动物组织蛋白提取

实验一动物组织蛋白质的提取

【目的要求】

1、掌握动物组织蛋白质的提取方法。

2、了解动物组织蛋白质提取的原理。

【实验原理】

由于蛋白质种类很多，性质上的差异很大，即或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用，将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化液等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。

本实验采用CWBio公司的蛋白抽提试剂盒（该试剂盒带有蛋白酶抑制剂混合物，可有效避免蛋白提取过程中蛋白的降解。）提取动物组织总蛋白。

【试剂器材】

动物组织、蛋白提取试剂盒、1.5 ml离心管、-20℃储存的冰块

【操作步骤】

1、动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次。

2、称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分

钟。

3、10,000×g 离心15分钟。

4、收集上清，进行下一步的实验。

【注意事项】

在整个制备过程中使组织始终置于冰上，以防蛋白质的降解。

实验二蛋白质的定量（BCA法）

【目的要求】

掌握BCA法测定蛋白质含量的原理和方法。

【实验原理】

BCA（Bicincho ninic Acid）蛋白定量法是目前广泛使用的蛋白定量方法之一，可对蛋白质进行快速、稳定、灵敏的浓度测定。其原理是在碱性环境下蛋白质分子中的肽链结构能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。BCA 试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色的复合物。在562 nm 处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来测定蛋白质的含量。用已知浓度的蛋白作为标准品制作标准曲线，根据标准曲线查出未知蛋白浓度。

本实验采用CWBio公司的BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。本试剂盒含有牛血清白蛋白（BSA）溶液作为蛋白质标准品溶液，测定范围为20～2000 ug/ml。

【试剂器材】

BCA蛋白定量试剂盒、试管及试管架、吸管、分光光度计。

【操作步骤】

1、制作标准曲线

2、稀释样品溶液：样品1：取20微升蛋白样品加入180微升稀释液。样品2：取

10微升蛋白样品加入190微升稀释液。

3、配置BCA工作液：取试剂A 20ml，加入试剂B 0.4 ml，混匀。（注意：新配制的

BCA 工作液室温密封条件下可稳定保存24 小时。）

4、向步骤1和步骤2的试管中各加入2 ml BCA 工作液，充分混匀，37℃水浴中孵

育30分钟。

5、将各管冷却至室温。

6、用分光光度计测定562nm处每个样品及BSA标准品的吸光值，同时做好记录。

（注意：BCA 法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。因此所有样品的测定需在10 分钟内完成，否则会影响蛋白定量的准确度。）

7、绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。（注意：数据处理时需要去除明显错误

的值。未知样品浓度可以从标准曲线中查得, 实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。

如果是计算机绘制得曲线，可以从计算机给出的线性方程式计算出未知样品的浓度。）

实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

分离蛋白质

【实验目的】

1、掌握掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理。

2、学习蛋白质垂直板电泳技术

【实验原理】

聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质或核酸分离的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。通过改变单体浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于分离分子量大小不同的物质。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基乙二胺（简称TEMED）。通常控制这二种溶液的用量，使聚合在1小时内完成。（2）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加入TEMED加速反应。

聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）；②凝胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）。③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。因此，样品分离效果好，分辨率高。

SDS即十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。

与此同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋于一致，所以各种

SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异，仅仅取决于蛋白质的分子量。另外，SDS-蛋白质复合物在强还原剂（巯基乙醇）存在下，蛋白质分子内二硫键被打开，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。因此，可通过蛋白质分子量标准蛋白估计目标蛋白分子量。

本实验采用化学聚合法制胶，进行不连续的凝胶电泳，并用考马斯亮蓝快速染色，观察动物组织中的总蛋白。

【试剂与器材】

（一）试剂

1、30% 的凝胶贮备液：ACR 30g + Bis 0.8g 溶于100 mL去离子水中，用3号新华滤纸过滤至棕色瓶中，4℃避光贮存（1）。

2、1.5mol/L Tris-buffer,pH8.9：Tris base 36.6 g + 1 mol/L HCl 48 mL + ddH2O 至200 mL）

3、1mol/L Tris-HCl, pH6.8 : 12.1g Tris base 溶于40mL ddH2O中，加1mol/L HCl 96mL, 加水补至100mL.

4、5×Tris-甘氨酸电泳buffer（pH8.3):（配1L）Tris-base 15.1g + 甘氨酸94g + 5g SDS + H2O至1L（用时稀释5倍）。

5、10% SDS：称10克SDS溶解于100mL去离子水中，贮存于室温中。

6、TEMED（四甲基乙二胺）：浓度10%，20 mL，4℃保存。

7、10% AP（过硫酸铵）：10 mL，新鲜配制，分装至1.5mL 离心管中，－20℃保存待用（2）。

8、样品溶解液：内含1% SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL缓冲液。

9、考马斯亮蓝染色液(3)：0.05 g考马斯亮蓝R250溶于25 mL异丙醇里，加11 mL冰醋酸+H2O 至110 mL，用滤纸过滤除去不溶物。

10、脱色液：75 mL冰乙酸+ 50 mL甲醇+ 875 mL H2O（若只配500 mL，各物质减半）

（二）器材

电泳仪垂直板电泳槽、电泳板、微量进样器、染色/脱色摇床。

（三）蛋白电泳

1、胶板模型的安装：将玻璃板洗干净，晾干，备用。制胶时，选择合适的玻璃板，组装胶板模型。

2、按下表配方配置分离胶溶液(10 ml，可供两块板使用)，用手轻摇混匀, 小心将混合液注入准备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留足够的空间（～2.5cm）,轻轻在顶层加入0.5ml去离子水覆盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制作用。刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝胶已聚合。再静置片刻使聚合完全，整个过程约需30分钟（25℃室温）。

3、浓缩胶的制备：先把已聚合好的分离凝胶上层的水吸去，再用滤纸吸干残留的水液。按下列配方制备浓缩胶溶液：混合后将其注入分离胶上端，插入梳子，小心避免气泡的出现。

4、在浓缩胶聚合的同时，将蛋白样品与2x样品缓冲液等体积混合，置沸水或微量恒温器（100℃）中加热5分钟，马上插入冰上冷却待用。

5、浓缩胶聚合完全后，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均加入1X 电泳缓冲液，小心地拔出梳子，检查有无漏，并驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡。

6、按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，所加样品混合液体积要根据样品蛋白浓度而定(1 mg或者20ul/孔)，一孔加一个样品，同时用已知分子量的标准蛋白作对照。

7、电泳：开始时电压为约100V，待染料浓缩成一条线开始进入分离胶后，将电压增到约130V，继续电泳直到染料（溴酚蓝）抵达分离胶底部，断开电源。

8、剥胶：取下胶板，从底部一侧轻轻撬开玻璃板，用手术刀切去浓缩胶，并切去一小角作记号。

9、固定及染色：取下凝胶放入大培养皿，用考马斯蓝染色液染色并固定，最好放在摇床缓慢旋转1-2小时。

10、脱色：先用水洗去染料，再放入脱色液中浸泡，更换脱色液3-4次，约4-8小时或过夜。

11、将脱色后凝胶中的蛋白质分离色带照相或干燥，也可无限期地用塑料袋封闭在含20%甘油的水中。

【注意事项与提示】

（1)丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺具有神经毒性，因此称量时要戴手套。两者聚合后即无毒性，但为避免接触少量可能未聚合的单体，所以建议在配胶和

制板过程中都要带上手套操作。另外，配好的溶液之所以要避光保存，是

因为此溶液见光极易脱氨基分解为丙烯酸和双丙烯酸。

（2)考马斯亮蓝R-250(三苯基甲烷）染色: 每分子含有两个SO3H 基团，偏酸性，结合在蛋白质的碱性基团上。与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色。

检测灵敏度约为0.2－0.5ug。也可用银染色：将蛋白带上的硝酸银还原成

金属银、以使银颗粒沉积在蛋白带上。此法比考马斯亮蓝灵敏两个数量级，但步骤较复杂。

（3)制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作。有些型号的电泳板

可在模型中直接安装，免去了封边和拆边的麻烦，还可以同时制备多块凝

胶。

（4)AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合慢甚至不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。为避免过快聚合，可将加了催化剂的凝胶先放在冰中。

（5)加热使蛋白质充分变性。

（6)两玻璃板间凝胶底部的大气泡可阻断电流，因此必须除去。

（7)总量一般不超过20μl，点样量太多溢出梳孔，就会污染旁边泳道。每点一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。

（8)电泳时间要依据所用电压及待测蛋白分子量大小而定。

（9)考马斯亮蓝染色液盖过凝胶即可，染色后染色液要回收，可重复使用多次。（10)脱色过夜可使背景更干净，谱带更清晰。

【实验报告要求与思考题】

1、就实验中出现的各种问题进行分析讨论。

2、在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?

3、在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用。

4、为什么样品电泳前要高温加热？

17动物组织蛋白提取

1.组织块迅速置于预冷的生理盐水中，洗去表面的血迹，将组织称量后切成较小的组织块（0.2-1.0g），放入组织匀浆器中，按组织100mg：提取试剂体积1ml的比例加入相应体积的蛋白提取试剂（需提前加入酶抑制剂）进行匀浆，至组织研磨完全。 2.超声处理（同细胞蛋白样品的制备），处理完后置冰上裂解4-5小时。 3.10000 g/min离心10min，取中层溶液，加入等体积的蛋白上样缓冲液（2X），或1/4体积蛋白上样缓冲液（5x）（AR1112）,置100℃水浴箱沸水浴中变性5分钟。 1、动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次。 2、称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。 3、10,000×g 离心15分钟。 4、收集上清，进行下一步的实验。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 ①吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，细胞刮刮脱细胞，收集至离心管，1000rpm离心5分钟。洗涤后的细胞转移至洁净EP管，②冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis,Buffer 中加入10 μl磷酸酶抑制剂、1 μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF。混匀后冰上保存数分钟待用。③在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液。200μl移液器反复吹打，至蛋白析出。④4℃摇床，温和振摇15分钟。⑤14000rpm，4℃离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物。⑥BCA法测蛋白浓度。蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。 细胞提取步骤 1. 冰上操作，向细胞沉淀中加入200ul细胞裂解液，2μl 100mM的PMSF。 2. 200μl移液器反复吹打，至溶液变得粘稠。 3. 4℃摇床，温和振摇30min。 4. 15000rpm，4℃离心15min，上清即为细胞全蛋白提取物 5. 蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。

步态识别方法的分类及各类方法的比较

步态识别方法的分类及各类方法的比较 程汝珍1,2 1河海大学计算机及信息工程学院，江苏南京(210098) 2水文水资源与水利工程科学国家重点实验室，江苏南京(210098) E-mail：chengruzhen@https://www.wendangku.net/doc/ef4990744.html, 摘要：步态识别是生物特征识别技术中的一个新兴领域，它旨在根据个体的行走方式识别身份。步态识别主要是针对含有人的运动图像序列进行分析处理,所涉及到的几项关键技术包括:视频处理、图像处理、模式识别。步态识别分析可以划分为特征抽取、特征处理和识别分类三个阶段。在最近的文献中已经有许多研究尝试，提出了许多步态识别的具体方法。但国内外尚无将步态识别技术分类，本文提出了步态识别的六类分类法，且初步比较了每类方法的适用范围和优缺点，使读者较为全面了解步态识别技术现状。 关键词：步态识别；分类；适用范围；优缺点；比较 中图分类号：TP391.4 1.引言 步态识别是生物特征识别技术中的一个新兴领域，它旨在根据个体的行走方式识别身份[1]。根据早期的医学研究[2]人的步态有24个不同的分量，在考虑所有的步态运动分量的情况下步态是唯一的。精神物理学[3]中的研究结果显示即使通过受损的步态信息人们也能够识别出身份，这表明在步态信号中存在身份信息。 步态识别主要是针对含有人的运动图像序列进行分析处理,所涉及到的几项关键技术包括:视频处理、图像处理、模式识别[4]。步态识别分析可以划分为特征抽取、特征处理和识别分类三个阶段[5]。 步态识别部分 图1 步态自动识别系统框图 Fig1 the framework of gait automatic recognition system 步态识别系统的一般框架如图所示[6]。监控摄像机首先捕捉监控领域来人的行走视频，然后送入计算机进行检测和跟踪，提取人的步态特征，最后结合已经存储的步态模式进行身份识别。若发现该人是罪犯或嫌疑人，系统将自动发出警告。

组织蛋白提取

1. 提取蛋白裂解液配方： 25 mM HEPEs PH:7.4 5 mM EDTA 5 mM EGTA 50 mM NaCl 1 mM Na3VO3(矾酸钠) 1 mM sodium phosphophate 0.05% SDS 0.05% sodium deoxycholate (脱氧胆酸盐) 1% Triton-X 100 5 mM NaF 0.1% 2-mercaptoethanol 1 mM PMSF (1ul 100mmol/L+纯水99ul) 1uM Microcysin-LR 40ug/ml pepstatin A 40ug/ml aprotinin 40ug/ml leupeptin 2..组织蛋白提取及定量： 称量组织重量置小烧杯 用PBS清洗1-2次 加入组织裂解液【悬浮buffer储存液500ml+苯甲基磺酰氟（PMSF，有毒物）30+leapeptin （蛋白抑制酶）0.5ul于EP管混合，倒入盛组织的烧杯】 置冰上5min 用眼科剪剪碎 倒入5ml匀浆器（反复抽吸匀浆组织） 倒入或吸入EP管 离心（4°C 1000g 10min）取上清 用于蛋白定量或储存于-80°C 蛋白定量 取5ul蛋白样本+15ul去离子水（DW）+200ulBCA（A:B为50:1即196:4），分别混合样本与DW和BCA的A液与B液置于干净的96孔板上37°C，30min

酶联免疫测OD值（570nm，ELX-800型酶标仪） 由OD值计算蛋白浓度（用excel表或用下列公式计算） （OD值×987.7108－198.342）×103ng/ul；OD=样本OD值－空白对照OD值）

总蛋白的提取

1.单层贴壁细胞总蛋白的提取： （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4 ）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5 ）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6 ）于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷） （7 ）将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于－20℃保存。 2. 组织中总蛋白的提取： （1 ）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 （2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。 （3 ）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 （4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： （1 ）将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。 （2 ）弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 （3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 （4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 含量测定

各种动物蛋白原料的加工方法

各种动物蛋白原料的加工方法 1、鱼粉的加工海杂鱼、淡水鱼及海产品加工下脚料等，均可作为鱼粉加工的原料，先将原料通过晒干、烘干或水煮后晒干等程序，然后加工成粉状即成，水煮法经高温处理，质量一般较好。 2、肉骨粉的加工主要原料是肉食品加工下脚料，以及不合乎卫生要求的动物屠体组织，将原料加水蒸煮，一般脏器煮1小时，头、蹄组织煮2-3小时。煮后去掉汤表面的油脂，经烘干粉碎即成。加工较好肉骨粉呈淡红色，水分不超过6%，粗蛋白质含量达40%以上。 3、血粉的加工主要以屠宰动物血液为原料，将血液放入锅内加热，直到血液凝固和水分蒸发后，晾在水泥地板上直至干燥，然后加工成粉状即成，值得注意的是：血液加热时要不断搅拌，加入0.5%-1.5%的生石灰，煮后将血块装入麻袋内挤压沥水，使水分沥掉50%以上，再晾晒，并每隔1-2小时翻动1次，直至晒干为止。加工血粉蛋白质含量可达70%-80%，水分不超过10%，土法加工的血粉应立即饲喂。 4、羽毛粉的加工原料为禽类羽毛。将羽毛用水冲洗干净、晒干，然后在耐酸的锅中按1:6的比例先放入羽毛，再放入0.2%的稀盐酸液，加盖煮沸到用手轻轻拉断时捞出，沥去酸液，然后在阳光下晒干，用粉碎机加工成粉即可。加工好的羽毛粉蛋白质含量在70%左右。 5、骨粉的加工以动物骨头为原料，将动物骨头放入普通锅中连续煮沸7-8小时，待骨头上的脂肪煮出后，在阳光下晒干，然后加工成粉状即成，也可将骨头堆在金属架上进行焙烧，粉碎后即成骨粉，骨粉是补充钙磷元素的好饲料。 6、蛋壳粉的加工以新鲜洁净蛋壳为原料，将蛋壳洗净放入锅内煮沸，

捞出后再放入60℃的铁锅内焙炒，炒脆后取出粉碎即成蛋壳粉，蛋壳粉是补充钙的好饲料。 7、蚕蛹的加工蚕蛹是缫丝工艺的副产品。将蚕蛹放入锅内，反复煮沸数次，去掉油脂，捞出后晒干、粉碎成末即成蚕蛹粉，蚕蛹粉含粗蛋白质为45%左右，适宜饲喂猪及家禽。

蛋白提取步骤

提蛋白及WB得步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作:前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、 当天准备:洗玻璃板、开紫外,冰块、碎冰、标记１.５ｍl 离心管及0。6ｍl离心 管、细胞刮板、开低温高速离心机 细胞裂解液配制: 1ml celｌlｙsis 10ul NP－40(离心机后) 25ul 焦磷酸钠 ４0ul ＮaＦ 1ul β—甘油磷酸 2 ul Na3VO４ 1ul 蛋白酶抑制剂(用完即放回冰箱) 10ul PMＳＦ(最后加,随加随用,有毒) 细胞裂解与收集 1.观察细胞状态,并准备提蛋白:吸走培养基、用PBS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBS,左右轻轻 摇),倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上,加裂解液(体积网上推荐:一般1０6加0。１ml ),冰上静置１-２min。 3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从 上往下全面刮,(刮得时候要迅速),最后用枪吸取裂解液至离心管、 细胞破碎 4.超声波破碎细胞:准备三个小烧杯,加满冰块,三个小夹子。(超声波破碎仪得铁棒不要碰到 离心管得壁与底部) 超声波设置: 工作功率5% 工作时间３min 开机时间15s,关机时间３０s 温度０度, 报警温度1度 5.4℃、13００0r／mｉｎ,离心１5mｉn、(离心机用后一直保持打开得状态,) 蛋白保存 6.蛋白保存及分装:吸上清液至0。6ｍl离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。-80℃保 存。 注意事项:PMSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30min内就会降解一半。样品处理超过１ｈ,补加一次。 ＢCA测定蛋白浓度 1、测空白板,选差异较小得孔。 BCA测定法波长570,Bｒacforｄ:595 2、标准蛋白得稀释(5mｇ/ul):分装1ml PBS来使用,稀释标准蛋白至0.5mg/uｌ。 取5ｕｌ标准蛋白+４5ul ＰＢS

步态识别论文

课程论文 步态识别 学号：12426009 班级：通信122 ：楚舒琦 目录 摘要 (3) 一、背景介绍 (4)

二、相关研究 (4) 三、主题（算法） (5) 3.1基于线图模型的动态特征提取 (6) 3.2基于整体的静态特征提取 (8) 3.3识别 (9) 四、实验 (9) 五、结果讨论 (12) 六、总结 (12) 七、应用前景 (13) 八、技术难点及解决途径 (14) 8.1技术难点 (14) 8.2解决途径 (15) 九、参考文献 (16)

摘要 步态识别是一种新兴的生物特征识别技术，旨在通过人们走路的姿态进行身份识别，与其他的生物识别技术相比，步态识别具有非接触远距离和不容易伪装的优点。在智能视频监控领域，比面像识别更具优势。对步态识别的优缺点以及步态识别所涉及到的运动分割、特征提取与选择、模式识别算法进行了综述,并对步态识别中存在的问题与未来的研究方向进行了讨论。 关键词:生物特征识别;步态识别;特征提取;运动分割;动态时间规正

一、背景介绍 步态是指人们行走时的方式，这是一种复杂的行为特征。罪犯或许会给自己化装，不让自己身上的哪怕一根毛发掉在作案现场，但有样东西他们是很难控制的，这就是走路的姿势。英国南安普敦大学电子与计算机系的马克·尼克松教授的研究显示，人人都有截然不同的走路姿势，因为人们在肌肉的力量、肌腱和骨骼长度、骨骼密度、视觉的灵敏程度、协调能力、经历、体重、重心、肌肉或骨骼受损的程度、生理条件以及个人走路的"风格"上都存在细微差异。对一个人来说，要伪装走路姿势非常困难，不管罪犯是否带着面具自然地走向银行出纳员还是从犯罪现场逃跑，他们的步态就可以让他们露出马脚。 人类自身很善于进行步态识别，在一定距离之外都有经验能够根据人的步态辨别出熟悉的人。步态识别的输入是一段行走的视频图像序列，因此其数据采集与面像识别类似，具有非侵犯性和可接受性。但是，由于序列图像的数据量较大，因此步态识别的计算复杂性比较高，处理起来也比较困难。尽管生物力学中对于步态进行了大量的研究工作，基于步态的身份鉴别的研究工作却是刚刚开始。步态识别主要提取的特征是人体每个关节的运动。到目前为止，还没有商业化的基于步态的身份鉴别系统。 二、相关研究 信息融合：感知融合是人类感知外部世界的本能之一。人类可以非常自然地运用这一能力把来自人体各个感知器官眼耳鼻四肢的信息图像声音气味触觉组合起来并使用先验知识去估计理解和识别周围的环境以及正在发生的事情。融合理论正是对人类这一本能的模仿旨在利用计算机技术对按时序获得的多源观测信息在一定准则下加以自动分析综合以完成所需的决策和估计任务而进行的信息处理过程。 信息融合的基本原理就像人脑综合处理信息一样充分利用多源信息通过对这些多源的观测信息的合理支配和使用把多源信息在空间或时间上的冗余或互补依据某种准则来进行组合以获得被测对象的一致性解释或描述。按照信息抽象的个层次可将信息融合分为3级（像素级融合特征级融合和决策级融合）。 像素级融合是在采集到的原始数据上进行的融合是原始测报未经预处理之前就进行的综合和分析是最低层次的融合。

植物组织蛋白提取方法

植物蛋白质提取方法总汇 一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清液，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法 氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm 以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！

三、组织：肠黏膜 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量） 倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清 加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量） 振荡，置室温20min 离心： 7500g，5 min，4度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次 沉淀中加入100％乙醇 2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀 1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。 四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根 1、200毫克样品置于冰上磨碎 2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清 3、重复离心5min

动物组织胚胎学专升本作业题参考答案

东北农业大学网络教育学院 动物组织胚胎学作业题 作业题（一） 一、名词解释 1.组织学：是研究动物体微细结构及其与功能关系的科学。研究容包括细胞、组织和器官组织三个部分。 2.胚胎学：是研究动物个体胚胎发育的科学。 3.皮：衬在心、血管和淋巴管面的上皮叫皮。皮薄而光滑，有利于血液和淋巴的流动以及皮细胞外的物质交换。 4.肌节：肌原纤维之相邻两Z线之间的部分，称为一个肌节，是肌肉收缩的基本结构和机能单位。 5.胎盘：是胎儿与母体进行物质交换的结构，它由胎盘的胎儿部分和母体部分所组成。 6.神经元：神经细胞是一种高度分化的细胞，具有很长的突起，能够感受刺激和传导神经冲动，是神经组织结构和机能的基本单位，因此又叫神经元。 7.骨单位：是位于、外环骨板之间的一些平行于骨干长轴排列的圆柱体。它们由许多呈同心圆排列的筒状骨板和中央的哈氏管所组成。 8. 胰岛：是胰腺中的分泌细胞团，散在分布于胰腺外分泌部的腺泡之间。胰岛主要有A、B、D、PP四种细胞，它们都具有蛋白质分泌细胞的超微结构特点；分别分泌高血糖素、胰岛素、生长抑素、分泌胰多肽。 9.尘细胞：肺巨噬细胞：数量较多，广泛分布于肺间质，也可进入肺泡腔。来源于单核细胞，有活跃的吞噬、免疫和分泌功能，起重要的防御作用。当吞噬进入肺的尘粒后，称为尘细胞。 10.肾单位：肾单位是尿生成和排泄的基本单位，由肾小体和肾小管两部分构成。 二、判断下列句子正确与否并用“√”或“×”标明 1～5√××××；6～10××××√ 三、单项选择 1～5DCDDB ；6～10DCBCA 四、填空题 1.细胞膜、细胞质、细胞核。2髓鞘、神经膜（施万）细胞。3骨骼肌、心肌、平滑肌。 4表皮、真皮和皮下组织。5过滤淋巴、参与免疫应答、产生淋巴细胞。6 鼻、咽、喉、气管、支气管、肺。 五、简答题 1. 外分泌腺的腺细胞有几种分泌方式，举例子说明。 1)透出分泌：分泌物以分子的方式透出细胞膜，例如胃壁细胞盐酸的分泌。 2）局部分泌也叫胞吐分泌。所形成的带包膜的分泌颗粒逐渐移到细胞的游离面并与质膜融合，将容物胞吐出去，细胞膜本身不受损伤。唾液腺和胰腺外分泌部都是此种分泌方式。 3）顶浆分泌胞质中形成的分泌物移到游离面质膜下后，顶着质膜向外突出，最后自突出部位与细胞折离，损伤的质膜很快修复。乳腺和汗腺细胞都为顶浆分泌。 4）全浆分泌当胞质充满分泌物后，细胞发生死亡性变化，最后整个细胞解体，连同分泌物一起排除，由邻近的腺细胞补充。皮脂腺细胞属于全浆分泌型。 2. 哺乳动物血液的组成。

动物组织各种固定液及优缺点

动物组织各种固定液及优缺点 编 号 类别名字配方优缺点或备注 甲醛：从组织学的观点来说,甲醛是一种良好的固定剂,它有很多的优点:1. 组织收缩较少,损伤少,保存固有物质好.2. 固定均匀,穿透力强.3. 能使组织硬化,增进组织弹性,有利于切片.4. 能保存脂肪及脂类物质.5. 成本较低. 缺点:1. 杂质含量较多,如甲醇,可钝化酶类,影响反应.2. 含有微量甲酸,导致固定液酸变,影响染色.3. 可产生福尔马林色素,影响观察.4. 不能固定尿酸和糖类物质.5. 容易挥发,污染环境,可导致标本干涸.6. 可长期存在于固定过的组织上.有人做过实验,组织用甲醛固定后在流水中冲洗5小时后,仍留有相当多的甲醛与蛋白质相结合,临床活检不用.因此要特别指出的是,在其后的各种技术操作中,要特别注意到甲醛的存在,必须要想办法除去它,否则将会给各种染色造成影响,甚至导致失败。 1 10%缓冲福尔马林固 定液甲醛100ml 蒸馏水900ml NaH2PO44g Na2HPO4 6.5g 该固定液是当今流行的固定液,因它对组织固 定较好,损伤较少,因对其后的各方面研究都较 好,尤其是对免疫组化的染色. 2 10%福尔马林固定液甲醛100 ml 自来水900ml 这是一种最简单的固定液，适合于边远地区携带的固定液，但由于它的单一性，因此，只要有条件的单位都不要求使用这种固定液。 3 10%福尔马林盐固定 液甲醛100ml 自来水900ml Nacl 9克 先将Nacl溶于水，再加入甲醛。这也是一种 较为简单的固定液，但由于加入Nacl，它是 一种重金属盐物质，加入了它可促进和改善染 色，增加染色的强度 4 Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液 75ml 甲醛 2 ml 冰醋酸 5 ml 该固定液中的冰醋酸，对胶原纤维等组织有膨胀作用。而甲醛对组织有收缩作用。两种试剂的混合使用，用以抵消彼此间的副作用。使组织固定达到优良的固定水平 5 醛糖钙固定液甲醛100ml 蔗糖300ml 乙酸钙20g 蒸镏水90ml 先将蔗糖和乙酸钙溶于蒸镏水，后加入甲醛。该固定液对于做酶的组织化学的研究效果较好，组织固定后，做冰冻切片，再给予显示。 酒精：优点：1、可保存尿酸结晶和糖原等物质。2、能在任何比例的情况下与水混合，如组织的脱水，切片染色前后都离不开酒精，通常都用95%的工业酒精来配成60%、70%、80%、90%等不同的浓度来使用。 3、可溶解苯类物质为染色步骤中的桥梁试剂。常规活检等切片上的石蜡必须除去，才能进行染色，能除去石蜡的物质有苯及汽油等，因此称它为桥梁试剂。 4、能除去切片上的水份，使切片无水化。切片经染色后，到无水酒精中已完全无水，这样处理对于切片的保存是有好处的，否则，切片将会褪色。5，可与其它试剂配成多种的混合固定液，加快固定，它的缺点是：1、可溶解脂类物质，凡要证明组织是否含有脂类和类脂物时，切不能用含有酒精的固定液去固定组织，也不能用石蜡切片。2、对组织收缩较大，不宜作单纯固定液。3、渗透力不强。当用酒精固定组织时，组织表面很快就被固定，并形成了一层蛋白膜，这层膜可阻挡固定液向里渗透，造成了中间组织固定不佳的现象。4、可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，凡经酒精固定的组织，核的染色都不好。 5、可脱去切片上已着染的各种颜色，切片经染色后，一是必须洗去多余的染液，二是必须脱去切片上的水。在用酒精洗切片时，必须仔细地掌握显微镜下观察，还要掌握酒精的浓度，低浓底的酒精脱色力强，稍不注意，便可脱去切片上大部分的颜色。切片脱水时，要较快地通过低浓度的酒精，以免使已着染的颜色被脱去。

Western blot步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程(全) (1)

Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤 高征 2014年6月

第一部分 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程(碧云天试剂盒) 一、原理 在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。 本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。 二、注意事项 1.需自备PMSF。PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。 2.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 3.本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。可以抽提的组织样品数通常不足100个。 4.使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产 的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。 5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 三、使用说明 1. 准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF 的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。（蛋白酶抑制剂可酌情翻倍） 2. 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液（0.5%

蛋白提取方法

?1 材料与方法 1、1 材料 1、1、１组织与细胞得来源: ?１。1、2 仪器设备?机械组织匀浆器?低温高速离心机(＞40,０0０g) 超速离心机?超生细胞破碎仪 超纯水装置 ??1、1。3 试剂 三氯醋酸(TCＡ) 丙酮 二硫苏糖醇(DＴT) ?尿素?CＨAＰS?PMSF?EDTA ?乙醇?磷酸 考马斯亮蓝Ｒ3５0 ?抑肽素Ａ?亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。? 1。１、４溶液配制?(1) PBS: ?NａCl８g,KCl 0、2 g,Na２HPＯ4 1。44 g,ＫH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pＨ至7.4,用纯水定容至1 L; ?(2)ＥDTA 储存液: 18.61g Na2EDTA?2Ｈ２O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节ｐH值至8.0(约需2 g ＮａＯH颗粒),定容为100 ml、可高压灭菌后分装备用;?(３) 亮肽素储存液(50 μg/ｍl,100×) １0mｇ/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ｍl储液,-２0℃保存; (4) 抑肽素储存液(7０μg／ml,10０×) 1 mg／ｍl溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成７0 μg/ml储液,-2０℃保存; (5) PＭＳＦ储存液(１０ｍM,100×): １７.4mｇPMＳF,溶于１ml异丙醇中,—２0℃保存。?ＤTT储存液(1 M): ?０。31ｇDTT溶于2 ｍlＨ2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。?(7) 裂解液: Lysis bufｆｅr Ａ (９M ｕｒeａ,４%ｗ/v ＣＨAＰS, 1％w／v DTT, ０.5％CA and a cｏｃktaiｌof ｐｒoteａｓｅinhibitｏrs)??Lysｉs buffer B (7 M urｅa, 2M ｔhiｏuｒea,4% w/v ＣHＡＰS, 1％w／v DTT,０、５% CA ａnｄａcocktaiｌoｆｐroteａse inhｉbitors) ?Lysｉｓbｕｆｆer C 40 ｍＭTrｉs－base (ｐH 9。5)iｎｕltrapｕｒe H2O Ｌyｓis buffer D (8 Ｍurｅa, 4％CHＡＰS, 4０mM Tris(ｂasｅ), 40 ml) ?Lyｓｉs buffer E ?(５M urea, 2 M tｈioｕreａ, 2％SB3-10, 2％CHAPS,１% w/v DTT, 0、５% CＡandａcocktａｉl ｏｆproteaｓe inhibitors) 100μL SDＳsaｍple solｕｔion (1% w/v SDＳ, 0、3７５M Ｔｒiｓ－HCl, pH8。8, 50 mM DTＴ,２5％v／ｖgly ?LysiｓbｕfｆeｒＦ? ｃeroｌ) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DＴT在临用前加入。?蛋白酶抑制剂混合物［3]?成分终浓度?蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml oｒ 1 mM EDTA 0、３mg/ml (1 ｍM) 抑肽素 0。7 μg/ｍl?亮肽素 0、5μg／ｍl? 1.2 方法?1。1.1组织蛋白提取方法 １、２.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1］?(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步; (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织; ?(３)将粉末悬浮于含DTT(0。2％w／v)得10％三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中; (4)蛋白–２0℃沉淀过夜; ?(5)35０00×g(6℃)离心30min; ?将沉淀重悬于含０.2％DTT得预冷丙酮中; ?(7)-2０℃放置1h; 350０0×g(6℃)离心30min; (9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀; 15℃,40000×ｇ,离心1hr; (10)在裂解液中重新溶解沉淀(5０－10０ｍg组织需要1ml裂解液); ?( ) 11 (12)用Ｂraｄｆoｒd法[2］测定上清得蛋白浓度,分装后置–75℃保存。?1、2、1。2超速离心法?(1)取材; ?(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品

提取蛋白的常规方法

1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间

蛋白提取实验步骤

蛋白提取实验步骤： 1、细胞总蛋白提取 A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B、对于贴壁细胞: a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。 C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取： A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。 B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 注意事项 1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。

4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。

蛋白质提取与制备的原理和方法

蛋白质提取与制备的原理和方法 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白 类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。 真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如

动物固体组织蛋白提取-Protocol(可编辑修改word版)

WT LOST 动物固体组织蛋白提取 Protocol 1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入 75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。 2、 裂解液配制：RIPA ：PMSF=100：1，现配现用。（1000ulRIPA+10ulPMSF ）。置入 4℃冰上。 3、抽蛋白（应冰上进行）： a 、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般 10ml 管体系中加入：7-8 粒磁珠、100mg 组织、1mlRIPA+10ulPMSF 、1 tablet Cocktail 。 b 、匀浆。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块， 一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8 分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机 10000～15000r/min 上下研磨制成 10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒，连续 3～5 次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用 Soniprep150 型超声波发生器以振幅 14 微米超声处理 30 秒使细胞破碎， 也可用国产超声波发生仪，用 40 安培，5 秒/次，间隙 10 秒反复 3～5 次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶 3 次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复 3 次左右），但有部分酶活力会受影响。 c 、将组织匀浆转入 1.5ml 的 EP 管中（eppendorf 管、离心管）。12000r/min 4°C 离心 15min 。 d 、离心后 EP 管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的 EP 管中。可-80℃保存。4、蛋白浓度测定。 a 、配工作液：溶液 A ：溶液 B=50：1（200ul ：4ul ）。 需测试复孔。标本 X ，则需 A 量=2* ；B=2*（X+1+1）*4。 c 、复孔，取蛋白 6ul 加入 0.6mlEP 管，再加入 54ulH 2O ，混匀。即 10 倍稀释。 d 、取 20-25ul 10 倍稀释蛋白样本加入 96 孔板平底板内，再加入 200ulAB 工作液，混匀振荡后，37℃ incubat e 30min 。 注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加蛋白后需换 tip ，再加入工作液即起反应，应缩短时间。 e 、酶标仪检测 562nm 吸光度。Program f 、计算蛋白浓度。 根据标准曲线，如 Y=1.2745X-0.1684 其中 Y ：蛋白浓度；X ：吸光度。 最终蛋白浓度为：10*Y （ug/ul 、mg/ml ） g 、蛋白样本放-80℃冻存。 大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化， 这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。 Commassie 法（Bradford 法）： 原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料 G-250 结合，颜色从棕色变为蓝色，在 595nm 处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。 BCA 法： 原理：在碱性条件下，蛋白将 Cu++还原为 Cu+，Cu+与 BCA 试剂形成紫色络合物，测定其在 562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 现对这两种方法进行比较： 一、实验材料： 细胞总蛋白提取试剂盒（AR0103）

脂肪组织蛋白的提取方法.doc

①用液氮研磨的方法更佳，具体方法可以联系本公司****@***.c*m索取详细资料。 beibokit https://www.wendangku.net/doc/ef4990744.html, - 2 - 产品说明书 相关产品： 产品 总蛋白提取试剂盒核蛋白提取试剂盒 膜/胞浆/核蛋白分步提取试剂盒Bradford蛋白定量试剂盒ECL化学发光检测试剂盒细胞蛋白提取试剂盒组织蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒昆虫蛋白提取试剂盒磷酸化蛋白提取试剂盒SDS-PAGE凝胶配制试剂盒总蛋白提取试剂盒（2D电泳用）植物蛋白提取盒（2D电泳用）细菌膜蛋白提取盒（2D电泳用） 产品号BB-3101 BB-3102 BB-3104 BB-3411 BB-3501 BB-3121 BB-3122 BB-3123 BB-3125 BB-3126 BB-3105 BB-3702 BB-3181 BB-3183 BB-3187 产品 磷酸化蛋白富集试剂盒膜蛋白提取试剂盒活性蛋白提取试剂盒BCA蛋白定量试剂盒植物核蛋白提取试剂盒细菌膜蛋白提取试剂盒植物总蛋白提取试剂盒植物膜蛋白提取试剂盒

蛋白酶抑制剂混合物真菌蛋白提取试剂盒磷酸酶抑制剂混合物SDS-PAGE上样Buffer 细菌蛋白提取盒（2D电泳用）酵母蛋白提取盒（2D电泳用）线粒体蛋白提取盒（2D电泳用） 产品号BB-3108 BB-3103 BB-3106 BB-3401 BB-3154 BB-3151 BB-3124 BB-3152 BB-3301 BB-3127 BB-3311 BB-3703 BB-3182 BB-3185 BB-3191 beibokit https://www.wendangku.net/doc/ef4990744.html, - 3 -