的核心问题要解决： 1、能找到确切浓度的标准物质或标准品。 2、标准系列和待测物质一定要有相同和一致的基体，因为样品基体可能会干扰仪器的响应，从这个意义上讲，样品的前处理实际就是提供标准和样品同样的基体环境，尽量祛除干扰基体。 所以最好的标准系列应该是样品基体匹配的标准系列。而方法建立过程中首先要考虑的当然是基体干扰的问题，推荐用标准加入曲线和Youden曲线分别考察样品基体所带来的乘积性干扰和加和性干扰。 标准加入曲线就是在样品中加入一系列标准，然后考察该标准加入曲线和标准曲线斜率的统计学差异，若有差异需考虑用标准加入法定量；而Youden曲线就是对样品做一系列稀释，然后用稀释倍数如1/10,1/5,1/2,1对仪器响应做曲线，考察该Youden曲线的截距与0的差别，若有差别则提示有加和性干扰，此时测定值要减去该截距才是真实值。 只有解决了标准曲线与样品基体的匹配问题，我们的定量才可靠。 内标法和替代物的使用则是为了解决仪器和前处理的影响问题。

2、标准曲线的做法 按《基于标准样品的线性校准》推荐： 1、标准曲线的浓度范围应覆盖正常操作条件下的被测量范围； 2、标准样品的组分尽量与被测样品组分一致； 3、标准样品的浓度值应等距离的分布在被测量范围； 4、标准样品的个数至少应有3个浓度； 5、每个标准点至少重复2次，这个重复是指从稀释开始；如果国家标准有相应的浓度系列推荐，尽量按国家标准，如果你要偷懒，比如我要减少标准点，至少要有理论标准支撑，比如至少要3个浓度。 工作中我们经常采用线性校准，因为线性方程最为简洁。 3、标准曲线的检验 标准曲线的检验是实际操作中最大的难点，也是工作中误区和争议最多的话题，比如GB/T 就将标准曲线的检验分为：精密度检验，截距检验和斜率检验，但并未出示具体的检验方法。

内标法-标准曲线

配置不同浓度配比的苯甲醇和苯甲醛标准样品，如表2-4， 表2-4 标准液的配制 Tab.2-4 Preparation of standard solution 标准液编号 1 2 3 4 5 6 苯甲醇(ul) 0 20 40 60 80 100 苯甲醛(ul) 98 78.5 58.88 39.25 19.63 0 十二烷(ul) 50 50 50 50 50 50 按照内标法原理，做出苯甲醇和苯甲醛的标准曲线，其原理如下： 设在V mL 样品中含有C i mol·mL-1待测样i，加入C S mol·mL-1内标物S，混合均匀后于色谱进样，得到组分i及内标物S的峰面积分别为A i及A S。由于峰面积正比于通过检测器的物质的量，所以有： C i = f i A i，C S =f S A S，式中fi、fs 分别为组分i和内标S的校正因子。 两式相除，得：C i /C S =f i A i / f S A S= f i / f S?A i /A S (1) 由于在实际工作中一般采用相对校正因子（某物i与所选定的基准物质S的绝对定量校正因子之比）即：f = f i / f S ， (1)式可简化为C i /C S = f ? A i /A S (2) 根据（2）式，在测量过程中，分别称取准确质量的样品，混合均匀后进样，记录其相应的峰面积，计算可得相对质量校正因子。由于内标法是一种相对测量方法，因此，对进样量要求不太严格，操作条件稍有变化或是仪器的误差对结果均不会产生较大的影响。在用内标法做色谱定量分析时，先配制一定配比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做浓度比与面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。 图2-3 反应物苯甲醇的标准曲线 Fig.2-3 The standard curve of the reactant benzene alcohol

内标法与外标法

内标法与外标法 一、内标法 什么叫内标法?怎样选择内标物? 内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。 在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值? 影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。 由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。 化学方面的因素包括： 1、内标物在样品里混合不好； 2、内标物和样品组分之间发生反应， 3、内标物纯度可变等。 对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定， 在制作内标标准曲线时应注意什么? 在用内标法做色话定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等)，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。 二、外标法

气相色谱内标标准曲线法测定白酒中四种酯类

气相色谱内标标准曲线法测定白酒中四种酯类 白酒在生产过程中，酸与醇发酵生成各种酯，酯类在形成各类香型白酒的风味特征中起着极其重要作用，不同的酒，其含量要求也不一致。由于各种酯类的不同和含量的多少决定了白酒的香气和风格，它对白酒香型的确定起主导作用。而年代越长的酒，酯类的含量越高，酒就越香，品质就越好。所以对酒中酯类物质气相色谱的测定有助于酒的品质的鉴定。国产酒中酯类的成分和含量差异较大，故通过分析国产名酒的特征峰的分布和含量，也是可以达到鉴别假冒名酒的目的。本文以乙酸正戊酯作为内标物，建立了测定酒中多种酯类含量的气相色谱内标标准曲线分析方法。 1 材料与方法 1.1 仪器 Agilent 7890气相色谱仪；氢火焰离子化检测器(FID)；色谱柱：FFAP毛细管色谱柱（30m×0.25mm ×1.0μm）。 1.2 色谱条件 柱温：60℃(5min)→10℃/min→110℃→20℃/min→200℃；进样口温度：220℃，进样量：1μL，分流比：20 ：1；FID温度：220℃；载气为高纯氮气，流速：1mL/min。 1.3 试剂与材料 1.3.1 标准物 乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯均为色谱纯；内标物：乙酸正戊酯（色谱纯）；60%（v/v）乙醇（色谱纯）水溶液。 1.3.2 内标标准曲线的配制 1.3. 2.1 内标溶液的配制 准确吸取2mL乙酸正戊酯（色谱纯）于100mL容量瓶中，用60%（v/v）乙醇溶液定容至刻度，使乙酸正戊酯浓度为17.6g/L。 1.3. 2.2 标准使用液的配制 分别准确吸取色谱纯乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯及丁酸乙酯2mL于100mL容量瓶中，用60%（v/v）乙醇溶液定容至刻度，，使其成为含乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯及丁酸乙酯分别为18.0g/L，17.6g/L，20.8g/L，17.6g/L的混合标准溶液。 1.3. 2.3 溶液标准曲线的配制 取6个100mL容量瓶依次加入标准使用液0.10、0.50、1.00、5.00、10.0、20.0mL，再在每个容量瓶中加入1mL内标溶液，用60%（v/v）乙醇溶液定容至刻度摇匀后进行气相色谱分析。 1.4 酒样的配制 取适量茅台酒样品于100mL容量瓶中，加入1mL内标溶液，用酒样定容至刻度，混匀后在相同色谱条件下进样分析。重复测定六次并记录结果。另取五粮液酒样进行相同条件的分析。 1.5 测定方法 在选定的相同分析条件下，标准曲线溶液和样品溶液进样分析，以保留时间定性，以待测物的峰面积与乙酸正戊酯峰面积之比为纵坐标Y，相应浓度为横坐标X，进行线性回归定量分析。 2 结果与讨论 2.1 色谱柱的选择 用同一份白酒样品分别使用不同极性的色谱柱(DB - 1、DB - 5、DB - 17、FFAP)测试后发现，各待测物在非极性至中极性的柱子上虽也能分离，但峰形较差，影响定量结果的准确性；而在强极性柱FFAP上，各峰峰形尖锐，可获得满意的分离较果。故选用FFAP毛细管柱 2.2 分流比的选择 1

色谱定量分析,外标法和内标法如何进行选择

色谱定量分析，外标法和内标法如何进行选择 色谱定量分析，外标法和内标法如何进行选择色谱分析的重要作用之一是对样品定量。而色谱法定量的依据是：组分的重量或在载气中的浓度与检测器的响应信号成正比。常见定量分析方法分为面积归一化法、内标法、外标法、标准曲线法等。大家常常容易傻傻分不清楚的莫过于内标法、外标法了。 以内标法为例，选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物（当然是样品中没有的组分），然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将内标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数，用内标法公式计算即可。 其实，从定义上来区分的话，外标法就是用标准品的峰面积或峰高与其对应的浓度做一条标准曲线，测出样品的峰面积或峰高，在标准曲线上查出其对应的浓度，这是最常用的一种定量方法； 内标法是对应外标法说的，内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。 外标法需要用样品和标准品对比，但是有时我们很难保证样品和标准品进的体积是一样的，毕竟要有误差，这时候就用内标法，就是在外标法的基础上,在样品和标准品里在加入一种物质，通过加入物质的峰面积或峰高的变化,就可以看出我们标准品和样品进样体积的差别，但同时会引进加入物质的秤量误差。所以一般用外标法来定量，如果进样体积很难掌握，就用内标法，可以消除进样体积的误差。 外标法 外标法（标准曲线法、直接比较法）首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。 具体作法是：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。若标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。 当欲测组分含量变化不大，并已知这一组分的大概含量时，也可以不必绘制标准工作曲线，而用单点校正法，即直接比较法定量。单点校正法实际上是利用原点作为标准工作曲线上的另一个点。因此，当方法存在系统误差时（即标准工作曲线不通过原点），单点校正法的误差较大。因此规定，y=ax+b（b的绝对值应不大于100%响应值是y的2%）。 标准曲线法的优点：绘制好标准工作曲线后测定工作就很简单了，计算时可直接从标准工作曲线上读出含量，这对大量样品分析十分合适。特别是标准工作曲线绘制后可以使用一段时间，在此段时间内可经常用一个标准样品对标准工作曲线进行单点校正，以确定该标准工作曲线是否还可使用。

Excell软件绘制ELISA标准曲线

怎么用Excell软件绘制ELISA标准曲线 许多试剂检测都涉及到标准曲线的问题,究竟如何绘制或制作标准曲线呢? 用Excell和SPSS的软件能做出来吗?,怎么操作?能一起求出计算公式吗? 有没有专门的软件来处理呢?介绍几种? 希望有这方面经验的介绍自己的经历,与大家分享,“与众同乐才是真的快了” 的确,标准曲线做的好与坏会直接影响到实验的结果,甚至是关系到实验的成败。 首先,做标准曲线样品检测时有几个问题需要注意: 1、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的,所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事,否则后面的实验结果无从谈起。 2、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度,并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度,即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内,包括上限和下限。而对于呈S型的标准曲线,尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段,即曲线几乎成直线的范围内。 3、最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度,这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。 4、检测标准样品时,应按浓度递增顺序进行,以减少高浓度对低浓度的影响,提高准确性。 5、标准曲线的样品数一般为7个点,但至少要保证有5个点。 6、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动,但一般来说,相关系数R至少要大于0.98,对于有些实验,至少要0.99甚至是0.999.

怎样绘制标准曲线? 标准曲线浓度得到后,可通过计算器、Excell或SPSS统计软件进行绘制,并得到相关的回归方程(即计算公式和相关系数(回归系数,个人认为,Excell 软件比较好用一些;SPSS也行,不过是英文的,初学者不是很容易掌握;计算器嘛太麻烦了,所以现在一般不用。 双抗夹心法ELISA拟和曲线: 拟和曲线: 打开EXCEL软件;在工作表中 输入第一行:浓度值,如0 10 50 100 400 输入第二行:该浓度下的调整后的od值,如0 0.586 1.397 1.997 3.42 选择这些输入的数据,用插入里的图表按钮,进入图表向导,在“标准类型”中选择“xy散点图”;在“子图表类型”中选择“折线散点图”,按“下一步”;选择“系列产生在行”,按“下一步”;数据标志,可以填写:如数据y 轴,OD值;数据x轴,浓度;按下一步,点击完成。可得曲线图。 单击曲线,按右键,选择“添加趋势线”,在类型中,选择多项式;在选项中,选择显示公式,选择显示R平方值。得到公式和R平方值。 也可以用上面说的方法,在公司已经提供的图表上,双击图表,把它输入到图表的数据中,就可以拟和新的曲线。 计算浓度: 举例:第一次实验: 标准曲线为:

归一化法外标法内标法的区别

色谱定量方法 一、归一化法 由于组分得量与其峰面积成正比,如果样品中所有组分都能产生信号,得到相应得色谱峰,那么可以用如下归一化公式计算各组分得含量、 (7。 34)?若样品中各组分得校正因子相近,可将校正因子消去,直接用峰面积归一化进行计算。中国药典用不加校正因子得面积归一化法测定药物中各杂质及杂质得总量限度。 (7、3５) ?归一化法得优点就是:简便、准确、定量结果与进样量重复性无关(在色谱柱不超载得范围内)、操作条件略有变化时对结果影响较小。 缺点就是:必须所有组分在一个分析周期内都流出色谱柱,而且检测器对它们都产生信号。不适于微量杂质得含量测定。 二、外标法 用待测组分得纯品作对照物质,以对照物质与样品中待测组分得响应信号相比较进行定量得方法称为外标法。此法可分为工作曲线法及外标一点法等、工作曲线法就是用对照物质配制一系列浓度得对照品溶液确定工作曲线,求出斜率、截距。在完全相同得条件下,准确进样与对照品溶液相同体积得样品溶液,根据待测组分得信号,从标准曲线上查出其浓度,

或用回归方程计算,工作曲线法也可以用外标二点法代替。通常截距应为零,若不等于零说明存在系统误差。工作曲线得截距为零时,可用外标一点法(直接比较法)定量。 外标一点法就是用一种浓度得对照品溶液对比测定样品溶液中ｉ组分得含量。将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样,测得峰面积得平均值,用下式计算样品中i组分得量:?W=A(Ｗ)/(A)(７。36) 式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含i 组分得重量及相应得峰面积。(W)及(A)分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分得重量及相应峰面积、外标法方法简便,不需用校正因子,不论样品中其她组分就是否出峰,均可对待测组分定量。但此法得准确性受进样重复性与实验条件稳定性得影响、此外,为了降低外标一点法得实验误差,应尽量使配制得对照品溶液得浓度与样品中组分得浓度相近。 三、内标法 选择样品中不含有得纯物质作为对照物质加入待测样品溶液中,以待测组分与对照物质得响应信号对比,测定待测组分含量得方法称为内标法。“内标”得由来就是因为标准(对照)物质加入到样品中,有别于外标法。该对照物质称为内标物。 在一个分析周期内不就是所有组分都能流出色谱柱(如有

标准曲线数据表

5．含量的测量 【数据记录】 ● 称量信息： 10片片重W=4.390g W 平均=439 mg 片粉重W ’=0.073g A 样品=0.126 ● 计算： 带入公式：A=0.0059X+0.006, 得X （浓度）=20.34 ug/ml 百分含量%=C*V*n/(片粉重量)=20.34*25*100/10^6*0.073=69.65% ● 分析： 若将最后一点带入曲线，R=0.997，线形不如只带前五点好。因此，省去第六点，这样线形在三个9，线形良好 【结果与结论】该批次阿司匹林片剂中原料药的百分含量为69.65%。 6．溶出度与溶出速率 【数据记录】 乙酰水杨酸片的溶出速率测定数据 取样时间（min) 吸光 度 实测浓度(ug/ml) 校正浓度（ug/ml) 溶出百分率 F(%) X Y 5 0.103 16.6 16.6 0.243737051 1.609438 -1.27523 10 0.18 32 32.083 0.471073241 2.302585 -0.45113 15 0.244 44.8 45.043 0.661364336 2.70805 0.079578 25 0.339 63.8 64.267 0.943629461 3.218876 1.056334 35 0.38 72 72.786 1.068713553 3.555348 #NUM! 45 0.418 79.6 80.746 1.185589874 3.806662 #NUM! （1） F=50%, 带入线形公式计算得， t=10.04 min ， Lnt=2.31——T50 （2） F=63.2%,带入线形公式计算得， t=12.94 min ， Lnt=2.56——Td （3）m 值计算：过M 点(1,0)的直线为, y=1.426x-1.426, 所以，m=-1.426 （4）溶出度测定： F(45min)= 118.6% > 70%,溶出百分率复合药典规定 【结果】 T50为2.31，时间10.04min ， Td 为2.56，时间为12.94min, m=-1.426， F(45min)为118.6%>70% 【结论】该片剂的溶出度符合药典规定，溶出速率符合Welbull 方程，溶出较快，较均匀。 标准曲线数据表 序号 浓度（ug/ml) 吸光度 1 10 0.066 2 20 0.123 3 30 0.183 4 40 0.242 5 50 0.301 6 100 0.551

归一化法,内标法,外标法

归一化法normalization method 一种常用的色谱定量方法。归一化法是把样品中各个组分的峰面积乘以各自的相对校正因子并求和，此和值相当于所有组分的总质量，即所谓“归一”，样品中某组分i的百分含量可用下式计算： pt%= Aifi/(A1f1+A2f2 + ....Anfn )*100 式中f1、f2、fn…为各组分的相对校正因子，A1、A2、…An为各组分的峰面积。如果操作条件稳定，也可以用峰高归一化法定量，此时组分i的百分含量可按下式计算：pt%= hifi/(h1f1+h2f2 + ....hnfn )*100 式中f1、f2、fn、…为各组分在该操作条件下特定的峰高相对校正因子，h1、h2、…hn为各组分的峰高。用归一化法定量时，必须保证样品中所有组分都能流出色谱柱，并在色谱图上显示色谱峰。 定量方法 色谱中常用的定量方法有： a.校正归一化法 当试样中各组分都能流出色谱柱且在检测器上均有响应，各组分的相对校正因子已知时，可用此法定量。组分i在混合物中的百分含量可由下式计算： 其中fi可为质量校正因子，也可为摩尔校正因子。 若各组分的定量校正因子相近或相同（如同系物中沸点接近的组分），则上式可 简化为： 该法简称为归一化法。 校正归一化法的优点是：简便、准确，当操作条件如进样量、流速变化时，对定量结果影响很小。缺点是：对该法的苛刻要求限制了该法的使用。该法适合于常量物质的定量。 b.内标法 所谓内标法是将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测物和内标物的质量及在色谱图上相应的峰面积比，求出某组分的百分含量。

当只需测定试样中某几各组分时，而且试样中所有组分不能全部出峰时，可用此法。此法适合于微量物质的分析。该法的计算公式如下： 其中，f 是被测组分相对于内标物的相对校正因子。 si 该法的优点是：受操作条件的影响较小，定量结果较为准确，使用上不象归一化法那样受到限制。该法的缺点是：每次分析必须准确称量被测物和内标物，不适合于快速分析。 内标物的选择十分重要。它应该是试样中不存在的物质；加入的量应接近于被测组分色谱；同时要求内标物的色谱峰位于被测组分色谱附近或几个被测组分色谱峰的中间，并与这些组分完全分离；内标物必须不与样品发生反应等。 c.外标法（定量进样－标准曲线法） 所谓外标法就是应用被测组分的纯物质来绘制浓度c对响应值A（h）的标准曲线，然后测试被测样品中被测组分的响应信号（峰面积或峰高），由标准曲线即可查出或通过线型回归计算出其百分含量。 该法必须定量进样，即测定标准曲线和测定未知物时，进入色谱中的样品量必须一致。 该法的优点是：操作简单，计算方便，缺点是：结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。 当被测试样中各组分的浓度变化范围不大时（如工厂的中间控制分析）可不必绘制标准曲线，而用单点校正法。即配制一个与被测组分含量十分接近的浓度为的标准溶液，定量进样，由下式计算被测物的含量。 C S 关于归一化法的一些问题？？ 归一化法中的校正因子如何得到？？？ 如果不做，采用面积归一化法的误差大吗？？ 一般那么多的校正因子不可能一一测出呀？？

标准曲线的制作方法

标准样品的准备 由于你做的是基因表达分析，样品的准备就比较简单了，因为你要知道都是相对的数值（你的对照样品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。 你实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的RNA转录得到的cDNA。将这种cDNA进行梯度的稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体到你的实验要根据具体的情况来调整稀释倍数。最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合你的这种基因的扩增）。而对于各个稀释倍数我们要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有的基因数量（在基因表达分析中也不需要），而是我们根据稀释倍数给每一个稀释度人为赋予的拷贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。比如我们把前面稀释十倍的样品赋值为10000个拷贝，100倍的赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍的赋为10等。要注意，赋值的数目的倍数差异和你稀释的倍数是一样的，比如前面是10稀释，后面赋值也是10倍变化。 如何做标准曲线 在定量实验中标准品是要和你的未知样品一起进行定量实验的，这样在实验结束，无论是标准品还是未知样品都将跑出曲线，获得Ct值。那么我们先可以把未知样品放到一边，对于标准品来说，我们既获得了Ct值，还知道他们的拷贝数（虽然这个拷贝数是我们自己赋予的）。这样我们可以通过标准品的Ct值和拷贝数做一条标准曲线（以拷贝数为横坐标，而Ct值为纵坐标）。一旦作出了标准曲线，而未知样品的Ct值我们知道（通过实验求得的），这时候就在标准曲线上进行定位，就可以得到未知样品的拷贝数了。 事实上，操作起来没有那么复杂，你只需要告诉软件你的哪个孔是标准品，哪个是未知样品，以及标准品的拷贝数等必要信息，软件会自动帮你把标准曲线和未知样品的拷贝数计算出来。 举例来说如何进行设置 先进入软件，在板设置中选择所放样品的位置，并标上unknow或standard等信息。 选择要使用的荧光染料。

气相色谱法―内标法(精)

气相色谱法—内标法 一、什么叫内标法? 怎样选择内标物? 内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。 内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。 二、在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值? 影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。 由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。 化学方面的因素包括： 1、内标物在样品里混合不好；

2、内标物和样品组分之间发生反应， 3、内标物纯度可变等。 对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定， 三、在制作内标标准曲线时应注意什么? 在用内标法做色话定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。

标准曲线法与标准加入法的区别

1 标准曲线法 1.1标准曲线法的计算公式 在一定条件下，标准曲线是一条直线，直线的斜率和截距可以用最小二乘法求得。现在好多仪器软件都能自动生成标准曲线，所以一小部分版友不清楚标准曲线的具体计算方法。本人查找了一些资料，找到标准曲线的斜率和截距的计算方法，和大家分享。 工作曲线可以用一元线性方程表示： y=a+bx （1） 式中，x为标准溶液的浓度，y为相应的吸光度。 使用最小二乘法确定的直线称为回归线，a,b称为回归系数。 b 为直线的斜率，可由下式求得：

1.2 灵敏度 灵敏度是指该方法对单位浓度或单位量的待测物质的变化所引起的响应量变化的过程。一般用标准曲线的斜率b为方法的灵敏度，b越大，灵敏度越高。 不要小看灵敏度，用处可大了。灵敏度由于仪器的不同，实验条件等的不同，在不断的变化。但在一定的实验条件下，灵敏度相对还是比较稳定的。所以，建议对灵敏度也做个质量控制图，具体做法见我另一个帖子。 每次标准曲线做好以后，观察灵敏度是否在一定的范围内维持稳定。如果发现灵敏度突然降低，就需要考虑，是否是仪器出问题了。火焰首先考虑雾化器是否堵塞，石墨炉首先考虑石墨管是否是烧坏。解决方法是用通丝清理雾化器，更换石墨管后继续测定标准曲线，带灵敏度稳定后进行样品测定。还有，在打开一瓶新的标准溶液的时候，在仪器进行维修以后，一定要注意灵敏度的变化。 1.3线性范围 线性范围这个大家都比较清楚，主要从相关系数r看，一般要求r大于等于三个九。我在这里和大家分享的是，我想了好久才想开的一个问题。之前看好多书上

后来专门做了好多次实验，还是一直是直线在，只是有时候浓度高时，线性不好，高浓度点不在标准曲线上，而是在标准曲线的下面，而且离拟合的标准曲线比较远。遇到这种情况，标准曲线的线性相关系数就很差，有时候才一个九，如图2所示。最后我终于想明白了，如果自己用手动拟合的话，用平滑的曲线去连接所有点的话，你就会发现，如果在线性范围内，连接起来就是直线，如果超出了线性范围，连接起来就是一条弯曲的曲线。从弯曲的拐点开始，就已经超出了线性范围，如图3所示。 所以，判断是否超出线性范围，个人觉得不是看是否弯曲，软件用最小二乘法拟合的一次曲线，永远是直线。要看你的高浓度点是否在拟合的标准曲线上或离得比较近，相关系数是否在三个九以内。如果不在，从拐点开始的那个点，就超出了线性范围，应该删除，从新拟合。 1.4检出限 检出限是指对某一特定的分析方法在给定的置信水平内可以从样品中检测待测物质的最小浓度或最小量。

实验9 气相色谱、内标法测定蘑菇醇的含量

内标法测定蘑菇醇的含量 【摘要】 气相色谱法（GC）分离效率、选择性、灵敏度都很高，适用于热稳定性好、易挥发的物质。外标法通过配置标准溶液来制作工作曲线，但使用溶液体积很少时误差较大，可以通过加入内标物减小误差。本实验通过内标法和气相色谱法来测定未知物中的蘑菇醇含量。 【关键字】气相色谱内标法蘑菇醇 【实验目的】 1、了解气相色谱法的基本原理及仪器结构。 2、了解气相色谱基本仪器操作。 3、掌握内标法的配样与计算方法。 【基本原理】 原理概述：气质联用仪（GC-MS）近年来在有机化学领域起到越来越重要的作用，其原理是利用气相色谱的分离能力，将样品各组分分离开，然后对各组分进行质谱分析，得出组分信息。再利用 内标法制作工作曲线来计算未知物浓度。 ?气相色谱法（GC）：是利用气体作流动相的色层分离分析方法。 优点：分离效率、选择性、灵敏度都很高。 缺点：只适用于热稳定性好、易挥发的物质。 ?内标法：在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校准和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。 内标物的选择要求： 1、是能得到纯样的己知化合物；

2、和被分析的样品组分有基本相同的物理化学性质（化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等）、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物； 3、不与样品中各组分充分分离发生反应； 4、既可被色谱柱所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰， 原理：只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量： m ：样品的质量； ms ：待测样品中加入内标物的量； As ：待测样品中内标物的峰面积； f s,i ：组分 i 与内标物的校正因子之比，称为相对校正因子。 ? 蘑菇醇：即1-辛烯-3-醇 分子式：C 8H 16O ； 分子量：128.21 应用：用于日化和食用香精；作为化学合成原料， 应用於制药领域；作为蚊虫引诱剂，应用于杀蚊制品。 【仪器与试剂】 1、 仪器：Agilent7890N 气相色谱仪，10μl 进样针，1000μl 移液枪。 2、 试剂：蘑菇醇储备样（10.107mg/ml ），内标物（10.140mg/ml ），蘑菇醇未知样，乙腈溶液。 【实验步骤】 1、配制标准溶液：以移液枪分别移取200、400、600、800、1000μl 蘑菇醇储备液和400、400、400、400、 400μl 氯苯储备液与5ml 容量瓶中，用乙腈定容到刻度。 2、配制未知溶液：以移液枪量取200μl 蘑菇醇未知液和400μl 氯苯储备液与5ml 容量瓶中，用乙腈定容到 刻度。 3、设定气相色谱参数：进样口：气化温度：250℃，分流比：10:1； 色谱柱：流速：2.0ml/min ； 柱温箱：120℃（保持1min ），10℃/min 升到200℃； 图1 蘑菇醇结构式 % 100m f m x s i s,i s i ????=A A

应用EXCEL绘制ELISA标准曲线及计算样本浓度

应用EXCEL绘制ELISA标准曲线及计算样本浓度 整体思路：在ELISA实验结束后，我们得到的是经酶标仪读出的标准品以及样本的OD值。其中，标准品的浓度已知，我们可以利用标准品的OD值及其相对应的浓度，以OD值为横坐标，浓度为纵坐标，做一条标准曲线，并用公式表示出来。这样，我们把样本的OD值以X值代入，便可求出Y值，即样本浓度。下面我们就一步步来实现这个目标: 1. 首先，将数据整理好输入Excel，分别为经酶标仪读出标准品的OD值及其对应的浓度值。 2. 拖动鼠标选取完成的数据区，并点击图表向导，在图表类型中选“XY散点图”，并选择子 图表类型的“散点图”（第一个没有连线的）。如下图所示。

3. 点击“下一步”，出现如下图界面。如是输入是如本例横向列表的就不用更改，如 果是纵向列表就改选“列”。

在做ELISA标准曲线，并通过此曲线求样本浓度时，因样本OD值是已知的，因此，我们需要将OD值设为X。根据上图我们可以看到，横坐标X值为OD值，纵坐标Y为标准品浓度，这正是我们想要的。 4.有时需要我们手动选择X值，这时可以点击“系列”来更改，如下图。

如果要对横坐标和纵坐标进行掉换，我们可以就点击X值和Y值文本框右边的小图标，结果如下图：

出现上图后，拖动鼠标选取正确的数据区域以调整X或Y。 5.调好之后，然后点击“下一步”出现图表选项界面，如下图。 6.点击“下一步”，在弹出的窗口再点击“完成”现在一张带标准值的完整散点图就已经完成，如下图。

7.到了这一步，散点图便完成了。我们可能会问，曲线在哪里啊？ 其实很简单，先点击图上的标准值点（记住一定要点选上)，然后单击右键，点击“添加趋势线”。如下图: