鱼类细胞培养及其应用_于淼
鱼类细胞培养及其在病毒学研究中的应用_李文峰
动物医学进展,2010,31(5):107-110 Pr ogress in Veterinary Medicine 专论与讲座 鱼类细胞培养及其在病毒学研究中的应用* 李文峰1,2,麦康森1,黄倢2,史成银2* (1.中国海洋大学水产学院,山东青岛266003;2.中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛266071) 摘要:鱼类细胞培养技术作为一种重要的研究和应用技术方法,自1962年发展至今,已建立了超过220个株系。鱼类病毒学是其应用最为广泛的领域。论文主要就鱼类细胞的主要株系、我国鱼类细胞培养的发展以及鱼类细胞株系对于鱼类病毒的分离、鉴定、增殖及病毒病防控研究做一综述,以期对水产动物的疾病防控具有一定的指导意义。 关键词:细胞培养;病毒学;鱼类 中图分类号:S941;S852.65文献标识码:B文章编号:1007-5038(2010)04-0107-04 细胞培养作为细胞生物学乃至生物学研究的重要技术,在生物领域中占有重要地位。动物组织(细胞)培养开始于20世纪初,发展至今已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。鱼类细胞培养晚于陆生动物,自20世纪60年代兴起,主要用于病毒学,免疫学以及生理和毒理学研究,尤其对鱼类病毒病防制具有重要意义。 1鱼类细胞培养研究现状 鱼类细胞培养的系统研究和建系实践起始于1962年W olf和Quim by建立的虹鳟性腺细胞系RT G-2,随后各种鱼类细胞系相继建立,离体细胞培养在鱼类生物技术研究中的应用日趋广泛。目前据不完全统计,世界上已经建立的鱼类细胞株系超过220株[1-13]。其中淡水鱼类和溯河洄游性鱼类的细胞系占大部分,海水鱼类的细胞系约占30%左右。 1.1国际上已经建成的主要鱼类细胞系 国内外用于研究的鱼细胞系有多种,来源的组织有吻端、肾脏、卵巢、尾鳍、膘、性腺、肝脏、胚胎、囊胚、原肠胚、鳍条等,主要包括鲤鱼(Cy p rinus catp io)上皮瘤细胞系EPC,鲫鱼(Car assius auratus)鳍细胞系CAR,金鱼巨噬细胞系GM CL,棕鮰(Pinmp halesp romehz s)性腺细胞系CCO,大菱鲆(Scop hthalmus max imus)纤维细胞T V-1、鳍条细胞系TF[2]、胚胎细胞系TEC,中华鲟(Acip enser sinensis)尾鳍细胞系[3],虹鳟(Oncorhy nchus my kiss)性腺细胞系RT G-2、前肾基质细胞TPS,褐牙鲆(Paralichthy s olivaceus)鳃细胞系FG-9307、胚胎细胞系FEC,斑马鱼胚胎细胞系ZEF、肝脏细胞系ZF-L,鲹(Car anx mate)鱼苗细胞系,大鳞大马哈鱼(Oncor hy nchus tschaw y tscha)胚胎细胞系CH SE-sp,金头鲷(Sp ar us aurata)细胞系SAF-1,太阳鱼(Lep omis macrochirus)鳃细胞系BG/G、鳍细胞系BG/F,羊鲷(Archosar gusp r obatocep halus)细胞系,银鲷(Bair diella chr y sur a)SP-1细胞系,大西洋鲑(Salmo salar)头肾细胞LSH K-1,遮目鱼(Chanos chanos)心肌细胞系及斜带石斑鱼(Ep inep helus coioides)眼睛细胞系[13]等。鱼类细胞的培养相对比较容易,对传代培养时间的要求弹性比较大,适温范围广,使得鱼类细胞系在生物学研究领域中得到广泛应用。 1.2我国鱼类细胞系建系概况 我国对于鱼类细胞培养的研究始于20世纪70年代,迄今已建立了超过40株细胞系。张念慈、杨广智建立了草鱼吻端组织细胞株ZC-7901及其上皮样细胞亚株ZC-7901S1。钱华鑫建立了鲢尾鳍细胞系等多个细胞系,并对细胞体外培养技术、保存条件以及传代细胞生物学特性进行了研究。童裳亮建立了牙鲆鱼鳃细胞系FG、鲈鱼脾细胞系SPS、鲈鱼心细胞系SPH和真鲷鳍细胞系RSBF四株海水鱼类细胞系。张铭等建立淡水白鲳鱼胚胎和尾鳍等4株细胞系。Chen在2003年-2005年建立了鲈鱼多能 *收稿日期:2009-09-20 基金项目:中央级科研院所基本科研业务费专项资金(2007-chb-01) 作者简介:李文峰(1984-),男,山东烟台人,硕士研究生,主要从事海水养殖动物分子营养与免疫学研究。*通讯作者
细胞培养技术在医药研究中的应用
细胞培养技术在医药研究中的应用 摘要：近年来，动物细胞培养技术在生物制药领域成为最受关注的热点之一，动物细胞培养技术广泛应用于动物细胞高密度培养，推动了现代生物医药 产业的发展。动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外模拟体内的: 生理环境 , 在无菌、适宜的培养条件下生长、繁殖的过程。利用人工培养的动物细胞可以进行科学研究和生物制药, 动物细胞的大规模的培养技术是生物制药中非 常重要的环节。在动物细胞培养过程中, 最重要的是使细胞的培养条件达到最 优化程度, 尽可能消除或减轻环境对细胞的影响, 因此动物细胞培养环境的控 制是细胞培养的关健技术。 关键词：动物细胞培养技术，生物制药，培养条件,人工培养。 自1885 年，Roux 从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养; Dulbecco于1943 年创建单层细胞培养已有半个多世纪。因其具有的培养简单、操作方便、消耗少、大量运用等优点，被广泛运用于生命科学的各个领域[1]。全球生物制药技术和市场的迅速发展为动物细胞培养基市场提供了快速成长的发展环境， 并使之保持强劲的发展势头。 1 细胞培养的环境及条件 1.1 无污染的环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件[3]。 1.2 适宜的温度 维持培养细胞旺盛生长, 必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同[3]。 1.3 气体环境和氢离子浓度 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一, 所需气体主要有氧气和二氧化碳[3]。 1.4 适宜的p H 值 每种细胞都有其最适p H 值。p H 值随培养的细胞种类不同而不同, 大多数细胞的适宜pH 为7.2至7.4, 偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响[3]。 1.5 培养基 培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质, 而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境[3]。 1.6 细胞培养外部环境 细胞培养是一种无菌操作技术, 对实验室、常用设施及设备、培养器皿等都有严格的要求[3]。 2 细胞培养无菌操作基本技术无菌操作技术分为: 工作环境及表面、细胞培养所用器皿、培养液与培养细胞的处理。 2.1 工作环境的处理 使用层流超净工作台是最经济有效的手段[3]。 2.2 细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒 消毒方法分为物理灭菌法( 紫外线、湿热、干烤、过滤等), 化学灭菌法( 各种化学消毒剂) 和抗生素三类。[3] 细胞培养基的质量标准及产品质量控制参考国内外细胞培养基产品企业标 准的现状，着重考虑了生物制药用户对产品质量的要求以及《中华人民共和国
高中生物 动物细胞培养和核移植技术教案 新人教版选修3
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
鱼类染色体研究进展
鱼类染色体研究进展 X 高 文(宁德师范高等专科学校生物系,福建宁德 352100) 摘要:综述了鱼类染色体在核型和显带技术研究及多倍体技术研究方面的概况和新进展. 关键词:鱼类;染色体核型;染色体显带;多倍体技术 中图分类号:Q 959 文献标识码:A 文章编号:1004-2911(2005)01-0015-03 全世界现存鱼类有22000多种,是脊椎动物中分布最广、种类最多的类群,体现多种多样的生物学特性,具有重大的经济价值.在脊椎动物中,鱼类的染色体较小,数目偏多,研究工作难度较大,进展较为缓慢,但鱼类与人类生产、生活休戚相关.保护鱼类资源,进一步开发鱼类资源,发展鱼类养殖业造福人类,对其染色体的研究必将越来越重要.本文对国内外在鱼类染色体核型、带型及染色体组多倍体研究方面成果及新进展做一概述. 1 核型研究 早期对鱼类染色体的研究,由于方法上的限制,进展缓慢.椐不完全统计,截至1980年,报道染色体核型的鱼类有1076种,到1985年已增加到1600余种[1].人们对鱼类染色体的研究,近些年发展较快, 仍偏重于核型分析.到目前为止,已报道染色体核型的鱼类有2100种左右,约占总数的10%[1~ 9].这些有染色体记载的鱼类主要集中在鲤形目和鲈形目,每个目都有150种以上,且大多数为淡水鱼类. 2 显带技术研究染色体的显带技术可以揭示染色体的精细结构,从而检测出同型染色体之间的细微结构区别,是染色体研究必不可少的手段.染色体显带技术运用于鱼类染色体结构分析,推进了人们对鱼类遗传物质的深化研究,并且取得了一系列重大成果. 2.1 Ag-NORs 硝酸银特异地染色与NORs 结合的酸性蛋白,使该区域呈黑色.Ag-NORs 法应用于鱼类染色体研究中获得可靠的结果,成为研究鱼类物种间的亲缘关系以及染色体进化的一个指标[2~8].多态性是动物染色体Ag-NORs 的一个重要特征.鱼类的Ag-NORs 一般只呈现数目多态和形态多态等2种表现形式,有些研究认为鱼类的这两种多态现象无个体特异性.因此关于Ag-NORs 的多态性一度被认为是rDNA 转录活性差异的反映,即有转录活性的NORs 方能被银染,失活的NORs 则不能被银染[9].然而,近几年有些研究表明,某些动物种内Ag-NORs 多态性的表现可能是遗传变异的产物,例如不同地理位置的红点鲑交配群的Ag-NORs 数目及分布多态的检测以及某些动物中Ag-NORs 数目及形态的个体特异性研究等文献都证实,Ag-NORs 多态性是可以遗传的[8]. 任修海等[8,10]对黄鳝进行了Ag-NORs 多态性及荧光显带的研究,发现黄鳝染色体Ag-NORs 具有明显的个体特异性的数目多态、分布多态和形态多态现象.已证实黄鳝Ag-NORs 位置变化实质上是由于NORs 分布多态性,而不是Ag-NORs 的失活所致.Ag-NORs 多态性可以作为核型进化的指标来探讨近缘物种间或物种内不同地理居群间的关系.王蕊芳等[11]通过对不同地理区域鲫鱼染色体银染核仁组织者的比较,认为在鱼类进化中,随着NORs 增大和数目的增加,DNA 和rDNA 数量也随之增 第17卷第1期 宁德师专学报(自然科学版) 2005年2月 Journal of Ningde Teachers College(Natural Science)Vol 117 No 11 F eb.2005 X 收稿日期:2004-12-03作者简介:高 文(1966-),女,讲师,福建福鼎人,现从事高校生物教学及研究.
细胞培养技术原理及应用
细胞培养技术原理及应用研究进展 姓名：赵鹏学号：158033038 专业：流行病与卫生统计学 摘要：细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术，已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。文章对细胞培养技术的应用作一综述。 关键词：细胞培养；应用；研究进展 细胞是构成机体的基本单位，是生命活动的基本单位。一切有机体（除病毒）都是由细胞组成的。细胞具有独立的、有序的自控代谢体系。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、征服疾病的关键。细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术。细胞培养技术的优点是可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，特别是研究大型动物（奶牛）时具有耗资少的优点。但模拟体内环境仍与实际有很大的差异，因此利用细胞培养技术的试验结果不可以轻易做出与体内等同的结论。 动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，现已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法[1 ]。随着细胞培养技术的不断发展，现在也广泛应用于动物生产研究。20 世纪60 年代，该技术应用于水产动物的病毒分离和纯化，对于鱼类疾病的防治具有重要作用。近年来研究发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，因此产生了联合培养细胞技术。联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系，因而更符合仿生学的原理且更有利于种子细胞的增殖与分化，为复杂的细胞诱导分化以及体外组织构建提供了新思路、新方法[2 ]。 1 细胞培养 细胞培养是将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境（无菌、适温、营养丰富）中，使高体细胞生长、发育的一种方法。按照培养的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。一般来说，圆形细胞如淋巴细胞属于悬浮型，而胞体梭型（成纤维型细胞）、扁平不规则（上皮型细胞）等属于贴壁型，贴壁型细胞必需贴附在支持物表面生长。细胞培养开始于1906 年，Harrison 用蛙新鲜淋巴液培养蛙胚神经组织4 周，首次成功地利用体外培养液培养神经元，标志着组织细胞的体外培养模式的基本建立。随着细胞培养技术的不断发展和完善，20 世纪50 年代进入繁盛阶段，细胞培养逐渐被基础研究与应用领域所应用，特别是在医学领域得到迅速的发展。目前，细胞培养技术已经涉及到生物学、农业、环境保护等领域[ 3 ]。 目前，在细胞培养过程中，只能根据离体细胞的特点和培养条件，提供满足其生长和发育的一些基本生理条件。必须在无菌条件下进行，细胞感染微生物后，会因被夺营养物质而导致细胞生长缓慢或停滞，甚至死亡。需要提供适宜的温度和pH，一般哺乳动物细胞培养的温度控制在37 ℃，鱼类的温度要低一些。温度过高或过低时，均不利于细胞生长甚至会导致细胞死亡。动物细胞最适宜pH一般控制在7.2~7.4，在此范围细胞生长活跃，增殖速度快，如果过低或过高性，细胞会因为细胞膜受损而死亡。细胞离体培养技术的关键是细胞培养液的设计，理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物质、调节物质的全部需要。细胞培养液中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质。如提供能量的物质（N源、C源）、代谢调节控制的物质（无机盐、维生素、激素）。另外，在细胞培养过程中需要提供一定量的气体（O2和CO2）。CO2具有调节pH和缓冲的作用，一般提供5% CO2。
动物细胞培养及无血清培养研究进展
动物细胞培养及无血清培养研究进展 摘要：细胞培养是生物学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。其中动物细胞培养是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。本文主要介绍了动物细胞培养和其中发展较快的无血清培养技术的研究应用进展。为未来实际的研究和生产作一些总结和展望。 关键词：动物细胞；细胞培养；无血清培养基 1 引言 组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从机体获取细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。近年来生命科学迅速发展，各种在分子水平的实验如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而各领域的动物细胞培养技术发展并不平衡，存在许多的局限性，使用范围有限，还未出现适合整个生命科学研究领域的培养体系。因此本文对细胞培养及大规模培养、无血清培养做一些总结。 2动物细胞培养 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。 2.1动物细胞培养的基本概念 细胞培养指的是从体内组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段，也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后，由于受群体环境影响，需要转移到另一个容器，这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话，则表示传代成功，这些细胞称为细胞系或细胞株。 2.2动物细胞培养技术的内容
2015 动物细胞培养技术实验报告
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
动物细胞培养技术 思考题
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
鱼类细胞原代培养及其Giemsa形态、MTT增殖分析、细胞计数
血细胞原代培养及其形态、增殖分析 1材料 1.1试剂、药品 培养基配制：血清使用时临时添加，培养基为DMEM培养基添加双抗。双抗(青霉素、链霉素)终浓度均为100μg/ml。血清为临时添加，终浓度为20%。 巯基乙醇：根据换算0.1mM的1L溶液须0.7ul巯基乙醇。换言之，以巯基乙醇与双蒸水按70ul：930ul比例配置为母液，每100ml培养基仅需1ul 双抗：先各取0.5g溶于50ml无菌双蒸水中，此时其浓度为0.1mg/ml= 10,000μg/ml,分装入250ulEP管中，此部切记EP管架。使用时每1ml加10μL即100μg/mL。剩余-4°冻存。 鉴于各组分均为使用时添加，故不进行单独过滤除菌。 培养基分装于250mL试剂瓶，血清分装于50mL试剂瓶。 PBS：NaCl:8g；KCl:2g; Na2HPO4·7H2O:1.15g（如果是12水合则为1.44g）; KH2PO4:0.2g 加水定容至1L，高压灭菌。 操作中使用一次性10ml滴定管，移液器1mL，100μL。 胰酶：以PBS添加0.25%胰酶配制。过滤除菌，此步须注射一次性过滤器0.2微米。 肝素钠：取肝素钠100mg溶于10mL生理盐水中（0.9%NaCl），以10ml离心管盛装，过滤除菌。 麻醉剂：5ml丁香酚与5ml无水乙醇混溶， 冻存液：无色甘油或DMSO加入含20%FBS培养基中，终浓度为10% MTT：取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可 Wright-Giemsa：取两样各0.5g，甲醇500ml，配成染液 台盼蓝染色液：4%台盼蓝母液，取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml滤纸过滤，4°保存。使用时用PBS稀释至0.4%。 1.2器材 离心机1、15、50ml 离心管1.5、15、50ml 脱脂棉、纱布、锡箔纸 血细胞计数板、细胞计数器 培养容器：96孔、24孔板，一次性细胞培养瓶、一次性培养皿30、60mm、载玻片、盖玻片 倒置显微镜（可拍照） 细胞培养箱 酒精喷壶 5ml、15ml一次性注射器 1000、500、250ml、100、50ml试剂瓶 一次性针头过滤灭菌器0.22um
细胞培养技术原理与应用
细胞培养技术原理及应用研究进展 ：鹏学号：158033038 专业：流行病与卫生统计学 摘要：细胞培养是指将采集体组织的细胞模拟体生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术，已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。文章对细胞培养技术的应用作一综述。 关键词：细胞培养；应用；研究进展 细胞是构成机体的基本单位，是生命活动的基本单位。一切有机体（除病毒）都是由细胞组成的。细胞具有独立的、有序的自控代体系。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、征服疾病的关键。细胞培养是指将采集体组织的细胞模拟体生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术。细胞培养技术的优点是可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，特别是研究大型动物（奶牛）时具有耗资少的优点。但模拟体环境仍与实际有很大的差异，因此利用细胞培养技术的试验结果不可以轻易做出与体等同的结论。 动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，现已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法[1 ]。随着细胞培养技术的不断发展，现在也广泛应用于动物生产研究。 20 世纪60 年代，该技术应用于水产动物的病毒分离和纯化，对于鱼类疾病的防治具有重要作用。近年来研究发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，因此产生了联合培养细胞技术。联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系，因而更符合仿生学的原理且更有利于种子细胞的增殖与分化，为复杂的细胞诱导分化以及体外组织构建提供了新思路、新方法[2 ]。 1 细胞培养
动物细胞培养总结!!!!
动物细胞培养总结 一．实验准备 1.实验器械、器皿的清洗和消毒 （1）清洗和包装 离心管，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。 蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。 取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。 过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。 过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。 玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用
蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。 （2）消毒灭菌 1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。 2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。待自然降温至常压才能打开气阀。 玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。 2.无菌间消毒及设备检查 用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。 用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。
(完整版)动物细胞培养及应用发展史
细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
细胞培养技术与应用
细胞培养技术与应用 猪流感病毒鼻拭子接种试验: 一、实验材料： 1、犬肾细胞：Madin-Darby Canine Kidney cells (MDCK) 2、DMEM细胞基础培养液 3、抗生素 4、胎牛血清 5、TPCK-胰酶 6、BSA 7、0.25%胰酶 二、接种前准备： 1、无菌内用枪头以及移液枪的准备。 2、24孔细胞培养板的准备。选取低代次的MDCK细胞，单层细胞培养至细胞密度在80%左右时，用胰酶消化后均匀铺到24孔板中。待细胞板在37度5%二氧化碳细胞培养箱中培养12-18小时代至细胞密度在80%左右时进行猪流感病毒拭子接种。 3、接种鼻拭子的准备。采取的拭子需放在-40以上的低温冰箱中，接种前把拭子放在冰盒中缓慢解冻，同时在解冻过程中加入抗生素孵育一个小时以起到抑菌的作用，孵育完后在4度离心机中5000转离心8分钟转移到新的离心管中震荡混匀。 三、接种程序： 1超净台的准备。实验前把所用超净台以及所需实验试剂和材料进行紫外照射杀菌。 2、细胞板的清洗。首先用无菌枪头弃掉细胞培养液。用DMEM基础培养液洗细胞板两次，尽可能的去除胎牛血清，因为牛血清中含有流感病毒非特异抑制素，会影响流感病毒的复制。 3、拭子的接种。每个拭子每孔接500ul做两个重复，每个细胞板留两个孔作为阴性对照，在37度细胞培养箱中孵育1个半小时，让流感病毒吸附到细胞上。 4、换液。孵育之后弃掉接种液，洗板两次。加入细胞维持液，细胞维持液为DMEM
基础培养液含有100×双抗（青链霉素）和1%BSA(维持细胞的形态)。 5、病毒液的收获。在37度细胞培养箱中培养48小时，观察细胞形态。细胞病变（CPE）特征为细胞肿胀变圆，细胞间隙增大，严重时细胞碎裂出现部分或全部脱落。用1%红细胞进行血凝试验，若有血凝则收集培养液，离心去掉细胞碎片，进行PCR鉴定以及基因型鉴定，阴性拭子盲传一代若还为阴性弃掉。 附图： 正常MDCK细胞 接毒之后细胞病变MDCK细胞
常用的五种动物细胞培养方式
?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。
动物细胞培养常用方法
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G1期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着G1-S-G2-M的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞
增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度等有关。接种细胞数量大，细胞基数大。相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）；连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增值快；；培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离培养时的一段时间，这已成
鱼类多倍体育种的研究
鱼类多倍体育种的研究 摘要：简述鱼类多倍体育种研究的简史和机制，重点介绍诱导多倍体鱼类的方法和鉴定多倍体鱼类的研究方法、步骤和原理，对多倍体鱼类的生长发育进行总结，综述多倍体鱼类在水产养殖上的应用和发展趋势。 关键词：三倍体诱导鉴定过度繁殖鱼肉品质 多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，染色体加倍通过卵子第二极体的保留或受精卵早期有丝分裂的抑制而实现。从群体，细胞，和分子水平的研究中，越来越多的资料表明，自然发生的多倍体，在群体遗传学和物种形成中有着十分重要的作用，鱼类多倍体育种在水产养殖上的应用和发展前景十分重要。 1·鱼类多倍体产生的机制 根据鱼类受精细胞学的研究，鱼类精子入卵的时间是在第二次成熟分裂的中期，受精后放出第二极体。如果让卵子受精后，因受各种理化因子的刺激而不排出第二极体，亦即它们没有经过减数分裂而形成所谓的二倍体卵核，然后与单倍体精核结合形成三倍体受精卵，而受精卵的第一次有丝分裂受到抑制，则产生四倍体。 2·鱼类多倍体的育种的研究简史 关于人工诱导鱼类多倍体的研究，再早可以追溯到20世纪40年代，Makino 和Ojima曾以鲤鱼为材料以了解人工诱导动物多倍体的机制。他们提出：如果二倍体卵核与单倍体精核结合可能形成三倍体合子并进而产生三倍体个体。不久，Svardson（1945）用接近0℃的冷水处理受精后10分钟的白鲑以及大西洋鲑与褐鳟杂种卵约26小时而得到了少数三倍体囊胚。真正诱导鱼类三倍体成功的是Swarup，他不仅以低温诱导三棘刺鱼获得三倍体，而且饲养殖性成熟。后来，Purdom（1972）报道人工诱导海水经济鱼类鲽与川鲽杂种三倍体获得成功。到目前为止先后已在三棘刺鱼，鲽，川鲽，大菱鲆，菱鲆，鲤鱼，奥利亚罗非鱼，尼罗罗非鱼，草鱼，鳙鱼，等30多种鱼类诱导多倍体获得成功。 3·诱导多倍体鱼类的方法 人工诱导多倍体的方法有三种：生物学方法，物理学方法，化学方法。 3·1 生物学方法 生物学方法主要通过杂交方法尤其是种间杂交获得异源多倍体 3·1·1远源杂交 远源杂交，是指在分类学上物种(species)以上分类单位的个体之间交配。不同种间、属间甚至亲缘关系更远的物种之间的杂交。可以把不同种、属的特征、特性结合起来，突破种属界限，扩大遗传变异，从而创造新的变异类型或新物种。鱼类远缘杂交中，尤其是鲤科不同亚种之间的杂交，往往可以产生多倍体。Marian等（1978）最早发现草鱼♀×鳙♂之间的杂种是三倍体。后来，Beck等（1980）对草鱼、鳙及其F1的染色体组型进行了分析研究，结果发现草鱼与鳙具有二倍染色体数（2n=48），而F1全部具有三倍染色体数（3n=72）。以后，Beck等（1982）又发现，当草鱼♀与鳙♂杂交时，同时出现二倍体杂种与三倍体杂种，但35.1％的二倍体杂种畸形，而三倍体杂种的畸形率仅为5.1％。吴维新等（1981）在兴国红鲤♀和
生物技术在水产遗传育种中的研究进展与应用前景
生物技术在水产遗传育种中的研究进展与应用前景摘要：本文综述了生物技术在水产遗传育种中的应用与研究,包括人工雌核生 殖和雄核生殖, 多倍体诱导, 细胞核移植, 细胞和组织培养, 细胞融合和基因工 程等。 关键词生物技术；遗传育种；水产动物；应用 1 引言 生物技术是指人们运用现代生物学、工程学和其它基础学科的知识, 按照预先的设计对生物进行控制和改造或模拟生物及其功能, 用来发展商业性加工、产品生产和社会服务的新兴技术领域。近十几年来, 生物技术迅猛发展, 方兴未艾。 本文就人工雌核生殖和雄核生殖、多倍体育种、细胞核移植、细胞和组织培养、细胞融合和基因工程在水产遗传育种方面的研究进展作一综述。 2 人工雌核生殖和雄核生殖 2.1 雌核生殖 雌核生殖是指卵子依靠自己的细胞核发育成个体的生殖行为。自然界存在这种单性生殖的水生动物, 人工诱发手段也可使未受精卵进行雌核生殖, 但产生的个体绝大多数是单倍体, 难以存活, 需紧接着二倍化的特殊处理。诱发雌核发育除了可以加快建立选育系和控制性别外, 还可以使一些稀有的隐性等位基因显现而产生新的优良胜状, 使具有重要经济性状的显性基因转为纯合状态, 雌核发育后代还可用来鉴定鱼类的近交衰退现象等。常用诱发雌核生殖的方法有射线照射、化学药品处理、带血玻璃针激活以及杂交(异质精子穿入卵但精核不参于发育)等。二倍化的方法通常使用温差(冷或热休克) 、水静压、药品（如秋水仙素和细胞松驰素B (简称C S) ）处理等。 我国蒋一硅等[1]和吴清江等[2]曾分别成功地应用了y射线辐射鱼类精液后诱导红螂鱼卵和鲤鱼卵的雌核生殖。在对虾方面的研究, 蔡难儿[3]首先报道了采用与研究鱼类人工诱导雌核发育相类似的四步诱导法对中国对虾进行人工诱导雌核发育, 育出三批雌核发育的个体但要大规模生产仍存在一定的困难。 2.2 雄核生殖 雄核生殖是指卵子只依靠雄性原核进行发育的生殖方式。人工雄核生殖同人工雌核生殖一样, 也要经过诱发雄核生殖并使之二倍化的两个步骤。目前诱发方法有去除卵核、射线破坏卵核、杂交和用过熟或老化的卵子受精等。 刘汉勤等[4]用类似方法使泥鳅精子与大鳞副泥鳅卵子授精后挑去雌核从而获得泥鳅雄核生殖单倍体。叶玉珍等[5]也用了射线处理鲤、鲤鱼类成熟卵, 获得了二倍体雄核发育鱼苗。另外, 许多研究证明不同种类的杂交可以产生雄核生殖。水产生物的雄核单倍体难以存活, 须在发育早期二倍化。