无菌检查的方法学验证
无菌检查方法（中国药典2010版）验证方案
验证方案编号：
起草单位(Composed by)：质检部(QC Department)
起草人(Composer)：日期(Date)：
审核人(Reviewed by QC)：日期(Date)：
审核人(Reviewed by QA)：日期(Date)：
批准人(Approved by)：日期(Date)：
目录
1. 验证目的
2. 验证人员
3. 验证依据及参考文件
4. 仪器与设备
5. 验证过程
5.1 培养基及稀释液5.2 菌液的培养与制备
5.3 方法验证试验
6. 验证总结
1. 验证目的：
本试验是注射液的抑细菌、抑真菌活性及所用的无菌检查方法的可靠性进行验证，以确认该产品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除至可以忽略。即：保证所用的无菌检验方法能对该产品进行准确、可靠的检验。
2. 验证人员：
验证小组组长：
验证小组副组长：
验证小组成员：
3. 验证依据及参考文件：
验证依据：中华人民共和国药典2010版二部
参考文件：2010年版中国药典无菌检查方法、验证操作学习班讲稿汇编（中国药品检验所）
4. 仪器与设备
XG1.DM-0.36B型机动门脉冲真空灭菌器
细菌培养箱
霉菌培养箱
净化工作台
5. 验证过程：
5.1 培养基及稀释液
5.1.1 培养基及稀释液的配制
按“中国药典2010版二部附录Ⅺ H无菌检查法”中，有关规定配制本验证所需培养基:
5.1.2培养基的适用性检验
5.1.2.1 培养基无菌性检查
从以上培养基及稀释液中，每批随机取5支（瓶），培养14天，应无菌生长。
结果记录：
结论：
5.1.2.2 培养基灵敏度检查
取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天，逐日观察结果。
取每支装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天，逐日观察结果。
空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，则可判该培养基的灵敏度检查符合规定。
较差记为“差”。
记为“差”。
结论：
5.2 菌液的培养与制备
5.2.1 菌种
5.2.2菌液制备
接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时。用0.9％无菌NaCl溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。取肉汤培养物1ml＋9ml0.9％无菌NaCl溶液，十倍稀释至10－5～10－7稀释级可得约为50～100cfu/ml的菌悬液。用营养琼脂培养基做活菌计数备用。
接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时。用0.9％无菌NaCl溶液稀释至10－5～10－7稀释级制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23~28℃培养24~48小时。用0.9％无菌NaCl溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。取改良马丁培养物1ml＋9ml0.9％无菌NaCl溶液，十倍稀释至10－5～10－7稀释级可得约为50～100cfu/ml的菌悬液。用改良马丁琼脂培养基做活菌计数备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌NaCl溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌NaCl溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。取培养物1ml＋9ml0.9％无菌NaCl溶液（含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80）十倍稀释至10－4稀释级可得约为50～100cfu/ml的孢子悬液。用改良马丁琼脂培养基做活菌计数备用。菌液制备后在常温下放置，并在2小时内使用。若保存在2-8℃，可在24小时使用。
结论：
5.3 方法验证试验
按中国药典2010版二部规定，根据下表中预定检验方案，将规定量的注射液供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中分别加入小于100cfu 的试验菌之一，过滤。取出滤膜接种至相应培养基中（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌接种于硫乙醇酸盐流体培养基中；白色念珠菌、黑曲霉接种于改良马丁培养基中）。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量的相应试验菌，作为对照。按规定温度培养3～5天，观察各试验管生长情况。各试验菌同法操作。
与对照管（只加阳性菌）相比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则该供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，可以照此检查法进行该产品的日常无菌检查。
如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则该供试品的该检验量在该试验条件下有抑菌作用，可逐一采用以下方法消除或减小该供试品的抑菌性并重新进行方法验证：
（1）增加冲洗量
（2）增加培养基的用量
（3）使用中和剂或灭活剂
（4）更换滤膜品种
同法每个注射液产品至少平行测定三次。
结论：6. 验证总结：
无菌检验方法验证方案
浙江红雨医药用品有限公司 无菌检验方法 验证方案 验证方案申请人: 日期: 年月日验证方案审核人: 日期: 年月日验证方案审批人: 日期: 年月日
1. 概述： 无菌检查法是为了检查药典要求无菌的医疗器械产品是否无菌而建立的检查法，是作为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。它是根据用于实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性，液体培养基变浑浊一般表明样品受微生物的污染。基于微生物污染的不均匀性，使无菌检查法结果的可信度受许多因素制约，如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量、操作环境、无菌技术等。检验方法的验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组成部分，是保证检验结果的公正、科学、准确的基础。 2. 验证目的： 验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 3. 验证范围： 适用于创可贴无菌检查法的验证。 4.验证人员及职责 5. 文件准备和培训 检查验证所需的各类文件资料，应齐全；相关的文件草案是否已具备。 6. 验证条件 6.1. 仪表量器经过校验合格，且在有效期内。 6.2. 供试品：随机抽取浙江红雨医药有司生产的3个批次医用无菌创可贴
6.3. 培养基及试剂： 6.3.1. 试剂试液： 0.9%氯化钠、氯化钠—蛋白胨缓冲液，配制记录见附件1 6.3.2. 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20140221-00 改良马丁培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20131118-00 营养琼脂培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20150428-03 改良马丁琼脂培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20140322-00 蛋白胨生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20140417-00 培养基配制记录见附件2。 6.4. 验证用菌株： 金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】 铜绿假单胞菌【CMCC（B）10104】 枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】 生孢梭菌【CMCC（B）64941】 白色念珠菌【CMCC（F）98001】 黑曲霉【CMCC（F）98003】 标准菌株购自：浙江省食品药品检验研究中心 各验证用菌种传代记录见附件3。 6.5. 无菌检验仪器及相关设备： 压力蒸汽灭菌器 型号：YXQ-LS-50S11 生产厂家：上海博讯仪器有限公司 校验日期：2015-05-25 有效期：2016-05-24 生化培养箱（细菌培养） 型号：SPX-250 生产厂家：金坛市富华仪器有限公司 校验日期：2015-05-25 有效期：2016-05-24 生化培养箱（霉菌培养） 型号：SPX-250B 生产厂家：金坛市富华仪器有限公司 校验日期：2015-05-25 有效期：2016-05-24
无菌检查方法学验证
无菌检查方法学验证 1. 概述 将规定量的供试品按无菌检查法中的薄膜过滤法进行操作,并接种小于100cfu 的试验菌,同时设置阳性对照,按规定温度培养3~5 天,与各相应的阳性对照管比较: 如含供试品各管中的试验菌均生长良好,则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用,可按此法进行供试品的无菌检查;如含供试品的任一管中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量或使用中和剂等方法消除供试品的抑菌作用,并再重新进行验证试验。 2. 验证前提条件 供试品的选择原则:相同配方,不同规格的制品,选择其中装量最大的制品进行验证。种类相同,含量不同的制品,选择含量最高的制品进行验证。照此原则,多规格制 品按下表选择供试品进行验证。 3. 验证方法 3.1菌液制备 3.1.1细菌菌液制备程序 ①取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的冻干菌种管各一支，分别在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后，吸出滴入营养琼脂斜面上,使均匀分布，置30~35C培养18h~24h。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于营养琼脂培养基斜面上，于30~35C培养18h~24h o 同法操作,培养得第3代培养物。 ②取生抱梭菌的冻干菌种管一支,在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养 肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入胃酶肉肝疱斜面上,使均匀分布,置30~35C培养18h~24h o用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于胃酶肉肝疱斜
面上，于30~ 35°C培养18h~24h。取生抱梭菌的第二代新鲜培养物至硫乙醇酸盐流 体培养基中,30~35C培养18h~24h,得第3代培养物。 ③分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的第3代营养琼脂斜面新鲜培养物，用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中,用电动混合器混合20s或在手掌上振敲80次,以使细菌悬浮均匀,得初步菌悬液。 ④取初步制成的上述菌悬液和生抱梭菌第3代新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度，即得每1ml含菌数小于100cfu验证细菌菌液。 3.1.2抱子悬液制备程序 ①取白色念珠菌和黑曲霉的冻干菌种管各一支,分别在无菌操作下打开,以毛细 吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入改良马丁琼脂斜面上，使均匀分布，置23~28C培养5~7天。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于改良马丁琼脂斜面上,同上述条件培养得第2代培养物。取第2代培养物,同法操作,得第3代培养物。 ②用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml0.9%无菌氯化钠溶液加入上述第三代新鲜斜 面试管内,反复吹吸,洗脱抱子,用管口带有薄的无菌棉花或纱布的毛细吸管吸出抱子悬液至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度,即得每1ml含菌数小于100cfu验证抱子悬液。 3.2 薄膜过滤 3.2.1 供试品试验组 取规定量供试品,按《无菌检查标准操作细则》薄膜过滤后,如为不含防腐剂供试品，则往其中一只滤筒内接入100ml改良马丁培养基，往另一只滤筒内各接入100ml 的硫乙醇酸盐流体培养基,用5ml灭菌注射器抽取1ml验证菌液，从集菌培养器胶管处注入培养基中;如为含防腐剂供试品,则待供试品过滤完后,连续 3 次用
托拉塞米注射液无菌方法学验证
托拉塞米注射液无菌方法学验证 作者：苏有艳 来源：《维吾尔医药》2013年第05期 摘要：目的：建立托拉塞米注射液无菌检查法。方法：采用薄膜过滤法，探索此药物的无菌检查法。结果：在该实验条件下6种菌株均能够正常生长。结论：本品可采用薄膜过滤法进行无菌检验且结果准确可靠。 关键词：托拉塞米注射液；无菌检查法；方法学验证 托拉塞米为磺酰脲吡啶类利尿药，其作用于亨利氏髓袢升支粗段，抑制Na+/K+/2Cl-载体系统，使尿中Na+/K+/2Cl-和水的排泄增加，但对肾小球滤过率，肾血浆流量或体内酸碱平衡无显著影响。当建立药品的无菌检查时应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。 1 材料与仪器 1.1 试验样品 托拉塞米注射液（规格：2ml：10mg，批号：20110211，20110212，20110213，数量：160支/批，浙江诚意药业有限公司） 1.2试验用菌株 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，以上均由中检所提供的第二代菌种。 1.3试验用培养基 营养琼脂培养基（批号 120503）、玫瑰红钠琼脂（批号 120412）、硫乙醇酸盐硫体培养基（批号 1202222）、改良马丁培养基（批号 120131），0.1%蛋白胨水溶液（批号120118），以上培养基均由中国药品生物制品检定所提供。 1.4仪器 SW-CJ-1CU型洁净工作台（苏州泰安空气技术有限公司）、HTY-2000A型智能集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司）、一次性全封闭集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）、301-1型电热培养箱（上海浦东跃欣科学仪器有限公司）、MJ-180B型霉菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）。
无菌检验验证方案样本
类别：编号: 部门：页码: 无菌检验方法验证 版次：□新订口替代: ________________ 制定人: ___________________ ____________ H H 日审批会签: _____________________________________________
1.1 确认所用的检查方法适用于一次性活检钳的无菌检查。 1.2 确认检查结果的准确性、可靠性、重复性和可操作性及检查方法的完整 性。 2. 验证范围 适用于我公司生产的一次性活检钳无菌检验。 3. 检验依据 《中国药典》附录无菌检查法 ISO11737-2: 医疗器械的灭菌微生物学方法第一部分: 确认灭菌过程的无菌试验 GB/T14233.2- 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分: 生物学试验方法 4. 验证器材 4.1 检验环境: 无菌检查应在环境洁净度10000 级下的局部100 级的单向流空气 区域内进行操作。 4.2 设备: 医用净化工作台、生物安全柜、无菌检查膜过滤器、电动吸引器、 电热干燥箱、霉菌培养箱、数显生化培养箱、压力蒸汽灭菌器、电子天平、pH 计、冰箱、恒温水浴锅、显微镜等。 4.3 培养基及稀释液: 硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、pH7.0 氯化钠- 蛋白胨缓冲液、0.1% 蛋白胨水溶液、营养琼脂。 4.4其它实验材料：微孔滤膜（孔径w 0.45um,直径约50mm）、无菌过滤杯、无 菌剪刀、无菌镊子、无菌钳子、无菌手套、吸管（1ml和10ml）、酒精灯、三角烧瓶、接种环、培养皿。
5.1 原理: 活检钳的形状为不溶物, 为微生物转移更彻底, 特选用无菌检查法中的 薄膜过滤法。 5.2 设备器材: 验证中所用器材、设备已经过国家计量单位鉴定合格并有鉴定证书。 5.3 培养基: 验证中所用培养基以经过培养基灵敏度实验检测合格。 5.4 操作步骤: 5.4.1 供试品的取样按照GB/T 2828.1- 相关规定进行逐批取样。 5.4.2 将所需物品, 供试品表面消毒, 经过传递窗, 紫外线照射半小时. 无菌室紫 外线消毒半小时。 5.4.3 操作人员用洗手液、自来水清洗双手, 关闭紫外灯, 换拖鞋, 脱外衣放入衣 柜, 穿洁净白大衣, 进入缓冲间, 再用洗手液、纯化水清洗双手, 用75% 乙醇对手进行消毒, 穿戴无菌衣、帽、口罩、手套等。 5.4.4 进入菌检室, 打开医用洁净工作台风机, 运行至少15分钟以上。 5.4.5 将所需物品由传递窗取出, 两只消毒液桶分别放置于菌检洁净工作台一侧, 其余物品放置于传递窗一侧的方形桌上, 剥去牛皮纸外包装。 5.4.6 医用洁净工作台内点燃酒精灯。打开3个养琼脂平板, 置于医用洁净工作 台的不同位置。 5.4.7 取供试品, 在医用洁净工作台内, 打开包装袋, 小心将供试品取出, 将其剪成 约10cm的小段，浸入500ml 0.1%无菌蛋白胨水溶液中，充分振摇作为供 试液。 5.4.8 将供试液平均转入三个薄膜过滤器的滤杯中, 开启电动吸引器开关进 行过滤，用pH7.0蛋白胨-氯化钠缓冲液每次100ml冲洗滤膜三次，用平口镊子夹取滤膜（过程保持滤膜的完整性） , 一张转移到100ml 改
无菌检查方法验证方案
安徽捷众生物化学有限公司 无菌检查方法（薄膜过滤法） 验证方案 文件编号：QY·TS·05·007-00
无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案QY·TS·05·007-00 第1 页/共11页批准日期：年月日实施日期年月日
无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案QY·TS·05·007-00 第1 页/共11页分发单位： 备注：
安徽捷众生物化学有限公司 无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案 目录 1．验证目的 2. 验证频次 3. 验证操作内容与要求 3.1. 验证操作试验 3.2 试验菌要求 3.3.验证方法步骤 3.4. 验证准备 3.5验证试验操作 4．验证结果评价分析 5．附件
安徽捷众生物化学有限公司 无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案编号QY·TS·05·007-00 页数共11 页 制定人制定日期年月日修订日期年月日审核人审核日期年月日颁发部门质量管理部批准人批准日期年月日生效日期年月日分发部门相关部门 1．验证目的 确认所采用的方法适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性，以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。 2. 验证频次 2.1. 建立药品的无菌检查法时 2.2. 修订检验方法时 2.3. 供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时 3. 验证操作内容与要求： 3.1. 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定要求进行验证操作试验： 3.1.1. 对每一试验菌应逐一进行验证。 3.1.2. 硫乙醇酸盐流体培养基—金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生 孢梭菌。 3.1.3. 改良马丁琼脂培养基—白色念珠菌、黑曲霉。 3.2 试验菌要求： 3.2.1验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保 证试验菌株的生物学特性。
2015版药典微生物限度微生物无菌方法学验证流程
微生物限度/无菌方法学验证流程 1.：提交单位购买申请菌种的购买：需要1.5个月 单位介绍信证明工作用途等文件，并向中检院网站提交申请，接到申请后一个月后中检院会把有的菌种邮寄到使用单位，中检院菌种经常缺货并不是很齐全，不能一次买齐所需要的8种菌一次性买齐， 2.每种从菌复活、分离、纯化复壮：共需要30天 药典规定进行药品检验所需8种标准阳性菌，购买中检院冻干菌粉后进行复活与保藏1大肠埃希菌 2金黄色葡萄球菌 3枯草芽孢杆菌 4生孢梭菌 5铜绿假单胞菌 6沙门菌 （细菌每种冻干菌粉复活到分离纯化保藏各需要3-4天时间） 7白色念珠菌 8黑曲霉菌 （霉菌酵母菌冻干菌粉从复活到分离纯化制备孢子菌悬液需要至少7天时间） 3.培养基适用性/灵敏度验证：需要60-80天 实验中使用的培养基需要进行与中检院提供的标准培养基进行培养基适用性验证 每种培养基不同批号之间也需要进行验证之后方可以进行微生物检验用 药检室现有培养基种类20余种，每种培养基验证需要3-4天，完成所有培养基适用性验证需要60-80天。
恩替卡韦分散片微生物限度方法学适用性验证： 1.回收率验证：回收率验证实验共需要26天 （若回收率达不到药典规定需要重新选用另一种方法进行验证） 五种实验菌分别验证 1金黄色葡萄球菌 2铜绿假单胞菌 3枯草芽孢杆菌 4白色念珠菌 5黑曲霉菌 五种阳性菌的回收率验证需使标准阳性菌回收率在阳性对照组计数达到50％-200％之间 假设验证一次成功 3种细菌回收率各需要4天时间，2霉菌酵母菌各需要7天时间 2.控制菌适用性验证：共需要20天 大肠埃希菌控制菌方法：需要5天时间 其他制剂含药材原粉的中药制剂需要检查沙门菌、耐胆盐革兰式阴性菌各需要7天时间共1周实验室消毒实验用具灭菌，实验细菌培养物灭活处理，实验用具洗涮等 方法学验证一次顺利完成共需要46天，验证方法过程需要重复一遍作为方法学适用性确认 复方茵陈注射液无菌方法学适用性验证： 1.方法适用性验证：验证实验共需要30天 （若回收率失败或达不到药典规定回收率需要重新选用方法进行验证） 五种实验菌分别验证 1金黄色葡萄球菌 2大肠埃希菌菌 3枯草芽孢杆菌 4生孢梭菌 5白色念珠菌 6黑曲霉菌 6种实验组阳性菌需与对照管组进行对照,含供试品的实验菌均生长良好则说明方法可行 假设验证一次成功 每种菌分别按规定温度培养，培养时间不得超过5天 实验室消毒实验用具灭菌，实验细菌培养物灭活处理，实验用具洗涮等， 方法学验证一次顺利完成共需要30余天，验证方法过程需要重复一遍作为方法学适用性确认
无菌检验验证方案
类别：编号： 部门：页码： 无菌检验方法验证 版次：□新订□替代: 制定人: 年月日审批会签: 批准人：年月日生效日期：年月日
1.验证目的 1.1确认所用的检查方法适用于一次性活检钳的无菌检查。 1.2确认检查结果的准确性、可靠性、重复性和可操作性及检查方法的完整性。 2.验证范围 适用于我公司生产的一次性活检钳无菌检验。 3.检验依据 《中国药典》2010版附录无菌检查法 ISO11737-2:2009 医疗器械的灭菌微生物学方法第一部分：确认灭菌过程的无菌试验 GB/ 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法 4.验证器材 检验环境：无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部100级的单向流空气区域内进行操作。 设备：医用净化工作台、生物安全柜、无菌检查膜过滤器、电动吸引器、电热干燥箱、霉菌培养箱、数显生化培养箱、压力蒸汽灭菌器、电子天平、pH计、冰箱、恒温水浴锅、显微镜等。 培养基及稀释液：硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、氯化钠-蛋白胨缓冲液、%蛋白胨水溶液、营养琼脂。 其他实验材料：微孔滤膜（孔径≤，直径约50mm）、无菌过滤杯、无菌剪刀、无菌镊子、无菌钳子、无菌手套、吸管（1ml和10ml）、酒精灯、三角烧瓶、接种环、培养皿。 5.验证方案 原理：活检钳的形状为不溶物，为微生物转移更彻底，特选用无菌检查法中的薄膜过滤法。 设备器材：验证中所用器材、设备已通过国家计量单位鉴定合格并有鉴定证书。 培养基：验证中所用培养基以通过培养基灵敏度实验检测合格。 操作步骤： 供试品的取样按照GB/T 相关规定进行逐批取样。 将所需物品，供试品表面消毒，通过传递窗，紫外线照射半小时.无菌室紫外线消毒半小时。 操作人员用洗手液、自来水清洗双手，关闭紫外灯，换拖鞋，脱外衣放入衣柜，穿洁净白大衣，进入缓冲间，再用洗手液、纯化水清洗双手，用75%乙醇对手进行消毒，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套等。
无菌试验方法验证方案
一次性使用无菌医疗器械无菌试验 方法验证方案 编制：日期： 审核：日期： 批准：日期：
1.验证目的 通过实验验证检测方法的适用性及培养基的适用性、无菌性、灵敏度。 2.样品信息 3.实验设备及器材 3.1使用仪器及器具：大试管、灭菌锅、洁净工作台、生物安全柜、电子天平、电热恒温培养箱、霉菌培养箱。 3.2使用材料及菌种：硫乙醇酸盐液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、生饱梭菌、白色念珠菌、大肠埃希菌。 4.验证组成员及职责 姓名部门职责 品质部组长：负责验证方案的审核、核准并负责验证报告的核准 品质部负责验证方案、验证报告的起草并组织实施 品质部负责验证过程中现场的监控及验证实施和试验过程的操作 5.验证依据 《中国药典》2015版和GB/14233.2-2005 6.验证步骤 6.1检测设备计量有效性验证 确认以下设备经过校量并在有效期内 设备名称是否校验是否在有效期内备注 灭菌锅 洁净工作台 生物安全柜 电子天平
电热恒温箱 霉菌培养箱 确认人/日期：审核/日期： 6.2培养基适用性检查 6.2.1无菌性检查：取每种每批培养基5支（瓶），培养14天，应无菌生长。检查结果见表1。 表1
6.2.2灵敏度检查 6.2.2.1菌液制备方法描述 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或者胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃-35℃培养18-24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或者沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20℃-25℃培养24-48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20℃-25℃培养5-7天，加入3-5ml含0.5%（ml/ml）聚山梨酯80无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2℃-8℃，可在24小时内使用。 6.2.2.2培养基接种 取每管将量为12ml的硫乙醇酸盐液体培养基7支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生饱梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。 6.2.2.3结果判断，空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该批培养基的灵敏度检查符合规定。 6.2.2.4试验结果见表2 表2 培养基试验液是否长菌菌生长情况培养条件判定 硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球 菌1ml 1. 30℃-35℃培 养3天 2. 铜绿假单胞菌 1ml 1. 2. 生饱杆菌1ml 1. 2. 空白对照 胰酪大豆胨枯草芽孢杆菌 1.20℃-25℃培
盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液无菌检查方法学验证
盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液无菌检查方法学验证 [摘要] 目的对盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液的无菌检查方法 进行探讨，建立其无菌检查方法。方法按《中国药典》（2010年版）附录?h无菌检查方法进行。结果在验证条件下，该方法能消除对微生物生长的抑制作用。结论可以采用此法对本品的无菌进行检查。 [关键词] 盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液；无菌检查方法；薄膜过滤法 [中图分类号] r-331 [文献标识码] b [文章编号] 2095-0616（2013）13-95-02 study of sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection wu yulan ji haicheng jiangsu hansoh pharmaceutical co.ltd.，lianyungang 222000，china [abstract] objective to discuss and establish the sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection. methods the test were done according to appendix xih-sterile examination method in”chinese pharmacopeia”（2010 edition）. results the method could eliminate the inhibition of microbe growth under the validation condition. conclusion this method can be used for
医疗器械无菌检验方法验证方案
**********有限公司 无菌检验方法 验证方案 验证方案申请人: 日期: 年月日验证方案审核人: 日期: 年月日验证方案审批人: 日期: 年月日
1. 概述： 无菌检查法是为了检查药典要求无菌的医疗器械产品是否无菌而建立的检查法，是作为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。它是根据用于实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性，液体培养基变浑浊一般表明样品受微生物的污染。基于微生物污染的不均匀性，使无菌检查法结果的可信度受许多因素制约，如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量、操作环境、无菌技术等。检验方法的验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组成部分，是保证检验结果的公正、科学、准确的基础。 2. 验证目的： 验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 3. 验证范围： 适用于医用纱布无菌检查法的验证。 4.验证人员及职责 5. 文件准备和培训 检查验证所需的各类文件资料，应齐全；相关的文件草案是否已具备。 6. 验证条件
6.1. 仪表量器经过校验合格，且在有效期内。 6.2. 供试品：随机抽取*******医药有司生产的3个批次医用无菌医用纱布6.3. 培养基及试剂： 6.3.1. 试剂试液： 0.9%氯化钠、氯化钠—蛋白胨缓冲液，配制记录见附件1 6.3.2. 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基生产厂家：批号： 改良马丁培养基生产厂家：批号： 营养琼脂培养基生产厂家：批号： 改良马丁琼脂培养基生产厂家：批号： 蛋白胨生产厂家：批号： 培养基配制记录见附件2。 6.4. 验证用菌株： 金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】 铜绿假单胞菌【CMCC（B）10104】 枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】 生孢梭菌【CMCC（B）64941】 白色念珠菌【CMCC（F）98001】 黑曲霉【CMCC（F）98003】 标准菌株购自：浙江省食品药品检验研究中心 各验证用菌种传代记录见附件3。 6.5. 无菌检验仪器及相关设备： 压力蒸汽灭菌器 型号：生产厂家： 校验日期：有效期： 生化培养箱（细菌培养） 型号：生产厂家：
无菌检查方法的验证
无菌检查方法的验证 无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法，是作为无菌产品批放行的重要依据及药监部门对无菌产品质量监管的一个重要项目。因此如何确保无菌检查方法的准确可靠至关重要，而检查方法的验证是保证检查结果的公正、科学和准确的基础，因此各个主要国家的GMP或药典都对无菌检查方法的验证提出了严格的要求，2010版中国药典对分析方法验证和检查的要求也有大幅度的提高，同时也是GMP检查中检查的重点和容易发现问题的区域。 验证要求与方法 无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。 前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。 再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。 通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。 这里，验证的重点环节包括： 前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。 供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。 具体的验证方法如下： 菌种的选择 无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌[CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌[CMCC(F)98 003]代表霉菌。 菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，
无菌检查方法验证告报告2015
编号：FAL-YZ-003.1 无菌检查方法 验证报告 科技发展
目录
无菌检查方法验证报告 1.目的 通过对培养基无菌性检查、灵敏度检查，对产品的无菌检查方法适用性进行试验，证明该方法适用于产品无菌检查日常检测。 2.围 适用于本公司产品的无菌检查方法的建立和确认。 3．依据 中国药典（2015年版） GB/T14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学实验方法 4. 职责权限 5. 验证方法 实验前的准备 a仪器设备
b操作环境 微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 c稀释液和试剂： PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 d器具无菌注射器仪液器 YT－603集菌仪 5.1培养基的适用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及胰胳大豆胨肉汤培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。 培养基：硫乙醇酸盐批号20140408 生产厂家：日水生物技术 胰胳大豆胨肉汤培养基批号20151023 生产厂家：尼赛欣合生物技术
5.1.1无菌性检查：每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养 14 天，应无菌生长。 5.1.2灵敏度检查 菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第 0 代），试验用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕 白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕 黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕 5.1.3菌液制备 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉微生物培养基质控品,使用前注入1.1ml稀释液充分溶解后,在漩涡混合器上震荡混匀,制成10-100 cfu/0.1ml菌悬液,3-5天用完。 5.1.4培养基接种取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100 cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2 支，另1支不接种作为空白对照，培养3 天；取每管装量为9ml的胰胳大豆胨肉汤培养基7支,分别接种小于100 cfu 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 支，另1 支不接种作为空白对照，培养5 天。逐日观察结果。 5.1.5结果判定空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该
无菌检测方法
四川乐至贵均卫生材料有限公司医疗器械产品无菌检测方法
1.目的 建立无菌检测标准规程，对灭菌后的医疗器械产品进行无菌检测，以确定灭菌的有效性。 2.范围 本规程适用于本公司对医疗器械产品的无菌检测。 3.依据 《中国药典》2015版 4.设备、器皿、药品的准备 4.1 设备的准备 电子天平、干热灭菌箱、高压灭菌箱、洁净工作台、放大镜、移液枪、电热培养箱、霉菌培养箱、冰箱、斜口钳、接种环、酒精灯 4.2 器皿的准备 锥心瓶（500ml）、烧杯（1000ml）、试剂瓶（60ml）、量筒（50ml、1000ml）、培养皿（Ф90mm ×15mm）、斜口钳、玻璃棒。 4.3 药品的准备 硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、纯化水、pH7.0 无菌氯化钠溶液。 5.器皿的清洗 将所需的锥形瓶、烧杯、试剂瓶、培养皿、玻璃棒放入超声波清洗机中用纯化水清洗两次，每次15分钟，将清洗完的器皿在180℃条件下进行干热灭菌2小时。 6.取样 按灭菌批次或者生产批次进行取样，随机抽取同一型号的产品4件作无菌检测样品7.培养基的制备 7.1 硫乙醇酸盐流体培养基的制备 取15g硫乙醇酸盐流体培养基和1000ml纯化水于烧杯中混合，加热至微沸（注意加热过程中要不断地搅拌，使其混合均匀）用棉花塞塞紧复用无尘布和绳子绑好后转移至高压灭菌锅内灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间30分钟。灭菌后摇均，冷却至45℃待用。 7.2 胰酪大豆胨液体培养基的制备 取15g胰酪大豆胨和1000ml纯化水于烧杯中混合，操作方法同6.1。 8. 培养基灵敏度检查 8.1 菌种的要求
培养基灵敏度检查所用的菌株（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）传代次数不得超过5代。 8.2 菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基上，30-35℃培养24小时；接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基上，20-25℃培养24小时。 将上述经24小时培养后的培养物用0.9﹪无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu(菌落形成单位)的菌悬液。制备好的菌液应在2-8℃条件下保存，并在24小时内使用。 8.3 接种及培养 取每管装量15ml的硫乙醇酸盐流体培养基3支，其中2支接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌，另一支不接种作为空白对照，30-35℃培养3天逐日观察并记录。 取每管装量10ml的胰酪大豆胨液体培养基3支，其中2支接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌，另1支不接种作为空白对照，20-25℃培养5天，逐日观察记录。 8.4 灵敏度检测结果判断 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基试管菌落均生长良好，则判定该培养基的灵敏度检查符合规定。 9. 供试品的无菌检测 9.1 对照试验 取每管装量15ml的硫乙醇酸盐流体培养基3支，接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌，另一支不接种作为空白对照，30-35℃培养14天逐日观察并记录。 取每管装量10ml的胰酪大豆胨液体培养基3支，其中2支接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌，另1支不接种作为空白对照，20-25℃培养14天，逐日观察记录。 9.2 供试品的准备及接种 于微生物实验室超净工作台内将样品剪成小碎段（2～3cm）,其中2件接种于各培养皿足以浸没供试品的适量硫乙醇酸盐流体培养基中，另外2件接种于各培养皿足以浸没供试品的适量胰酪大豆胨液体培养基中，冷却。 9.2 培养 将接种过的硫乙醇酸盐流体培养基的培养皿倒置于电热培养箱中30～35℃条件下培养14天，逐日观察是否有菌落生长并记录； 将接种过的胰酪大豆胨液体培养基的培养皿倒置于霉菌培养箱中20～25℃条件下培养14天，逐日观察是否有菌落生长并记录。
无菌方法学检查
无菌方法验证 品名：规格： 批号：检查时间： 1.培养基：硫乙醇酸盐流体培养基，批号：由：提供； 营养肉汤，批号：由：提供； 改良马丁培养基批号：由：提供。 2.验证试验用菌种： (1) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003]； (2) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]； (3) 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44102]； (4) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104] (5) 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]； (6) 白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]； (7) 黑曲霉菌(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]。 3. 仪器和滤器：zw-2008智能集菌仪zw-808a智能集菌仪 4.方法：中国药典2005版二部附录。 5.操作方法： 5.1 菌液制备： 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, ℃培养小时。 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、生孢梭菌肉汤培养物，加生理盐水，10倍递增稀释至约10-5~10-8之间，其中金黄色葡萄球菌取 稀释级，铜绿假单孢菌取稀释级，大肠埃希菌取稀释级，枯草芽孢杆菌取 稀释级，生孢梭菌取稀释级。 白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中, ℃培养小时。 再取白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生理盐水洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，取加生理盐水，10倍递增稀释至，取加生理盐水，混匀备用。 将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁培养基上，℃培养，使大量的孢子成熟。再取黑曲霉真菌斜面培养物，加入生理盐水洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，稀释至，取加生理盐水混匀备用。 5.2 菌液计数：分别取上述5种细菌菌液加入硫乙醇酸盐流体培养基中，每种菌液做平行管。℃培养。分别取上述2种真菌菌液加入改良马丁培养基中，每种菌液做平行管。℃培养。细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。
无菌检查方法学验证
无菌检查方法学验证 1．概述 将规定量的供试品按无菌检查法中的薄膜过滤法进行操作，并接种小于100cfu的试验菌，同时设置阳性对照，按规定温度培养3～5天，与各相应的阳性对照管比较：如含供试品各管中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用，可按此法进行供试品的无菌检查；如含供试品的任一管中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量或使用中和剂等方法消除供试品的抑菌作用，并再重新进行验证试验。 2．验证前提条件 供试品的选择原则：相同配方，不同规格的制品，选择其中装量最大的制品进行验证。种类相同，含量不同的制品，选择含量最高的制品进行验证。照此原则，多规格制品按下表选择供试品进行验证。 3. 验证方法 3.1菌液制备 3.1.1细菌菌液制备程序 ①取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的冻干菌种管各一支，分别在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散后，吸出滴入营养琼脂斜面上，使均匀分布，置30～35℃培养18h～24h。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于营养琼脂培养基斜面上，于30～35℃培养18h～24h。同法操作，培养得第3代培养物。 ②取生孢梭菌的冻干菌种管一支，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散后，吸出滴入胃酶肉肝疱斜面上，使均匀分布，置30～35℃培养18h～24h。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于胃酶肉肝疱斜面上，于30～35℃培养18h～24h。取生孢梭菌的第二代新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18h～24h，得第3代培养物。 ③分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的第3代营养琼脂斜面新鲜培养物，用5.0ml吸管吸取3.0ml～5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，以使细菌悬浮均匀，得初步菌悬液。
无菌检查方法验证方案
. 安徽捷众生物化学有限公司 无菌检查方法（薄膜过滤法） 验证方案 文件编号：QY·TS·05·007-00
. 批准日期：年月日实施日期年月日 . .
. . 分发单位： . . 安徽捷众生物化学有限公司 无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案 目录 1．验证目的 2. 验证频次
3. 验证操作内容与要求 3.1. 验证操作试验 3.2 试验菌要求验证方法步骤3.3.验证准备3. 4. 3.5验证试验操作．验证结果评价分析4．附件5 . . ．验证目的1确认所采用的方法适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性，以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。验证频次2. 建立药品的无菌检查法时2.1. 修订检验方法时2.2. 2.3. 供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时 3. 验证操作内容与要求： 3.1. 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定要求进行验证
操作试验：对每一试验菌应逐一进行验证。3.1.1. 硫乙醇酸盐流体培养基—金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生3.1.2. 孢梭菌。 3.1.3. 改良马丁琼脂培养基—白色念珠菌、黑曲霉。试验菌要求： 3.2 代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保验证试验所用的菌株传代次数不得超过3.2.15 证试验菌株的生物学特性。验证试验可在供试品的无菌检查之前或与供试品的无菌检查同时进行。当同时进3.2.2. . 行时，若验证试验失败，则供试品的无菌检查结果是不成立的 3.3验证方法步骤：.3.31验证试验的操作计划用3个不同批号产品按照无 菌检查方法（薄膜过滤法）进.行平行试验，通过计算回收率来判断无菌检查方法（薄膜过滤法）是否对产品有影响。 3.32试验结果可接受标准用无菌标准评价方法“0.9％氯化钠注射液(三层共挤膜.袋)的无菌检查”对检品中无菌检查试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组的回收率也不低于70%。 3.4. 验证准备：准备验证所需的供试品、培养基、试药试剂、仪器设备和菌种。 3.4.1. 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基；改良马丁琼脂培养基；营养琼脂培养基；血琼脂培养基备注： 3.4.1.1 培养基应注明来源；如采用市售干粉培养基，应按说明配制。 3.4.1.2 配制后的培养基应按照中国药典附录“无菌检查法”中“培养基的适用性检查”项下检验无菌性和灵敏度。 3.4.2 仪器设备 3.4.2.1. 净化工作台 3.4.2.2. 生物洁净安全柜 3.4.2.3. 集菌仪
无菌检查法-2015版中国药典-电子版
无菌检查法-2015版中国药典 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在环境洁净度B 级背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需气菌培养；胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。 1. 硫乙醇酸盐流体培养基 酪胨 (胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g L-胱氨酸 0.5g 新配制的 0.1% 刃天青溶液 1.0ml 硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.75g (或硫乙醇酸) （ 0.3 ml) 纯化水 1000ml 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH 值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培2养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。