干细胞提取过程

干细胞提取过程 Prepared on 22 November 2020

一、实验准备

1通知来血后，就应开始做实验准备，准备采集盒里面要有一个采血袋、采血管、温度计放置于有冰袋的保温箱里交给运输人员，保持运输温度高于4℃低于20℃.

2实验室要事先做好清洁，打开传递窗口的紫外灯和生物安全柜的紫外灯，需照射30min，吹风10min。

3准备的物品：信息采集室要有无尘布、酒精棉球、棉签、喷壶、手套、储物盒、垃圾桶、垃圾袋、最好有热合机；

在洁净室要准备，5ml、10ml、20ml、50ml注射器各2-3个，冷冻袋1个，剪刀3把，止血钳3把，EP管2-3个。

二、信息采集

1接收到采集盒，带上手套，并喷上酒精消毒，打开盒子检查里面的物品，采血袋，采血管是否破损，有无漏血现象，并把各个管道的夹子夹紧。

2填写各种信息表格。《脐血接收登记表》、《脐血交接记录》、《脐血采集信息等记表》、《脐血供者健康信息调查登记表》。

3按照公司规定打印标签，等酒精干后在采血袋上贴标签。

4把采血袋放入储物盒里放到传递窗中。（传递窗口应用紫外照射30min，吹风10min）

三、脐血制备

1到洗手间把采集室所带的手套扔掉，用洗手液彻底把手洗干净。

2在一更换鞋，并脱掉日常穿的白大衣放在衣柜里；二更换洁净服，戴上帽子、口罩、手套。

3进入洁净室，从传递窗口把脐带拿到天平工作台上，称重采集袋毛重，称重时应注意管子别掉到天平外面，以免称重不准确。

脐血重量=采血袋毛重-采血袋净重

4计算应加入HESPAN的体积，按照HESPAN:脐带血=1:4加入HESPAN。

5把采血管热合掉（就是连接针头的那一根长管）。

6用托盘把采血袋和HESPAN放入生物安全柜，放入之前应用酒精喷洗一遍。拿一只5ml的注射器从采血袋的热合掉的端口扎入，抽取1ml的全

血打入EP管中用于提取前细胞计数，然后再把针孔热合掉。拿一只

20ml的注射器从装HESPAN袋的黄色端口扎入抽取相应体积的

HESPAN溶液，注入到采血袋中，并热合掉针孔。（注意：每一次注射

器扎入前，端口部位必须先用碘伏擦拭一遍再用酒精擦拭一遍）。剪一

段封口膜，一面用碘伏擦一遍再用酒精消毒一遍，凉干后缠绕黄色端口

确保针孔被密封严实。把HESPAN拿出生物安全柜。

7打开低温离心机，配平，把采血袋倒置放入并固定好，开始离心，

4℃,10min，1000转。

8在离心期间可以开始细胞计数，打开血细胞计数仪，按照机器的规章操作，记录好数据（红细胞、白细胞、血小板数目）并存档。

9第一次离心结束后，把离心过的采血袋倒置的悬挂在分浆夹的固定挤压板上，用止血钳夹住通向红细胞分离袋的管道，打开管道上白色的卡

子，活动一下出红细胞的端口，松开活动挤压板，并打开止血钳使红细

胞缓慢的流出，将要流完夹紧止血钳，封闭管道上白色的卡子，红细胞分离结束。

10第二次离心，配平，条件和第一次一样，这一次是正置放置采血袋，4℃,10min，2000转，离心结束后操作和第一次一样，分离出血浆，里

面如果不够25ml应回流一部分血浆。

11把去除红细胞和血浆的部分即我们所要的单个细胞用5ml的注射器抽取1ml来，打入EP管中用于细胞计数。用50ml的注射器把剩余的部分全

部抽取出来，打入冷冻袋中，用一只10ml的注射器抽取相应量的冷冻

液从冷冻袋的另一端口注入。(单个细胞悬液：冷冻液=5:1)。在操作过程中应把放置在冰袋上匀速摇动。注意：打开任何端口消毒步骤都要同6。

12在冷冻带上贴上标签，放入冷冻盒中，在冷冻盒上写上标签。把冷冻盒放入程序降温仪中降温，继而放入液氮永久保存。

13细胞活性检验：按照细胞裂解液的说明，用台盼蓝染色，在光学显微镜下用肉眼计数，观察100个细胞里存活率即可。细胞计数板的用法和细胞裂解液用法不在这里说明。

四、微生物检测

1从冰箱里拿出一个血平板，在上面滴加1ml左右的血浆。

2放入恒温培养箱，做好记录，至少要观察三天以上。