巨噬细胞分型
巨噬细胞分型
巨噬细胞作为炎症反应的主要作用细胞，在不同条件下，有着明显的形态和功能差异。通过表型分析鉴定巨噬细胞类型可以更好的研究巨噬细胞的功能多样性。目前根据活化状态、发挥功能以及分泌因子的不同，巨噬细胞主要可分为经典活化的M1 型巨噬细胞(Classically activated macrophage) 和选择性活化的M2型巨噬细胞(Alternatively activated macrophage) 。现在已经有很多文献从精氨酸代谢途径[1]、细胞因子分泌[2]和表面分子的表达[3]等不同方面对M1 型与M2 型巨噬细胞进行区分。M2的定义很快扩大为除了M1之外的其他所有巨噬细胞。尽管越来越多的证据显示这种M2定义所包含的细胞在生物化学和生理学方面
存在巨大差异，但这种分类方法依然沿用。[4]
M1 型巨噬细胞一般是通过干扰素-γ及细菌脂多糖(LPS)活化，M1主要分泌促炎因子，在炎症早期承担着重要作用。而M2型巨噬细胞通过Th-2细胞因子如IL-4、IL-13及免疫复合物等进行活化，M2表达抑制炎症因子，起着抑制炎症反应以及组织修复的作用。根据在组织修复中的不同作用，M2型巨噬细胞又可以分为三种亚型，分别为M2a、M2b、M2c。其中M2a、M2b可以起到免疫调节作用及促进M2型免疫反应，而M2c则是有着抑制免疫反应及组织重构的作用。具体分型及各自的作用见图1。[5] M1, M2各表型的激活因素、分泌的细胞因子、趋化因子及其功能总结于表1中。
图1 不同分型巨噬细胞的刺激物和选择性表达的功能性质
Figure 1.Inducers and selected functional properties of different polarized
macrophage populations.
表 1.巨噬细胞不同表型的激活因素、分泌的细胞因子、趋化因子及其功能[5-8]
由于不同分型的巨噬细胞生长条件、功能性质不同，所以在心血管生物材料的研究中，可以考虑通过调整材料性质来调控不同分型巨噬细胞的数量比例，来发挥不同功能，例如减少M1型巨噬细胞来抑制炎症反应，增加M2型巨噬细胞来促进组织修复等。Garg, K等用聚二氧六环酮（POD）研究了材料纤维直径、空隙等对巨噬细胞分型的影响；[9]Judite N. Barbosa等研究了壳聚糖乙酰化程度不同对巨噬细胞分型的影响；[10] Kara L. Spiller等人则是研究了不同分型的巨噬细胞对血管再生的不同影响。[11]通过研究可以发现，可以通过设计不同的心血管生物材料来调控不同分型巨噬细胞的比例，从而在避免出现血栓，提高材料生物相容性的同时促进组织修复和新生血管的形成。
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[8]. 李丹, 任亚娜与范华骅, 巨噬细胞的分类及其调节性功能的差异. 生命科学, 2011(03): 第249-254页.
[9]. Garg, K., et al., Macrophage functional polarization (M1/M2) in response to varying fiber and pore dimensions of electrospun scaffolds. BIOMATERIALS, 2013. 34(18): p. 4439-4451.
[10]. Vasconcelos, D.P., et al., Macrophage polarization following chitosan implantation. BIOMATERIALS, 2013. 34(38): p. 9952-9959.
[11]. Spiller, K.L., et al., The role of macrophage phenotype in vascularization of tissue engineering scaffolds. BIOMATERIALS, 2014. 35(15): p. 4477-4488.
实验方案-细胞表型检测
细胞表型检测 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 供试品 名称：人胎盘间充质干细胞、猴胎盘间充质干细胞的P4、P6、P8细胞1.1.2 主要试剂 B液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司 D液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司 血清新西兰胎牛血清(特级) 上海依科赛生物制品有限公司 IgG-FITC BD公司货号：555748 CD19-FITC BD公司货号：555412 CD34-FITC BD公司货号：555821 CD44- FITC BD公司货号： CD31- FITC BD公司货号： IgG-PE BD公司货号：555749 CD11b-PE BD公司货号：555483 CD45-PE BD公司货号：555388 CD73-PE BD公司货号：550257 CD90-PE BD公司货号：555596 CD105-PE Serotec公司货号：MCA1557PE HLA-DR-PE BD公司货号：555812 CD29-PE BD公司货号： 1.1.3 主要仪器 CO2培养箱 离心机 超净工作台 显微镜
1.1.4 主要耗材 50ml离心管、5ml/10ml移液管、1.5ml EP管。 1.1.5 实验设计依据 通过传代培养，我们可以得到相对纯的间充质干细胞，参考国际细胞治疗协会提出的间充质干细胞表型方面的标准，CD73、CD90和CD105阳性率不低于95％；CD45、CD34、CD11b、CD19 和HLA-DR阳性率不高于2％[1]。检测在传代过程中的细胞的表型是否会发生变化。我们设计检测P4代、P6和P8代细胞表型。1.2 实验方法 1.2.1细胞消化 1、将原培养液倒净,用移液管取D液10ml冲洗细胞，倒净,此操作重复洗2 次； 2、用移液管吸取加入B液2ml,盖上培养瓶盖子,摇晃使B液均匀覆盖瓶底,待细胞从培养壁脱落下来； 3、用移液管吸取加入C液0.5ml, 终止消化，再加D液10ml，吹打细胞制成细胞悬液，将细胞悬液收集至离心管中； 1.2.2 流式检测方法 1、收集细胞，1000rpm离心5min，用D液洗一次，过滤； 2、用适量D液将细胞重悬，100μl每管分装到1.5mlEP管中，每管细胞不少于用1×105，在每管中加入4μl要检测表型的抗体,室温避光放置30min；加入1mlD液混匀，离心弃上清，再用1mlD液混匀，离心弃上清，每管加入 350-500μl D液重悬，移入流式管待测即可； 3、用流式细胞仪检测荧光值,每管计数3000-10000个细胞； 4、分析数据。 1.3 C6操作步骤 （一）开机 1、启动控制计算机，进入软件，此时信号灯为红灯，显示还没有与C6连接。 2、检查四个液体容器，如有需要，则先充满液体或清空废液。
血管平滑肌细胞表型转换的机制
血管平滑肌细胞表型转换的机制 基础医学院07级临床一班陈依然90701114 摘要 由血管平滑肌异常增殖导致的血管重构是PCI术后再狭窄的重要原因之一。血管平滑肌细胞增殖能力与其表型转换密切相关。本文讨论了血管平滑肌细胞表型转换的特点、机制和相关信号传导途径。 关键词 血管平滑肌细胞表型转换信号传导途径 正文 自1977年冠心病介入治疗技术问世以来，其术后再狭窄（RS）一直是一个影响其远期疗效的重要问题。虽然RS的具体机制尚不明确，但目前已经公认血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cell, VSMC）异常增殖、迁移及大量合成细胞外基质是其主要原因。而VSMC增殖的首要条件就是表型转换。 VSMC的表型可分为分化程度较高的收缩型（分化型）和分化程度较低的分泌型（未分化型或去分化型），我将就其特点和两者之间相互转换的相关信号传导途径进行探讨。 1. 表型转换的特点 VSMC来自胚胎发育时期的中胚层，逐渐分化为不同的细胞群并获得具有成年特征的分化表型，即收缩型。但与骨骼肌、心肌细胞不同的是，VSMC在分化成熟后仍可在某些因素的刺激下去分化成为分化程度较低的分泌型。有报告称，这两种表型可能代表了共存于血管壁内一系列不同表现型的两个极端类型，且表
达不同的基因和蛋白。正常成人动脉血管的VSMC以收缩型为主，其主要功能是维持血管的弹性和收缩血管。收缩型VSMC增殖、迁移能力差或无，胞体呈梭形或带状，含大量肌丝和结构蛋白含，合成细胞器如粗面内质网、高尔基复合体含量较少，合成基质的能力差或无，体积较小。分泌型VSMC主要存在于胚胎中期血管和病理血管中，其主要功能是增殖、迁移入内膜以及合成细胞外基质蛋白。形态上类似成纤维细胞，肌丝和结构蛋白含量较少，合成细胞器增多，合成和分泌基质蛋白的能力较强，体积较收缩型大。 根据VSMC两种表型表达蛋白的不同可以找到表型转换时相应的标志物。其中α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）在收缩型细胞中优势表达而在分泌型细胞中表达甚微，它是VSMC分化的早期特异性标志物，也是应用最多的收缩型标志蛋白。而骨桥蛋白（osteopontin, OPN）则作为应用较多的合成型标志物。有实验显示OPN mRNA在正常的动脉中并不存在，而在动脉粥样硬化中的表达程度则随粥样硬化程度的增加而增加。 下表列VSMC表型转换的主要标志物。
血管平滑肌细胞表型转换的机制
血管平滑肌细胞表型转换的机制 基础医学院 07级临床一班陈依然 90701114 摘要 由血管平滑肌异常增殖导致的血管重构是PCI术后再狭窄的重要原因之一。血管平滑肌细胞增殖能力与其表型转换密切相关。本文讨论了血管平滑肌细胞表型转换的特点、机制和相关信号传导途径。 关键词 血管平滑肌细胞表型转换信号传导途径 正文 自1977年冠心病介入治疗技术问世以来，其术后再狭窄（RS）一直是一个影响其远期疗效的重要问题。虽然RS的具体机制尚不明确，但目前已经公认血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cell, VSMC）异常增殖、迁移及大量合成细胞外基质是其主要原因。而VSMC增殖的首要条件就是表型转换。 VSMC的表型可分为分化程度较高的收缩型（分化型）和分化程度较低的分泌型（未分化型或去分化型），我将就其特点和两者之间相互转换的相关信号传导途径进行探讨。 1. 表型转换的特点 VSMC来自胚胎发育时期的中胚层，逐渐分化为不同的细胞群并获得具有成年特征的分化表型，即收缩型。但与骨骼肌、心肌细胞不同的是，VSMC在分化成熟后仍可在某些因素的刺激下去分化成为分化程度较低的分泌型。有报告称，这两种表型可能代表了共存于血管壁内一系列不同表现型的两个极端类型，且表达不同的基因和蛋白。正常成人动脉血管的VSMC以收缩型为主，其主要功能是维持血管的弹性和收缩血管。收缩型VSMC增殖、迁移能力差或无，胞体呈梭形或带状，含大量肌丝和结构蛋白含，合成细胞器如粗面内质网、高尔基复合体含量较少，合成基质的能力差或无，体积较小。分泌型VSMC主要存在于胚胎中期血管和病理血管中，其主要功能是增殖、迁移入内膜以及合成细胞外基质蛋白。形态上类似成纤维细胞，肌丝和结构蛋白含量较少，合成细胞器增多，合成和分泌基质蛋白的能力较强，体积较收缩型大。
脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型
中国组织工程研究与临床康复第14卷第36期 2010–09–03出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 3, 2010 Vol.14, No.36 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 6685 1Department of Plastic Surgery, Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China; 2Seventh Department of Plastic Surgery, Plastic Surgery Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144, China Cai Zhen☆, Doctor, Attending physician, Department of Plastic Surgery, Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China caizhen1976@126. com Correspondence to: Jiang Hai-yue, Professor, Doctoral supervisor, Seventh Department of Plastic Surgery, Plastic Surgery Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144, China jianghaiyue@sohu. com Received:2010-05-28 Accepted:2010-06-24 脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型☆ 蔡震1，潘博2，林琳2，蒋海越2，庄洪兴2 Biological characteristics and phenotypes of adipose tissue-derived stem cells Cai Zhen1, Pan Bo2, Lin Lin2, Jiang Hai-yue2, Zhuang Hong-xing2 Abstract BACKGROUND: Adipose-derived stem cells (ADSCs) are capable of multi-directional differentiation and exist in human processed lipoaspirate. However, no in-depth studies have addressed biological characteristics of adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) in vitro, and there are some disputes on the results from phenotype studies. OBJECTIVE: To investigate biological characteristics and phenotypes of human ADSCs. METHODS: Human adipose tissue was collected from persons undergoing fat extraction. The ADSCs were digested with collagenase, cultured and subcultured in vitro. Cell morphology was observed and growth curves were drawn. The phenotypes of ADSCs were identified by immunohistochemistry and flow cytometry. RESULTS AND CONCLUSION: ADSCs grew well, presented fibroblast-like growth. No significant change in cell morphology was detected within passage 15. The results from immunohistochemistry showed that cells were positive for CD29, CD44, CD105, but negative for CD34, CD45. Flow cytometry results have shown that cells were positive for CD29, CD44, CD105, MHC-Ⅰ, but negative for CD3, CD14, CD19, CD31, CD33, CD34, CD45, CD106, CD117, CD184. Results have suggested that ADSCs can be abundantly harvested and have stable proliferation in poorly differentiated status in vitro. Stem cell-related antigens were highly expressed in ADSCs. Cai Z, Pan B, Lin L, Jiang HY, Zhuang HX. Biological characteristics and phenotypes of adipose tissue-derived stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(36): 6685-6688. [https://www.wendangku.net/doc/d717619519.html, https://www.wendangku.net/doc/d717619519.html,] 摘要 背景：研究证实脂肪组织提取物中存在脂肪来源的干细胞，并表现出多向分化的潜能，但是关于其体外的生物学特性研究不够深入，其细胞表型的研究结果存在一定争议。 目的：观察脂肪来源的干细胞的生物学特性与细胞免疫表型。 方法：取吸脂手术中废弃的人脂肪组织，胶原酶消化法获得脂肪来源的干细胞，体外传代培养，并进行细胞形态学观察，细胞生长曲线测定，免疫组织化学及流式细胞仪检测其细胞表型。 结果与结论：脂肪来源的干细胞生长旺盛，呈成纤维细胞样生长，15代以内细胞形态未见明显变化；免疫组织化学染色显示，细胞表面标记CD29，CD44，CD105表达阳性，CD34，CD45表达阴性；流式细胞仪检测显示，CD29，CD44，CD105，MHC-Ⅰ为阳性，CD3，CD14，CD19，CD31，CD33，CD34，CD45，CD106，CD117，CD184为阴性。结果说明脂肪来源的干细胞体外生长能力旺盛，高表达干细胞相关抗原，可长期传代且保持低分化状态。 关键词：表型；脂肪来源的干细胞；流式细胞仪；生物学特性；干细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.36.008 蔡震，潘博，林琳，蒋海越，庄洪兴.脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(36):6685-6688. [https://www.wendangku.net/doc/d717619519.html, https://www.wendangku.net/doc/d717619519.html,] 0 引言 间充质干细胞是一群存在于身体各个组织内较原始的细胞，具有自我更新及多向分化潜能[1]，基于这些能力，间充质干细胞在其临床应用上有很大的潜力。自2001年Zuk证实了经吸脂术获得的脂肪组织中存在具有多向分化潜能的细胞群后[2]，脂肪来源的干细胞(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)的概念得以明确，ADSCs因为其取材容易也被广泛研究。有研究表明ADSCs在体外培养中能迅速增长，累积细胞倍增数在第13代时仍无明显的下降趋势；更为重要的是细胞传至第10代时，仅有5%的细胞进入了细胞衰老期。因此ADSCs可以作为组织工程的种子细胞，成为具有广阔治疗应用前景。关于ADSCs的细胞表型研究，目前的研究结果没有得到统一的认定。本课题通过对ADSCs进行体外培养及对其体外生长的生物学性状及其细胞免疫表型做初步研究，为以后深入进行细胞组织工程的应用研究奠定了实验室基础。 1 材料和方法 设计：细胞体外培养与鉴定。 时间及地点：于2008-01/2008-06在中国医学科学院整形外科医院中心实验室完成。 材料： 实验标本：来自中国医学科学院整形外科医
细胞表型实验
细胞表型实验 前提：设计实验组和对照组 目的：研究肿瘤细胞表型特征或在特定情况下（相关基因或蛋白改变）肿瘤细胞的表型变化。内容：细胞凋亡、周期、迁移、侵袭、迁移、趋化、增殖、生长等。 1.细胞凋亡 ?概念：是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程。 ?实验方法：检测试剂盒和细胞流式。 ?注意点：进行细胞凋亡实验时，要用不含EDTA的胰酶进行消化。 磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可以从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境。Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin V进行荧光素FITC标记可以用流式细胞仪进行检测。胰酶中的EDTA能够螯合钙离子，从而削弱Annexin V结合效率，对凋亡实验造成不可控影响。因此实验时，需要另外购买不含EDTA的胰酶，不能直接使用实验室现有的胰酶。 2.细胞迁移 ?目的：测定肿瘤细胞的运动特性方法之一。 ?原理：体外培养单层细胞，人为制造空白区域——“划痕”，细胞逐渐进入空白区使划痕愈合。 ?实验方法： 1）培养板接种细胞之前先用marker笔在培养板背面画横线标记（方便定位同一个视野）。2）Day1, 种板，数量以贴壁后铺满板底为宜（也可在划痕前做其它处理如转染、感染）。3）Day2，细胞铺满板底后，用10ul枪头比着直尺，垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。 4）用PBS冲洗孔板三次，去除划痕产生的细胞碎片，加入有血清/无血清培养基。 注意点： ?根据不同细胞系的贴壁情况，选择是否立刻用PBS清洗。例如转染后的huh7细胞 系划痕后易飘起。 ?关于有血清/无血清培养基的选择：当划痕实验周期比较短的时候（小于48h），或 者不考虑增殖对实验造成的影响，可以用有血清培养基培养。当划痕实验周期比较 长的时候，用无血清或者低血清或者用放线菌酮抑制细胞增殖。 5）将培养板放入培养箱培养，每隔8-12小时（至少一天2次）取出拍照。 例如RBE细胞隔6小时拍照，拍照间隔和拍照时间要根据不同细胞系决定。 6）根据收集的图片，分析实验结果，将实验结果量化。 Note：用AI量化结果，建议比较划痕间的距离而非面积。 3.细胞生长和增殖 克隆形成 ?克隆的概念：单个细胞在体外增殖6代以上（>1week），其细胞形成的细胞群体。 ?目的：克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。（贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。） ?实验方法：