凝胶复合体移植治疗椎间盘退变的实验研究
?２９８?东南大学学报（医学版）２０１０年６月，２９（３）
兰大白兔随机分为正常对照组、移植治疗组和缺损退变组，每组６只。穿刺制作椎间盘退行性变模型：在全麻下，兔右侧卧位，以横突为轴心，沿左侧第１２肋末向下至髂嵴上缘作纵切口，在骶棘肌和腰方肌外缘于胸腰筋膜前层间钝性分离。近腰方肌前内缘触及横突，剪开胸腰筋膜，用小指钝性分离腰大肌即可显露椎间盘。用２１号针头分别在Ｌ４．，、Ｌ５一。进行穿刺，抽吸出的髓核组织，每个椎间盘约抽吸出的髓核组织湿重约２—３ｍｇ，并立即在显微镜下观察以确定只有髓核组织ＭＪ。移植治疗组用预冷的微量注射器将ＢＭＳＣｓ—ＰｌｕｍｎｉｃＦ?１２７复合物２５仙ｌ注入缺损的椎间盘中心；缺损退变组注射磷酸缓冲液（ＰＢＳ）２５仙ｌ；正常对照组仅分离暴露椎间盘，不作任何处理。术后在每个相应椎间盘旁的横突上用黑色缝合线做标记，然后冲洗、止血，依次逐层关闭切口，肌肉注射青霉素４０万Ｕ，连续３ｄ以预防感染。
１．２．５ＭＩＲ成像ＭＩＲ成像水平扫描架内径１６ｃｍ，使用６１咖大鼠体部线圈。扫描采用Ｔｕｒｈ，ＲＡＲＥ他Ⅵ序列。扫描主要参数：ＦＯＶ
６０舢×４０Ｉ啪，ＴＲ／ｒＩＥ４２００ｍｓ／３６啪，层厚１．０ｍｍ，层间距０．５ｍｍ，ＦＡ１８００，Ｍａｔｒｉｘ２５６×２５６，空间最小分辩率为２３４ｕ皿×１５６Ⅳｎ／像素，总扫描时间约为１ｒｎｉｎ２０ｓ。
１．２．６疗效观察（１）影像学检查。术后８周耳缘静脉注射空气栓塞处死动物，迅速取出脊柱，进行ＭＩＲ成像。采用Ｂｒｕｋｅｒ７．ｏＴｍｉｃｒｏ—ＭＩＲ自带的ｐａｒａｖｉｓｉｏｎ４．Ｏ软件测量３组椎间盘的信号强度和邻近椎旁肌肉的信号强度，计算信噪比（ｓＮＲ，ｓｉｇｌｌａｌ—ｎｏｉｓｅｍｔｉｏ）以评估各组椎间盘退变水平和治疗效果。信噪比计算公式：ｓＮＲ＝ｓＬ／ｎｏｉｓｅ旧Ｊ，ｓＩ定义为椎间盘的信号强度，ｎｏｉｓｅ定义为椎旁肌肉信号强度的标准差。（２）病理学检查。ＭＩＲ扫描完毕，根据定位标记，取出相应椎间盘后置４％中性甲醛固定，石蜡包埋切片，片厚４斗ｍ，行Ⅱ胶原免疫组织化学染色、ＡＢ—ＰＡＳ染色。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果判断：髓核组织间质呈棕黄色为阳性。应用ｋｉｃａＱ５５０ＩＷ计算机图像分析系统及其软件（ｋｉｃａＱｗｉｎＰｒｏ．２．２）定量评价呈阳性免疫染色的椎间盘细胞间质的灰度值（灰度分级０～２５５级，０级为最深，２５５级为最浅），每只椎间盘取４张切片，每张切片随机采集４个高倍视野（×２００）进行测定，向同一个方向移动切片，不重叠，不重复。测得结果为视野内棕黄色的平均灰度值。（３）蛋白多糖含量测定。取出椎间盘髓核组织，放人５ｒＩｌｌ离心管中。加入３％ＮａＯＨ１．０ＩＩｌｌ，置于恒温振荡器中振荡处理。温度控制在４０℃，时间３ｈ。加ＨＣｌ４ｒｎｌ调整溶液的ｐＨ值至８—９。加入１％的胰蛋白酶１００一，置入恒温振荡器中振荡，温度控制在５０℃，酶解２ｈ。取酶解液１ｍｌ，采用上述间苯三酚分光光度法测定光密度值，转换为量值作蛋白多糖含量的测定。将吸光度（ＯＤ值）按标准曲线折算成浓度，测定出椎间盘中硫酸软骨素含量，结果以ｍｇ?（１０ｍ１）“表示。
１．２．７统计学处理用ＳＰＳＳ１６．０软件进行统计学分析，结果用元±ｓ表示。采用单因素方差分析Ｆ检验，组间两两比较采用ＳｔｕｄｅｎｔＮｅｗｍａｎＫｅｕｌｓ（Ｓ‘Ｎ—Ｋ）检验，Ｐ＜Ｏ．０５为差异有统计学意义。
２结果
２．１ＢＭＳＣｓ形态学观察
ＢＭｓＣｓ原代培养２４ｈ后大部分细胞贴壁，细胞较小，呈圆形或卵圆形；３～７ｄ细胞逐渐变为多角形或梭形，并有大小不一的集落形成；８～１０ｄ集落相互靠近，增殖速度加快；１１—１３ｄ细胞集落相互融合，相邻集落融合成片达８０％～９０％，细胞排列成漩涡状或栏栅状。传代后细胞呈长梭形，均匀的分布（图１）。
构建的ＢＭＳＣｓ—ＰｌｕｍｎｉｃＦ?１２７复合物室温下肉眼观察呈凝胶状，环境扫描电镜显示细胞呈圆形或椭圆形，在支架中均匀分布（图２）。
图ｌ兔ＢＭＳＣｓ培养至３代，细胞成较单一的梭形
ｎｇ１３ｒｄ萨耻礴６佃ｏｆｓｐｉｎｍｙｍｂ酗ｔＢＭＳＣｓ跏ｌ，ｉ咖×ｌ∞
图２兔ＢＭＳＣｓ呈椭圆形在ｎｕｍｎｉｃＦ－１２７支架中分布均匀Ｆｉｇ２ＭｏｒｐｈｏＩｏｇｉｃ砒ｃｈａ翰ｃｔｅｒｏｆｍｂＭｔ
ＢＭＳＣｓ
李果，等．ＢＭｓｃｓ—ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ一１２７水凝胶复合体移植治疗椎间盘退变的实验研究?２９９?
２．２影像学观察
８周末ＭＲＩ检查显示移植治疗组（图３ａ）与缺损退变组椎间盘（图３ｂ）都有不同程度的退变，与正常对照组（图３ｃ）相比在１２像上信号减弱，椎间隙高度变低。缺损退变组较移植治疗组信号更低，椎间隙也更
ａ．移植治疗组椎间盘
ａ．ｔｒａｎｓｐｌ卸ｔａｔｉｏｎ掣Ｄｕｐ加狭窄。３组的信噪比（ｓＮＲ）值（ｎ＝１２）分别如下：正常对照组为１８．１５２±３．４５ｌ，移植治疗组为１２．６１５±２．２９ｌ，缺损退变组为７．５２５±１．０２７，经两两比较差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。
ｂ．缺损退变组椎间盘
ｂ．ｄｅｇｅｎｅ枷ｏｎｇｍｕｐ图３３组椎间盘Ｍ砌亿图像
Ｆｉｇ３
亿’ＷＩｉＩｌＩａ寥ｏｆｔｈｅ３ｇｒｏｕｐｓｄｉｓｃ
２．３Ⅱ胶原免疫组织化学染色
８周后移植治疗组与正常对照组髓核组织Ⅱ胶原
免疫组织化学染色均呈阳性反应，缺损退变组呈阴性
反应（图４）。正常对照组Ⅱ胶原免疫组织化学染色切ｃ．正常对照组椎间盘ｃ．ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
片灰度值测为１４３．７８２±２．１７５，与移植治疗组
（１４２．５２８±３．３２６）比较差异无统计学意义（Ｐ＞
０．０５），但这两组与缺损退变组（１５９．７８２±４．２４１）比
较差异均有统计学意义（ＪＰ＜０．０５）。
ａ．正常对照组×２００ｂ．移植治疗组×２００ｃ．缺损退变组×２００
ａ．ｃｏｎｔｍｌｇｒｏｕｐ×２００ｂ．ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ丹∞ｕｐｘ２００ｃ．ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉ∞ｇｒｏｕｐ×２００
图４８周时髓核组织Ⅱ胶原免疫组织化学染色
、
Ｆｉｇ４Ｅｉｇｈｔｗ∞ｋｓｌａｔｅｒｈｉｓｔｏＩｏｇｙ
ｏｂ靶ｒＶ拍蚰ｏｆｎｕｄｅｕｓｐｕｌｐ惦Ｉ玛ｉｎｉｎｔｅｒＶｅｒｔｅｂｒ叫ｍ辩
２．４蛋白多糖的测定
分光光度法测定８周后各组椎间盘髓核蛋白多糖的含量，结果移植治疗组为（４．６２８±０．１６４）ｍｇ?（１００ｍｇ）～，与正常对照组［４．７３７±ｏ．０６８）ｍｇ?（１００ｍｇ）叫］比较差异无统计学意义（ｐ＞０．０５），但这两组与缺损退变组［（３．３６３±０．３２１）ｍｇ?（１００ｍｇ）一］比较差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。２．５阿尔辛蓝过碘雪夫（ＡＢ?ＰＡＳ）染色
石蜡切片阿尔辛蓝过碘雪夫染色结果显示：３组切片中的髓核组织均为蓝色，说明８周后髓核中依然存在大量的酸性蛋白黏多糖。正常对照组椎间盘由中央完整的髓核和外周规则同心圆状排列的纤维环组成（图５ａ）；移植治疗组椎间盘髓核腔相对完整，髓核组
织呈类圆形，边界清晰，可见部分髓核与外周纤维环组
?３００?东南大学学报（医学版）２０１０年６月，２９（３）
织融合，部分纤维环组织破碎（图５ｂ）；缺损退变组椎
间盘无完整髓核腔，整个中央髓核区域消失，分割为几
ａ．正常对照组ａ．ｃｏｎｔｍｌ伊ｏｕｐＡＢ—ＰＡＳ×４０
ＡＢ?ＰＡＳ×４０
个不规则髓核区，外周正常纤维环被纤维样组织代替
（图５ｃ）。
ｂ．移植治疗组ＡＢ—ＰＡＳ×４０
ｂ．ｔ瑚Ｉｌｌｓｐｌ铷１ｔ砒ｉｏｎ殍ＤｕｐＡＢ‘ＰＡＳ×４０
ｃ．缺损退变组ＡＢ—ＰＡＳ×４０
ｃ．ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｇｍｕｐＡＢ—ＰＡＳ×４０
图５椎问盘纤维环及髓核阿尔辛蓝过碘雪夫（ＡＢ－队Ｓ）染色组织学观察
Ｆｉｇ５
Ａ蛐ｌＩｌ吣右ｂｒｏｓ啦柚ｄｎ眦ｌｅ璐ｐｌｌＩｐ憾吣ｉｎｉｎｔｅｒｖｅｒｋｂｒｍｍ辩ｏｂ辨ｎｒｅｄｂｙＡＢ－队Ｓｓｔ；Ｉｉｎｉ呜×柏
３讨论
本实验所用的细胞载体ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－１２７是系由聚氧乙烯（ＰＥＯ）与聚氧丙稀（ＰＰＯ）组成的一种非离子表面活性共聚物（ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ），又名泊洛沙姆（ｐｏｌｏｘ锄ｅｒ）。它最大特点是浓度大于１００９?Ｌ一的水溶液都有一个凝胶化温度，当温度低于凝胶化温度时，粘度急剧增高，变为凝胶，这种温度依赖性变化的物理性状可重复发生【６Ｊ。同时，ＰｌｕｍｎｉｃＦ—１２７具有黏附于接触界面的特性，体内８周左右可完全降解吸收，无明显的免疫排斥反应，降解吸收速度可通过配制溶液的浓度来调节。正是基于ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－１２７水溶液具有温度敏感原位凝胶的性质，目前已被广泛作为组织工程的细胞支架应用于软骨【『７｜、皮肤【８１的构建，还作为药物的分散剂【９１和缓释载体【ｌ训用于制药工业，但是用在修复椎间盘退行性变的动物实验中还未见报道。我们通过模拟人体椎间盘镜下髓核摘除的方式将髓核取出，将３０％ＰｌｕｍｎｉｃＦ—１２７与ＢＭＳＣｓ在冰浴下混合均匀后，通过注射植入缺损的椎间盘内，植入后８周组织学观察未见到明显的炎症反应，ＰｌｕｍｎｉｃＦ?１２７水凝胶全部降解。
椎间盘内部的髓核组织被内外层纤维环与上下软骨终板紧密包绕，与周围循环毫无接触，其营养主要来自软骨终板的弥散作用。随着年龄的增长，细胞弥散作用减退，细胞过度凋亡增加，生物合成平衡被打破。在生化上表现为Ⅱ型胶原和蛋白多糖的减少、水分的丢失、分解代谢的酶类及炎性介质表达的增加，最终导致了椎间盘的退变【１１｜。这些变化变现在ＭＲＩ上，可以表现为椎间隙变的狭窄，椎间盘髓核的他信号强度减弱。本实验缺损退变组在８周后发生了明显的退行性变，与移植治疗组和正常对照组比较有显著性差异，与文献报道相同¨引。
移植治疗组注入复合一ＰｌｕｍｎｉｃＦ—１２７后８周，髓核组织Ⅱ胶原免疫组织化学染色结果显示，移植治疗组Ⅱ型胶原含量与缺损退变组比较有明显差异。我们认为其机制是ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ一１２７植入体内后利用体温形成不流动的凝胶，避免了椎间盘内压力过大将复合物挤出和因液体渗出而造成种子细胞数量减少，随着ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ。１２７在体内的降解，ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ一１２７逐渐被ＢＭＳＣｓ分泌多种生物活性的细胞基质取代，对残存的退变髓核产生营养的作用，从而增加残存髓核细胞合成细胞外基质的能力。
综上所述，本实验采用温控性水凝胶ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－１２７作为细胞支架，制备ＢＭｓｃｓ—ＰｌｕｍｎｉｃＦ－１２７复合物，通过微创注射移植到退变椎间盘，结果发现可以缓解椎间盘退变，证明温控性水凝胶ＰｌｕｍｎｉｃＦ?１２７可以作为修复椎间盘退变的实验研究材料。与传统的预塑椎间盘组织工程支架材料相比，温控性水凝胶ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ—１２７水凝胶材料其有明显的优越性。通过注射的方法植入缺损的椎间盘内，很容易充满整个具有不规则形状的缺损部位，可减小手术的创伤。故Ｐ１ｕｒｏｎｉｃＦ—１２７作为生长因子控制释放载体和药物的缓释细胞支架，通过注射的方法植入退变缺损的椎间盘内是微创治疗椎间盘退变的一个研究新方向。
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ｆｂｒ
BMSCs-Pluronic F-127水凝胶复合体移植治疗椎间盘退变的
实验研究
作者：李果， 吴小涛， 王运涛， 樊守刚， 王锋， LI Guo， WU Xiao-tao， WANG Yun-tao，FAN Shou-gang， WANG Feng
作者单位：东南大学附属中大医院,骨科,江苏,南京,210009
刊名：
东南大学学报（医学版）
英文刊名：JOURNAL OF SOUTHEAST UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE EDITION)
年，卷(期)：2010,29(3)
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本文链接：https://www.wendangku.net/doc/e22994728.html,/Periodical_njtdyxyxb201003014.aspx