耐高温酒精酵母菌株的筛选及发酵能力比较
耐酒精酵母的筛选
摘要：从野外葡萄园土壤中采集土壤样品，在实验室中通过微生物培养，微生物的富集，菌种的分离、纯化，筛选出纯的酵母菌。将筛选出的纯的酵母菌分组分别进行培养，进行耐酒精能力的比较。培养到最佳时期的时候，分别测定各组酵母菌株培养基中酒精含量，筛选出耐酒精性能最好的菌株。该超强耐酒精能力的优良菌株的成功筛选为酵母菌能高效利用发酵培养液提供了菌种来源，同时也为发酵后的酒精分离降低了难度和成本。 关键词：微生物；耐酒精；酵母；筛选；性能测定 前言：随着化石能源的日趋匮乏及环境污染的加剧，开发一种绿色能源势在必行。乙醇作为一种生产工艺成熟、生产原料来源广的替代能源日益受到人们关注。尤其是燃料酒精作为清洁能源，原料资源可以再生，大大的刺激了酒精行业的发展。用微生物法生产酒精的历史由来已久，并且生产工艺早已成熟。目前乙醇的生产原料为玉米、小麦等粮食产品为主。尽管用粮食生产酒精成本昂贵，但由于用纤维素作原料生产酒精的方法还不成熟，工艺过程很不完善，所以怎样提高粮食生产酒精过程中原料的利用率，是目前酒精发酵过程研究的一个重要方向，也是降低发酵生产酒精的重要措施。因为酒精是酵母菌糖代谢产物，对酵母菌的发酵有一定抑制作用，当酒精成分达到10%左右时，酵母菌就停止繁殖，发酵过程也随之放慢。在酒精发酵过程中，由于一般酒精酵母的耐酒精能力不强（耐酒精度一般为10%），导致酵母菌不能充分利用发酵原料，造成了原料的浪费，同时由于发酵液中酒精含量低，使得酒精后期的分离纯化过程复杂，从而大大增加了
生产成本。因此，耐高酒精度的酒精酵母的筛选具有非常重要的意义。耐高酒精度的酒精酵母能够减缓产物的抑制作用，提升酒精酵母产酒精的潜力【1】。耐酒精酵母可以在发酵液中较高浓度的酒精中不会死亡，并且仍然具有利用培养液发酵酒精的能力，从而提高酒精原料的利用率。同时和一般酵母发酵相比，发酵产物中酒精的含量能达到18%左右，产物中原料和杂质的含量下降，产物中酒精的纯度增加，也使得酒精的分离提纯更加容易进行，从而使粮食生产酒精成本降低。因此高耐性酒精酵母这一领域的研究工作一直在深入的进行，并且有了可喜的成果【2】。耐酒精酵母的应用，使相同原料的酒精产量大大提高，从而使我国的酒精生产总量增加，改善我国酒精产品供应不足的状况，更好的为我国的国民经济服务。酒精成本的降低，使得酒精能源能够得以广泛使用，缓解能源的危机，降低化石燃料的使用，减少日益严重的环境污染，改善我国恶劣的环境状况。对我国经济的可持续发展有着深远的影响。在查阅了大量文献资料的前提下，本文拟从自然界分离筛选一株耐酒精产酒精能力强的酵母菌株，使其应用于工业酒精发酵，提高酒精发酵的产率和质量，降低酒精生产的成本。实验部分： 1材料与试验方法： 1.1材料： 1.1.1样品来源：野外葡萄园中的土壤样品。 1.1.2菌株来源：从葡萄园中土壤样品中分离酵母菌株。 1.1.3培养基：
酵母菌酒精发酵实验报告
实验方案 酵母菌酒精发酵的条件研究 学院（部）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生姓名：鑫 学号：11018150 班级：生物工程二班 指导教师：肖
一、实验目的 1、学会实验的设计和操作过程 2、找到酵母菌发酵时的最优条件 二、培养基和实验方法及材料的确定 1、玉米粉的糖化方法 玉米粉的糖化采用双酶法，其工艺流程如下 玉米粉→加水→液化→糖化→发酵→蒸馏→成品酒精 试验中，发酵培养按照三角瓶100ml培养。本次工做20组是要，共需发酵液20*100=2000ml。培养液按照100g玉米粉、300ml水。所以共需玉米粉700g。 液化：取１００ｇ玉米粉，加入３００ｍＬ的水，液化温度为９０℃，ｐＨ值为５．５，液化时间为３．５ｈ，液化酶的添加量为０．０３５ｇ／１００ ｇ玉米粉 糖化：糖化时的工艺条件为：糖化温度为５８℃，ｐＨ值为４．５，糖化时间为３．５ｈ，糖化酶的添加量为０．３ｇ／１００ｇ玉米粉。 2、活化培养基 本实验在进行实验时采用察氏(czapck)培养基的配制，配方如下表一： 表一 3、扩大培养基 扩大培养仍然用察氏(czapck)培养基，由于要用液体的，所 以将其中的琼脂配料去掉。 4、发酵培养基
糖化液稀释至l0%浓度，添加辅料（硫酸铵0.4%），pH5.5 灭菌 三、培养基的制备及酵母的活化 1、准备酵母母菌一支常温下存放一天，增加菌种的活力。在母菌存放期间制作各时期培养基 2、准备固体培养基（察氏培养基）50ml，做成8支试管斜面，扩大培养基800ml（做扩大培养时使用）。做成8个三角瓶，每瓶200ml。120℃灭菌30min。 3、发酵液的制备 （1）玉米粉的筛选 实验前准备粉碎后的玉米粉700g。 （2）玉米粉的液化 按照100g玉米粉、300ml水的配比对玉米粉进行液化，液化方案上文已经交代。在1000ml烧杯里，或者500ml烧杯分两次，水浴液化。 器材：烧杯500ml两个，玻璃棒一个，水浴锅一个，糖化酶0.225g 步骤：1、将糖化酶，玉米粉，水按照比例配置好在烧杯里。2、将配好的玉米液放于水浴锅中90℃液化3.5h。边液化边搅拌。 （3）玉米粉的糖化 将液化后的玉米液中按照0.3g/100ml加入液化液中。再在水浴锅中，58℃糖化3.5h。 （4）过滤 糖化后的糖化液有可能有没有彻底液化的玉米颗粒，会造成浑浊，这时需要对糖化液进行过滤操作。 操作步骤： 最后与以上培养基一起进行灭菌处理。灭菌时，清洗16支移液管，与培养基一起灭菌。 （5）活化步骤 器材：酒精灯，接种针，母菌，斜面培养基，消毒酒精。 步骤：1、将器材放于实验台上。对双手合桌面进行灭菌。对接种针进行灼烧灭菌。2、在酒精灯旁按照无菌操作步骤在酒精灯火焰旁取
耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究[开题报告]
毕业论文开题报告 生物工程 耐高浓度酒精的酵母筛选及发酵工艺研究 1 选题的背景和意义 石油作为国民经济发展的战略物资在经过人类近二百年的开采后，面临全球桔竭的局面。特别是近年来，随着经济的持续增长和石油需求迅速膨胀，我国已成为继美国之后的第二大能源消费国。针对我国人多地少、粮食紧缺和石油短缺的国情，依据不与人争粮、不与粮争地，能源原料多元化，实现持续发展的原则，开发非粮燃料乙醇生物能源，降低生产成本，提高转化效率，确保现代社会发展的需求，已成为国家新能源战略发展最紧迫的任务。传统酿酒酵母的酒精发酵最适温度不高，一般为25℃一30℃；耐酒性较差，耐酒精浓度在10％左右。一方面，在杂菌污染严重的情况下，生产上不仅要求无菌条件严格，操作难度较大，而且为了控制因发酵热所引起的温度上升，需要加入大量冷却水(甚至在部分气温较高地区，因发酵过程中过热，根本无法进行正常生产)，导致乙醇生产成本增加[1-2]；另一方面，酵母的耐酒精度较低，产物的抑制作用降低乙醇酵母的产乙醇潜力。因此，耐受性酒精高温酵母的选育研究已成为国内外酒精行业的研究热点[3-4]。 乙醇酵母对生活条件的变化有迅速的适应能力，并且随着外界环境的变化，其群体能迅速产生变种，这为耐酒精酵母的筛选提供了可能[1]。耐高温酵母不是微生物分类学上的名词，而是从生态方面表达此类酵母对温度的忍耐性与普通酵母的差异。筛选耐高温的乙醇酵母菌株，其生产上的优势主要体现在：①具有较高的发酵能力，即能快速并完全将糖分转化成乙醇，能够解决糖化温度和发酵温度不协调的矛盾，实现真正意义上的边糖化边发酵，从而减少葡萄糖对纤维素酶的抑制作用，提高纤维素酶的糖化率，进而提高纤维素发酵生产燃料乙醇的得率[2-3]；②繁殖速度快，即具有高的比生长速度，高温发酵还能够提高发酵效率，降低发酵时的冷却成本[4]；③具有高的耐酒精能力，即对本身代谢产物的稳定性高．因而可以进行浓醪发酵；④抗杂菌能力强，即对杂菌代谢产物的稳定性高．耐有机酸能力强；⑤对培养基的适应性强。耐温、耐盐和耐干物质浓度的性能强。 2 相关研究的最新成果及动态
酵母菌分类
酵母菌分類 根據荷蘭Lodder & Kreger-van Rij 所著“The Yeasts, A Taxonomy Study” 分類主要依據是 1. 形態 2. 對硝酸鹽或碳源的利用 3. 對糖的發酵性 形態與大小：因酵母種類不同而不同，同一種也會因培養條件或發育時期不同而有異，一般直徑約在5 μm，顯微鏡40X及100X接物鏡下皆可觀察到。 cerevisiae型：球形與卵形(如啤酒酵母Saccharomyces cereviisiae) ellipsoideus型：橢圓形(如葡萄酒酵母Saccharomyces ellipsoideus) pastorianus型：香腸形 apiculatus型：檸檬形 trigonopsis型：三角形 增殖法：主要為營養增殖(即出芽生殖(budding))，偶而發生有性生殖時則行子囊胞子來增殖。 母細胞(mother cell)：原來的細胞 子細胞daughter cell)：增殖後的細胞 多極出芽(multilateral budding)：同一個細胞上數個地方可以出芽者 兩極出芽(bipolar budding)：只有細胞兩端才會出芽者(如Kloeckera spp.) 偽菌絲(pseudomycelium)：出芽後的細胞一直連成很長，呈菌絲狀者(如Candida spp.) 真菌絲(true mycelium)：有些酵母會形成如同黴菌具有隔膜(septum)的真菌絲(如Endomycopsis spp., Trichosporum spp.) 分裂酵母(fission yeast)：非出芽，而是在細胞中央形成隔膜再分裂成兩個細胞者(如Schizosaccharomyces spp.)
耐高温酒精酵母的筛选
文章编号 1004 6410(2009)03 0026 04 耐高温酒精酵母的筛选 易 弋1a ,黎 娅1b ,容元平1a ,李 凯2 (1.广西工学院a.生物与化学工程系b.科技处,广西柳州 545006; 2.四川省中医药高等专科学校,四川绵阳 621000) 摘 要:从酒精厂废液、糖厂废糖蜜、土壤及淤泥等七种不同样品中,经富集、分离、纯化,筛选得到3株耐高温酵母菌T M 6、T M 10和T M 20.实验结果表明,3株菌都能在50 的高温下生长,但高温会明显影响酵母菌的发酵能力.30 下,T M 10的发酵酒精终浓度最高,达到了7.82%(v/v).而在40 下T M 20的发酵能力要高于T M 6和T M 10,且发酵酒精终浓度仅比30 时降低了约6%.关 键 词:耐高温;酒精发酵;酵母;筛选中图分类号:T S262.2 文献标识码:A 收稿日期:2009-06-05 基金项目:广西工学院博士基金项目(0818001),广西工学院科学基金项目(0840202)资助.作者简介:易弋(1979-),男,四川都江堰人,广西工学院生物与化学工程系副教授,博士. 0 引言 自20世纪70年代发生石油危机以来,能源短缺已成为我国乃至世界各国经济发展的主要障碍.发展可 再生资源以解决我国经济持续发展中的能源问题,已成为全社会的共识.燃料乙醇由于其可再生性,被认为是最有可能代替石油的液体燃料,市场潜力十分巨大. 目前工业化生产酒精的发酵温度一般在30~33 左右,在这种温度下发酵需要大量的冷却水.若能使发酵在高温下进行,不但可以减少冷却水的用量,节约生产成本,而且可以从根本上解决糖化与发酵不同步的问题,缩短发酵周期,提高发酵效率[1] .同时高温发酵能有效的抑制杂菌生长,减少醪液受污染的机会.但过高的温度会引起酵母细胞内脂肪酸、磷脂等成分的变化,甚至会导致蛋白质变性,这样一来就会影响细胞正常的生理活动,表现出高温对酵母细胞的毒性[2].因此,对于耐高温酒精酵母菌的选育问题一直是酒精酵母研究者的重要研究方向之一. 针对这一问题,本文拟从自然界中分离出有较强温度耐受性的酵母菌,并初步研究其发酵及相关性能,为下一步的选育工作打下基础. 1 材料与方法 1.1 培养基 酵母培养基:葡萄糖50g,酵母膏8.5g,NH 4Cl 1.0g,MgSO 4 7H 2O 0.6g ,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调pH =4.5,115 灭菌20m in.固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5%的琼脂. 发酵培养基:葡萄糖150g ,酵母膏5g,蛋白胨5g,NH 4Cl 1.0g,M gSO 4 7H 2O 0.6g,CaCl 20.6g ,加水溶解至1000mL,调节pH= 4.5,115 灭菌20min. T TC 上层培养基[3] :葡萄糖0.5g,琼脂1.5g,加水至100mL,115 灭菌20min,待冷却至55 左右时,加入TTC(2,3,5!氯化三苯基四氮唑)0.05g. 第20卷 第3期 广西工学院学报 Vol 20 No 3 2009年9月 JO U RNAL OF G UA NG XI U N IV ERSIT Y OF T ECHN OL OGY Sep 2009
酵母的筛选 (1)
．葡萄果表酵母的分离: 葡萄的采集：葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此在采收葡萄时，将果梗与葡萄一起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡萄果实中大量存在，采收时可以选取有裂纹的葡萄，但是，将完整无损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存，备用。2. 菌种分离步骤：将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。随机选取并称量约10g成熟葡萄，放入盛有90ml 无菌水的三角瓶，分别按30ug/ml添加链霉素，然后振荡培养30min后静置，制成菌悬液，吸取50μl 放入YEPD固体培养基，三个重复，以无菌刮铲刮匀，25℃培养24～48h。观察菌落的大小及生长状况。然后将静置后的菌悬液进行梯度稀释（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个稀释度做三个重复。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L 的氯霉素。观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。 自然发酵过程中酵母菌的分离: 将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。称量约100g 新鲜成熟度好的各品种葡萄，手工破碎，放入无菌的500ml 三角瓶，接着分别按30ug/ml添加链霉素，置于28℃培养，每隔24h 取发酵液1ml，加入9 ml无菌水中，然后进行梯度稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取样时期分别为：I，葡萄浆果破碎压榨后（添加SO2）；II，发酵旺盛期，葡萄汁含糖量下降20%时；III，发酵后期，葡萄汁含糖量下降70%时；IV，发酵结束前，残糖10%以下时。取0.1ml 稀释后各菌液放入固体培养基，涂布均匀（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，28℃条件下使其自然发酵24～48h，每个稀释度做三个重复。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。观察每一个菌落，编号并作详细描述。如：菌落颜色、表面结构、边缘、颜色等，进行分析和初步的归类。 酿酒酵母筛选及其鉴定一筛选 1 酿酒酵母的无性繁殖方式筛选对液体培养基培养48h的酵母菌株，在16×40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株。 2 WL琼脂培养基筛选酿酒酵母WL琼脂培养基(%质量分数)：酵母浸粉0.5，胰蛋白胨0.5，葡萄糖5，琼脂2，磷酸二氢钾0.055，氯化钾0.0425，氯化钙0.0125，氯化铁0.00025，硫酸镁0.0125，硫酸锰0.00025，溴甲酚绿0.0022，pH 6.5，121℃灭菌20 min；将分离出来的酵母菌株，接种液体培养基活化24h后接种到WL琼脂培养基，27℃培养5d后观察，筛选出菌落颜色为奶油色（浅黄色）至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株。 3 赖氨酸培养基筛选赖氨酸培养基成分（L-1）：D-葡萄糖10g，L-组氨酸1mg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg，对－氨基苯甲酸200μg，生物素20μg，叶酸2μg，肌醇10mg，烟酸400μg，泛酸2mg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素200μg，盐酸硫胺素400μg，硼酸500μg，结晶氯化铜40μg，碘化钾100μg，结晶氯化铁200μg，结晶硫酸锰400μg，结晶钼酸钠200μg，结晶硫酸锌400μg，磷酸二氢钾850mg，磷酸氢二钾150mg，结
酵母发酵酒精的研究进展
酵母发酵酒精的研究进展 （生命科学与技术学院微生物专业） 前言 人类利用酵母菌的历史已有几千年了。值得提出来的是，早在我国宋代的酿酒著作中，中国人已经明确记载了从发酵旺盛的酿酒缸内液体表面撇取酵母菌（当然不是纯粹的酵母菌）的方法，并把它们称为“酵”，风干以后制成的“干酵”可以长期保存。这种制造干酵母的原始方法说明，早在800年前，中国人已经意识到酒精发酵是由“酵”，即某种能生长的物质引起的。这种推断直到19世纪巴斯德才证明是酵母菌。明代末年出版的词书中记载有“以酒母起面曰发酵”，“发酵，浮起者是也”等解释。这说明至少在那时，一引起细心观察自然现象和注意比较的学者，已经认识到发面和酿酒有某种相同的因素在起作用。当时在欧洲虽然已经发现了酵母菌，但在200年后才知道酵母菌的作用。今天我们把这类微生物称酵母菌，正是以此为根据的。 酵母菌能够把糖变成酒精，是因为它的细胞里有催化剂，这些存在于生物细胞的催化剂在科学上叫做酶。虽然现在知道所有的生物都是靠酶催化的化学反应来生活的，但最早发现的酶，就是酵母菌的酶。酵母菌中最早发现的酶，是把糖变成酒精的一群酶，当时自然数酒化酶。由于这种酶的作用，使糖分解成酒精和二氧化碳，这就是利用酵母菌酿酒和发面包的原理。使面团产生许多空隙的就是二氧化碳。酵母细胞大小为2.5-10μm×4.5-21μm, 在加盖的玉米琼脂上不产生假菌丝或有不典型的假菌丝, 营养细胞可直接变为子囊, 每囊有1-4个圆形光面的子囊孢子, 在麦芽汁25℃培养3d, 细胞为圆形、卵形、椭圆形和香肠形。其菌落在麦芽汁琼脂上为乳白色, 有光泽, 平坦, 边缘整齐。菌体维生素、蛋白质含量高, 既可食用又可提取细胞色素C、核酸、麦角固醇、谷胱甘肽、凝血质、辅酶A、三磷酸腺苷等。该菌种能发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖及蔗糖, 但不能发酵乳糖和蜜二糖, 不同化硝酸盐。 酵母菌的繁殖方式既可进行无性繁殖，如芽殖，又可进行有性生殖；酵母菌既可进行有氧呼吸，又可进行无氧呼吸，是一种兼性厌氧呼吸的真核微生物。单细胞真核生物酿酒酵母基因组为12,068kb，比单细胞的原核生物和古细菌大一个数量级。酿酒酵母基因组共有5887个ORF，这比原核生物和古细菌要多很多。酿酒酵母的基因密度为1个基因/2kb，密度小于原核生物流感嗜血杆菌和尿殖道支原体等。酿酒酵母是最小的真核基因组，裂殖酵母其次，其密度是1/2.3kb，简单多细胞生物线虫的基因密度为1/30kb。第二、酿酒酵母只有4%的编码基因有内含子，而裂殖酵母则有40%编码基因有内含子。 1、酵母的生长条件 1.1 无机盐
酒精酵母
一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种 四川理工学院 设计（论文）题目：一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种 1．毕业设计（论文）的主要内容及基本要求 [1]大曲中分离及纯化酵母菌。 [2]紫外线诱变，氯化锂诱变和紫外线与氯化锂复合诱变。 [3]分别对诱变菌的发酵性能和产气情况的测定。 2．指定查阅的主要参考文献及说明 [1]《酿造酒工艺学》（第二版）中国轻工业出版社顾国贤主编 [2]《微生物学》（第二版）高等教育出版社周德庆主编 [3]《微生物学实验指导》高等教育出版社黄秀梨主编 [4]《现代微生物遗传学》化学工业出版社陈三凤刘德虎编著 3．进度安排 设计（论文）各阶段名称起止日期 1 文献检索：收集资料、撰写开题报告2009.03.23--2009.03.29 2 文献、资料查阅整理，撰写文献综述2009.03.30--2009.04.05 3 拟订实验方案，提出实验条件及需求2009.04.06--2009.04.11 4 实验仪器及药品的准备2009.04.11--2009.05.12 5 实验实施，现象观察并做好数据记录2009.04.13--2009.05.20 6 分析实验结果，整理数据2009.05.21--2009.05.28 7 撰写论文、修改论文2009.05.29--2009.06.10 8 论文定稿、打印、准备及答辩2009.06.10--2009.06.17 注：本表在学生接受任务时下达 一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种
本文主要介绍了耐酒精酵母的诱变育种，通过诱变得到高发酵力和高耐酒精性能的酵母菌。本实验拟从大曲中分离及纯化得到具有发酵产酒精能力的酵母菌种,并以该菌作为出发菌株,首先分别通过紫外光诱变，氯化锂诱变和紫外光与氯化锂复合诱变，然后分别测试诱变后的酵母菌株的酒精发酵及耐酒精性能，从而筛选得到高发酵能力及高耐酒精度的酵母菌株。 关键词：酵母菌；耐酒精；紫外线；氯化锂；复合诱变 目录 摘要 .................................................... ..错误!未定义书签。ABSTRCT............. .........................................错误!未定义书签。目录 (Ⅲ) 前言 ...................................................... 错误!未定义书签。第一章实验仪器与材料........................................ 错误!未定义书签。 1.1 仪器与设备............................................. 错误!未定义书签。 1.2 材料与试剂............................................. 错误!未定义书签。 1.3 实验试剂的配制 (4) 1.4 培养基的配制 (5) 第二章实验内容与方案 (6) 2.1 大曲中酿酒酵母的分离 (6) 2.2 出发菌株的能力测定 (7) 2.3 紫外线诱变酵母菌 (8) 2.4 氯化锂诱变酵母菌 (10) 2.5 紫外线-氯化锂复合诱变酵母菌 (13) 第三章实验结果与讨论........................................ 错误!未定义书签。 3.1实验结果............................................... 错误!未定义书签。 3.2 实验讨论 (35) 第四章结论 (39) 第五章综述 (41) 参考文献 (44) 致谢 (46) 附录 (47)
酵母菌的分离筛选方法
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 1.1葡萄糖50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L KH2PO4 2.5g/L Na2HPO40.5g/L MgSO41g/L FeSO4 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟加 拉红 0.03g/L PH4.5-5.0 （富集用） ★1.2乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用 蔗糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱 布过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培 养用）（富集用） ★1.3麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素0.1g/L PH6.0-6.4 121℃ 20min （分离保存用）灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★1.4虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨5.0g/L 葡萄糖10g/L KH2PO41.0g/L MgSO40.5g/L 孟加拉红0.033g/L 氯霉素0.1g/L 琼 脂15g/L PH自然
（分离纯化用） ★1.5 豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g 黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 1.6察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾0.5g/L 硫酸镁0.5g/L 硫酸亚铁0.01g/L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。
小议高产酒精酵母菌的紫外线诱变选育
聂世现，王钰，黄文静，季必霞 0 引言 石油是世界经济与发展的基本能源之一，其储备有限。20世纪70年代世界范围发生石油危机，使利用可再生的资源（如高淀粉作物）发酵生产酒精作为生物能源的研究成为人们关注的焦点。生物能源与石油相比具有可再生、污染小、减少温室效应等优点，能部分或全部代替汽油。目前，燃料酒精的生产占世界酒精总产量的66%，并且还有进一步增加的趋势。发酵法是酒精生产的重要方法，发酵法生产酒精的关键是酵母菌株，酒精酵母的优劣不仅直接影响发酵率的高低，而且会影响酒精的产量和质量。我国酒精生产行业中普遍存在亟待解决的问题是发酵强度低,生产成本高,能耗大。因此，高产酒精酵母的选育是提高酒精产率，节约生产能源的关键。 为了开展非粮作物甘薯等转化酒精的研究，本论文探讨了酵母菌A4原生质体制备和再生的适宜条件，并用紫外线作诱变剂，对酵母菌原生质体进行诱变处理，旨在筛选出发酵力强、酒精产量高的优良酵母菌株，为下一步以高产淀粉品种甘薯为原材料生产酒精的研究工作奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种 酵母菌（A4）为本实验室保藏菌种。 1.1.2 培养基 麦芽汁液体培养基：将麦芽汁（购于合肥市华润雪花啤酒厂）糖度调至12°Brix，过滤后121℃灭菌20min。 YPD培养基(g/L)： 液体培养基：酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20。 固体培养基：在YPD液体培养基中加入琼脂20，NaOH0.1。 原生质体再生培养基：在YPD固体培养基中分别添加KCl至0.7mol/L，山梨醇至0.8mol/L，甘露醇至0.8mol/L，17%的蔗糖。 以上培养基于115℃灭菌20min。 TTC上层培养基(g/L)：TTC（三苯基四氮唑盐酸盐）0.5，葡萄糖5，琼脂15。 TTC下层培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨2，酵母膏1.5，K2HPO41，MgSO4·7H2O4，琼脂20，pH5.5。 1.1.3 试剂 缓冲液：pH6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液。 预处理剂：0.1%β-巯基乙醇，其中含0.1mol/L的EDTA-Na2。 稳渗剂：KC1高渗缓冲液：缓冲液中添加KC1至0.7mol/L；山梨醇高渗缓冲液：缓冲液中添加山梨醇至0.8mol/L；甘露醇高渗缓冲液：缓冲液中添加甘露醇至0.8mol/L；蔗糖高渗缓冲液：缓冲液中加入17%的蔗糖。 酶液：分别将1%，1.5%，2%，2.5%的蜗牛酶和0.4%蜗牛酶+0.4%纤维素酶溶于高渗缓冲液中，微孔滤膜过滤除菌，制备成不同浓度的酶液。酶购于上海生工。 1.2 方法 1.2.1 出发菌株的原生质体制备与再生 1.2.1.1 出发菌株生长曲线的测定 挑取斜面菌株1～2环接种于50mLYPD液体培养基中，28℃，200r/min摇床培养24h后分别以1:100的量接种于装有10mLYPD液体培养基的大试管中，28℃，200r/min摇床培养，每隔2h取出一支试管，测定其OD600值，绘制其生长曲线。 1.2.1.2 出发菌株原生质体制备与再生 将活化好的菌种接种于盛有50mLYPD液体培养基的锥形瓶中，28℃，200r/min摇床培养，当其进入对数生长期时，取5mL菌液3500r/min离心5min，用磷酸-柠檬酸缓冲液洗2次，无菌加入0.1%β-巯基乙醇，28℃
高耐性酿酒酵母的杂交育种
２０ 酿酒科技２００６年第１０期（总第１４８期）?ｍＱｕＯＲ—Ｍ甜烈Ｇｓｃ皿ＮｃＥ＆．Ｉ．Ｅｃ础ｏＬｏＧＹ２００６Ｎｏ．１０ｃ］ｒ０１．１４８） 高耐性酿酒酵母的杂交育种 吴帅，陈叶福，沈楠，肖冬光 （天津科技大学生物工程学院，天津３００２２２） 摘要：利用不同特性的酿酒酵母ＡＹ一１５，Ｍ１进行生孢培养和孢子分离试验，得到１８５株产 酒、１５３株耐渗单倍体。其接合型，ａ型约占１／４，仅型占约１／２，其余为不确定株。经筛选试马骺得到 １３株产酒性能良好的单倍体和１９株耐渗性能良好的单倍体。利用酒精发酵试验进行复筛，得到 两株性能最优良的单倍体，作为杂交试验的亲本。杂交试验后，经耐渗、耐酒精杜氏管试验和发酵 性能测定，得到一株能够在高渗环境中仍然保持较高产酒精能力的酿酒酵母，在含盐５％的培养 基中发酵产酒精能力分别比ＡＹ一１５，Ｍ１提高１９．６％和１５．４％。 关键词：微生物；酿酒酵母；杂交；高耐性；酒精产率 中图分类号：ＴＳ２６１．１；ＴＳ２６２．２文献标识码：Ａ文章编号：１００１—９２８６（２００６）１０—００２０一０３ ＣｏｎｓｔｒＩｌｃｔｉｏｎｏｆ＆ｃｅ，Ｐｌ，豇ｌａＰ、）ｌ，ｉｔｈＧｏｏｄｏｓｍｏ—ｔｏｌｅｒａｎｃｅ 舳ｄＩＩｉｇｈＥｔｈ觚ｏｌ—ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎＣｈａｍｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ＷＵＳｈｕａｉ，Ｃ腿ＮＹｅ一如，Ｓ髓ＮＮ蛐趾ｄⅫ～０Ｄｏｎ争ｇＩｌ龃ｇ （ｃｏｕｅｇｃｏｆＢｉ咖ｇｉｍｅ血吕Ｔｉ砌ｉｎｕｎｉｖｅｒｓｉ哆ｏｆｓｃｉｅｎｃｅ衄ｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉ删ｉｎ３００２２２，ｃｈｉｌｌａ） Ａｂｓｔｍｃｔ：１８５ｌｌｉｇｈｅ也孤ｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｈ印ｌｏｉｄｓａｎｄ１５３ｇｏｏｄｏｓｍｏ—ｔｏｌｅｒａｎｔｈ印ｌｏｉｄｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｌｌｅｄｔｈｒｏｕ曲ｓｐｏｒｅｓｅｐａｒａ－ｔｉｏｎｔｅｓｔａｎｄｓｐｏｒｅｃｕｌｔⅢｅｏｆ＆ｃｅｒｅ移蠡ｉａｅＡＹ一１５飙ｄＭ１ｏｆ（１ｉｆｒｅｒｅｎｔｐｒｏｐｅｎｉｅｓ．ＡｍｏｎｇａＵｔｈｅｍａｔ血ｇ勺伊ｅｓ，ａ帅ｅａｃ—ｃｏｌＩｎｔｅｄｆｏｒａｂｏｕｔ１／４，仅ｔｙｐｅａｃｃｏｕｎｔｅｄｆｏｒａｂｏｕｔ１／２，ａｎｄｏ也ｅｒｓｗｅｒｅｕｎｃｅｎａｉｌｌｓ自隐ｉｎｓ．Ｂｙｍｅ嬲ｕｒｉＩｌｇ也ｅ ｅｎｄｕ舢ｃｅｏｆｙｅａＳｔｈａｐｌｏｉｄｓ，１３ｈｉｇｈｅｔｈ趾ｏｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｈ印ｌｏｉｄｓａｎｄ１９ｇｏｏｄｏｓｍｏ—ｔｏｌｅｒ４ｎｔｈ印ｌｏｉｄｓｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ａｆｔｅｒ血ｅ侥ｍｅｎｔａ—ｔｉｏｎ，觚ｏｈａｐｌｏｉｄｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ器ｍｅｐａｒｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．２３６ｄｉｐｌｏｉｄｓｔｒａｉ璐、Ⅳｅｒｅｃｏｎｓ仃ｕｃｔｅｄｂｙｃｒｏｓｓｉｎｇ也ｅ ｐａｒｅｎｔｓ．ＡｔｌａＳｔ，ｏⅡｅｓ缸ａｉｌｌｗ弱ｏｂｔａｉｎｅｄ也ｒｏｕｇｈｔｈｅｍｅａＳｕｒｅｍｅｎｔｏｆｍｅｉｒｏｓｍｏ—ｔ０１ｅ砌ｃｅｃａｐａｃｉｔ），ａｎｄｆｅｒｍｅｎｔｉｌｌｇ ｐｏｗｅｒ 锄ｄａｌｃｏｈｏｌ?ｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｅｓｔ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｍａｉｎｔａｉｎｈｉ曲ｅｔｌｌ蛆ｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃａｐａｃ蚵ｕｎｄｅｒｈｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃｅ妇ｎｍｅｎｔｓ．Ｉｔｓｅｔｌｌａｎｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔ）ｒｉｎｃｌｌ】ｔＩｌｒｅｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１５％ｓａｈｉｎｃｒｅ弱ｅｄｂｙ１９．６％ｔ１１ａｎＡＹ一１５ａｎｄｂｙ１５．４％也ａｎＭｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． ＫｅｙｗｏｒｄＳ：ｍｉｃｒｏｂｅ；ＳⅡｃｃ，Ⅻ．ｏ，ｎ弘ｅｓｃｅｒｅ秽括云∞；ｈｙｂｒｉｍｚｅ；ｏｓｍｏｔｏｌｅｍｃｅ；ｅｔｌｌ锄ｏｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 随着酒精发酵工业的发展，浓醪发酵技术获得普遍的成功和不断得到认可。浓醪发酵可使企业获得最大产率，提高企业生产能力，同时还可以相应地降低生产成本。目前，浓醪发酵的研究主要集中在高产菌株的选育和发酵工艺两个方面。前者的目的主要是提高菌株的耐性，包括耐渗性和耐酒精性能等。对于淀粉质原料。通常采用边糖化边发酵工艺，如废液不回用则不存在高渗问题。但为了节约生产用水和减少酒精废液的处理量，大多数工厂都采用部分废液回用工艺。而酒精废糟中含有大量对酵母菌的生长和发酵有抑制作用的物质．如无机盐等，随着回用次数的增加，发酵液的渗透压会因为这些物质的多次积累有所增高【”，也会影响酵母的生长和繁殖，这就需要菌株具有较好的耐渗性。另一方面，由于酒精浓醪发酵得到的酒精浓度较高，酵母菌的发酵会受到影响，以往的研究显示，乙醇浓度达８％时对酵母细胞有害，乙醇浓度达１１％左右时，酵母发酵完全受到抑制圆。为了使酵母能够在浓醪发酵中更好地利用可发酵性糖．有必要同时增强其耐渗性和耐酒精性能。 本试验采用杂交育种手段对酵母菌进行改造。１９５０年酵母菌接合系统的遗传控制原理已经得到详细阐述。到目前为止，杂交试验已经取得了不少成果，例如，日本的小田等人用酒精酵母和卡尔斯伯杂交获得的杂交株， 基金项目：天津市重点科技攻关资助项目（０６ＹＦＧｚＳＨ００５００）。 收稿日期：２００６—０７—１８ 作者简介：吴帅（１９７９一），女，山东人，博士研究生，研究方向：现代酿造技术。通讯作者：肖冬光，天津科技大学教授，博导。ｘｄｇ＠ｔｕ８ｔ．ｅｄｕ．ｃｎ．。 万方数据 万方数据
酵母菌的筛选方案
第一部分：酵母筛选收集 一．土样中酵母的分离： 1．土壤的采集处理 采用五点取样法从葡萄地土壤中取样。由于土壤中的微生物一般在5-25cm的土层里，所以先用灭菌铲除去土壤的表皮，然后采取土壤200-300g，至于无菌塑料袋内，并标明采取地点、日期。将其运回实验室后至于冰箱中保存，备用。 将采回的样品用四分法获取样品20-30g，将其置于研钵中研磨均匀。 2. 土壤中菌种的分离： 称取1 g土壤，置于液体培养基灭菌葡萄汁，经28 ℃，12 h，180 rpm摇床富集培养。取1 ml富集培养液，分别进行五个梯度稀释（1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个梯度做三个重复。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。 为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。 观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。 二．葡萄果表酵母的分离: 1. 葡萄的采集： 葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此在采收葡萄时，将果梗与葡萄一起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡萄果实中大量存在，采收时可以选取有裂纹的葡萄，但是，将完整无损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存，备用。 2. 菌种分离步骤： 将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。 随机选取并称量约10g成熟葡萄，放入盛有90ml 无菌水的三角瓶，分别按30ug/ml添加链霉素，然后振荡培养30min后静置，制
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3(DOC)
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵 吴英玲 10197020 10生物创新班 摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内 4 ℃下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。 关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵 Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。 前言 酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸
酵母菌酒精发酵实验方案
酵母菌酒精发酵实验方案 实验方案 酵母菌酒精发酵地条件研究 学院（部）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生姓名： 学 班 指导 1 2 ｇ玉米粉 糖化：糖化时地工艺条件为：糖化温度为５８℃，ｐＨ值为４．５，糖化时间为３．５ｈ，糖化酶地添加量为０．３ｇ／１００ｇ玉米粉. 活化培养基 本实验在进行实验时采用察氏(czapck)培养基地配制，配方如下表一：
表一 扩大培养基 扩大培养仍然用察氏(czapck)培养基，由于要用液体地，所以将其中地琼脂配料去掉. 1 2 3 （1 （2 按照 中90℃液化3.5h.边液化边搅拌. （3）玉米粉地糖化 将液化后地玉米液中按照0.3g/100ml加入液化液中.再在水浴锅中，58℃糖化3.5h. （4）过滤 糖化后地糖化液有可能有没有彻底液化地玉米颗粒，会造成浑浊，这时需要对糖化液进行过 滤操作.
操作步骤： 最后与以上培养基一起进行灭菌处理.灭菌时，清洗16支移液管，与培养基一起灭菌. （5）活化步骤 器材：酒精灯，接种针，母菌，斜面培养基，消毒酒精. 步骤：1、将器材放于实验台上.对双手合桌面进行灭菌.对接种针进行灼烧灭菌.2、在酒精灯旁按照无菌操作步骤在酒精灯火焰旁取下试管棉塞.3、将灼烧后地接种针伸入母菌试管取粘 培养. ， 不同菌量下地发酵 器材：扩大菌种，移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球. 步骤：1、将实验器材放于实验台上.2、用移液管移取8%地扩大菌种到发酵液中.3、塞好棉塞，将发酵液存放于30℃条件下发酵2d.4、按照以上步骤，分别移取10%、12%、14%地扩大菌种到发酵液中，30℃培养2d，之后进行酒精检测. 不同醪液浓度下地发酵
酵母菌发酵实验
酵母菌发酵实验 一、实验在教材中所处的地位与作用 本实验位于生物学八年级上册第五单元第五章第二节人类对细菌和真菌的利用。酵母菌在日常生活中很常用，可以用来发包子、馒头和酿酒，很具有代表性。该实验属演示实验，可直观地向学生展示酵母菌发酵现象，在实验过程中观察到液体中冒气泡，同时气球胀大，说明酵母菌发酵过程中产生了气体，与生活联系紧密，还可鼓励学生自己动手实践。 二、实验原型及不足之处 实验原型：生物学八年级上册教材P71 演示实验发酵现象在一杯温开水中加入一大勺糖和一小包酵母，进行搅拌。将这个杯子中的液体倒入透明的矿泉水瓶或玻璃瓶内，再往瓶内加一些温开水。将一个小气球挤瘪套在瓶口。将瓶子放在教室内的窗台上，每天观察瓶中的情况，看看瓶中的液体会不会冒出气泡，气球会不会胀大。 不足之处：该实验观察到液体中冒气泡，同时气球胀大，说明酵母菌发酵并产生了气体，但无法测知发酵过程中产生的是何种气体，也无法深入理解酵母菌在日常生活中的应用。 三、实验创新与改进之处 1、改用一个带橡胶塞的锥形瓶。 2、瓶口插一根“Y”形玻璃导管，排气端分别连挤瘪的小气球和橡胶管，橡胶管再连一根直的玻璃导管，橡胶管用夹子夹住。（见后图）
3、另用一个玻璃杯盛半杯澄清的石灰水，用来检测气体。 4、经过改进之后，就可以检测发酵过程中产生的是何种气体了。 四、实验器材 1、锥形瓶一个，“Y”形玻璃导管一根，直玻璃管一根，橡胶管一根，夹子一个，小气球一个，捆扎带一根，玻璃杯两个。 2、一杯温开水，一大勺糖，一小包酵母，半杯澄清的石灰水。 五、实验原理及装置说明 1、实验原理：酵母菌是兼性厌氧型真菌，喜欢含糖的环境，有氧时将葡萄糖分解成 co和水，无氧时将葡萄糖分解成酒精和二氧 2 化碳，同时都释放出能量。 2、装置如下图： 六、实验过程 1、在一杯温开水中加入一大勺的糖和一小包酵母，进行搅拌。将混合液倒入锥形瓶时，再将瓶内加一些温开水。 2、按上面装置图连接好，放在温暖的地方。 3、经过一段时间后，观察到液体中冒气泡，气球胀大，说明
影响酵母及酒精发酵的因素电子教材.
电子教材 4. 影响酵母及酒精发酵的因素 4.1温度温度是影响发酵的最重要因素之一。液态酵母活动的最适温度为20～30℃，20℃以上，繁殖速度随温度升高而加快，至30℃达最大值，34～35℃时，繁殖速度迅速下降，至40℃停止活动。一般情况下，发酵危险温度区为32～35℃，这一温度称发酵临界温度。 根据发酵温度的不同，可以将发酵分为高温发酵和低温发酵。30℃以上为高温发酵，其发酵时间短，但口味粗糙，杂醇、醋酸等含量高。20℃以下为低温发酵，其发酵时间长，但有利于酯类物质生成保留，果酒风味好。一般认为：红葡萄酒发酵最佳温度为26～30℃；白葡萄酒发酵最佳温度为18～20℃。 4.2酸度（pH）酵母菌在pH2～7范围内均可生长，pH4～6生长最好，发酵力最强。但一些细菌也生长良好，因此，生产中，一般控制在pH3.3～3.5之间，此时，细菌受到抑制，酵母活动良好。pH<3.0发酵受到抑制。 4.3氧气酵母是兼性厌氧微生物，在氧气充足时，主要繁殖酵母细胞，只产少量乙醇；在缺氧时，繁殖缓慢，产生大量酒精。因此，在果酒发酵初期，应适当供给氧气，以达到酵母繁殖所需，之后，应密闭发酵。对发酵停滞的葡萄酒经过通氧可恢复其发酵力；生产起泡葡萄酒时，二次发酵前轻微通氧，有利于发酵的进行。 4.4糖分糖浓度影响酵母的生长和发酵。糖度为1%～2%时，生长发酵速度最快，高于25%，出现发酵延滞。60%以上，发酵几乎停止。因此，生产中，生产高酒度果酒时，要采用分次加糖的方法，以保证发酵的顺利进行。 4.5乙醇乙醇是酵母的代谢产物,不同酵母对乙醇的耐力有很大的差异。多数酵母在乙醇浓度达到2%，就开始抑制发酵，尖端酵母在乙醇浓度达到5%就不能生长，葡萄酒酵母可忍受13%～15%的酒精，甚至16%～17%。所以，自然酿制生产的果酒不可能生产过高酒度的果酒，必须通过蒸馏或添加纯酒精生产高度果酒。 4.6 SO 2酒发酵中，添加SO 2 主要是为了抑制有害菌的生长，因为酵母对其 不敏感，是理想的抑菌剂。葡萄酒酵母可耐1g/L的SO 2。果汁含10mg/LSO 2 ，对 酵母无明显作用，但其他杂菌则被抑制。SO 2 含量达到50mg/L发酵仅延迟18～20h，但其他微生物则完全被杀死。