苹果酸脱氢酶的克隆_表达与生物活性的研究_杨柳青
药 物 生 物 技 术
Pharmaceutical Biotechnology 2003,10(2):77～83
苹果酸脱氢酶的克隆、表达与生物活性的研究
杨柳青1,李 萍2,何 南3,袁伟春2,张玉彬1
(1.中国药科大学生物制药学院,南京210009;2.东南大学生物医学工程系分子与
生物分子电子学教育部重点实验室,南京210096;3.中国药科大学制药有限公司,南京210009)
摘 要 根据大肠杆菌DNA中苹果酸脱氢酶的序列合成上下游引物,以大肠杆菌E.coli DH5α基因组为模板通过PCR扩增得到苹果酸脱氢酶的基因,将该基因与表达载体pET28a连接构建重组子,将该重组子转化入大肠杆菌E.coli BL21构建工程菌,通过IPTG诱导表达苹果酸脱氢酶,并初步测定了该菌株拆分DL-苹果酸的能力。
关键词 D-苹果酸;苹果酸脱氢酶;克隆;表达
中图分类号:Q554.9;Q785 文献标识码:A 文章编号:1005-8915(2003)02-0077-07
D-苹果酸(D-malic acid)是一种非天然有机酸,分子中有3个功能基团:2个羧基和1个直接连接于手性碳原子上的羟基,是一种极其重要的4碳有机手性源,主要应用于手性药物、手性添加剂、手性助剂等领域,它在制药行业作为手性合成的手性源,在某些手性化合物的不对称合成过程中具有不可替代的作用,可用于合成泛酸,β-内酰胺类抗生素,信息素和生物碱等手性药物[1]。
传统化学法合成的手性药物多数以消旋体形式上市,1992年美国FDA开始要求手性药物以单一对映体(对映体纯)形式上市[2]。手性药物的最大特点是疗效确切,副作用小,临床用量少。手性药物的制备已引起了国内外医药界的广泛重视[3]。随着医药工业的发展,近年来,全世界对D-苹果酸的需求量增加,从而引起了一些国家对D-苹果酸的研究和生产的兴趣。
D-苹果酸的生产方法可分为两种:化学合成法和微生物转化法。与化学合成法相比,微生物转化法效率高,能耗低,而且清洁环保,日本已经能通过微生物转化法生产D-苹果酸[4,5]。目前国内的D-苹果酸几乎全部依赖进口,因此,研究用微生物转化法工业化生产D-苹果酸具有重要的经济价值和科研价值。
目前关于微生物转化法生产D-苹果酸的报道主要集中在野生菌的选育[6,7],而通过分子克隆的手段构建能大量表达苹果酸脱氢酶的工程菌国内尚未见报道[8～10]。本研究是将编码MDH的基因克隆到表达载体中,构建重组菌。诱导表达MDH蛋白[11],然后用于拆分D L-苹果酸。
1 材料与试剂
1.1 菌种和载体
E.c oli DH5α,E.coli JM109,E.coli B L21均为本实验室保存菌种,
pE T-28a由本实验室自产。
1.2 药品和试剂
D-苹果酸,L-苹果酸,D L-苹果酸(Sigma公司); Taq plus DNA polymerase、IPTG、X-gal(美国Promega 公司);dNTP(上海Sangon生物工程公司);T4 DNA Ligase(MBI公司);凝胶回收试剂盒(上海华舜生物工程公司);限制性内切酶(MBI,大连Takara公司);D NA Marker、Pr otein Mar ker(MBI公司)。
1.3 PCR引物
参照Malate Dehydrogenase基因序列[8]设计,由上海Sangon生物工程公司合成。分别在上、下游引物中引入Nde I和BamH I限制性酶切位点,引物序列如下:
MDH上游引物(W42492) 5'GGAATTC-
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收稿日期:2002-11-8
作者简介:杨柳青,男,1975年生,1999年～2002年于中国药科大学微生物与生化药学专业就读硕士研究生,研究课题是“微生物对映体消耗法生产D-苹果酸的研究”,2002年6月毕业,获硕士学位。
联系方法:138******** Email:lqyoung@https://www.wendangku.net/doc/ee9270061.html,
C ATATGAAAGTC GCAGTCCTCGGC3'
MDH下游引物(W42493) 5'CGGGATCCT-TAC TTATTAACGAACTCTTGGC3'
pUC19primer(B0012),pUC19primer r everse (B0014),T7promotor primer(B0045)均购自上海Sangon生物工程公司。
2 方 法
2.1 PCR扩增
从E.C oli DH5α中抽提染色体DNA作为模板。
抽提方法如下:用接种环从新培养的E.coli DH5α平板上挑取单菌落(2mm)悬于0.5ml灭菌双蒸水中,沸水浴5～10min,10000r min离心5min,上清转管即可。
PCR扩增体系:模板E.c oli DH5α染色体, DNA2μl,上下游引物各5μl,dNTP MIX2μl,10×Buff-er5μl,灭菌双蒸水32μl,Taq plus酶1μl。PCR扩增程序:94℃变性3min后,94℃30sec,55℃30sec,72℃90sec,共30个循环最后72℃延伸10min。
2.2 PCR产物的纯化与回收
采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化与回收,电泳检测回收产物的浓度;将回收产物存放于1.5ml离心管,贮存于-20℃备用。
2.3 PCR产物与表达载体pET28a的连接
如图1。
2.3.1 取纯化的上、下游引物分别用NdeⅠ和Ba mHⅠ酶切4h,反应体系如下:
纯化的引物8μl、限制性内切酶1μl、酶切缓冲液1μl,37℃酶切4h,电泳检测酶切产物,并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化与回收。
2.3.2 取表达载体pET28a质粒16μl用限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ各2μl,酶切缓冲液各2μl, 37℃酶切6h,电泳检测酶切产物,并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化与回收。
2.2.3 取纯化的pET28a酶切产物10μl,纯化的上、下游引物酶切产物各3μl,T4DNA连接酶2μl,连接缓冲液2μl,16℃水浴连接过夜。
2.3.4 参照Sa mbrook[12,13]等的方法将质粒转入
E.c oli.BL21菌株中,并通过PCR、单酶切、双酶切3种方法确定阳性克隆。
(1)PCR筛选
PCR扩增体系:引物B00452μl,W42493 2μl,模板DNA1μl,dNTP MIX2μl,10×Buffer5μl,灭菌双蒸水37μl,Taq plus酶1μl,按2.1的条件进行PCR 扩增,并进行电泳检测。
(2)双酶切筛选
将PCR阳性反应的质粒用核酸内切酶NdeⅠ和Bam HⅠ于37℃水浴消化6h。
酶切体系(20μl):质粒12μl,10×Buffer K 2μl,10×BSA 2μl,双蒸水2μl,Nde I1μl,Bam H I 1μl。
(3)单酶切验证
由于Kpn I的酶切位点仅存在于插入片段中,用该酶消化重组子可验证该片段是否已插入载体。
酶切体系:质粒6μl,10×Buffer1μl,Kpn I1μl,双蒸水2μl。
2.3.5 将插入序列测序(委托大连Takara公司测序)
2.4 MDH的诱导表达和检测
以100mmol L的IPTG诱导含阳性重组质粒的E.coli.BL21,诱导3h和5h后于12000r min离心15sec,收集菌体,加100μl1×SDS-PAGE加样缓冲液,于沸水浴中加热5min,使蛋白变性,于12000r min离心5min,上清通过SDS-PAGE检测(12%分离胶,5%浓缩胶,电压15V cm),以含空载体质粒pE T28a的E.coli.B L21为对照。
2.5 重组子拆分DL-苹果酸能力的测定
2.5.1 苹果酸总含量测定方法—β-萘酚法 苹果酸与β-萘酚的络合物在370nm处有最大吸收,利用此标准,可以对苹果酸的含量进行分析。
标准曲线的制备:DL-苹果酸溶液1ml,其中苹果酸含量分别为10～100μg,β-萘酚试剂0.1ml,浓硫酸6.0ml,混均后于沸水中加热20min,取出后置于室温下冷却,于370nm处测紫外吸收。(β-萘酚试剂:取0.1gβ-萘酚溶于10ml浓硫酸)。
2.5.2 D-苹果酸含量的测定方法—Krebs法 由于纯的D-苹果酸旋光度很小,采用Krebs法后能使其它旋光度增加20倍以上,因此可以用该方法测定D-苹果酸含量。
78药物生物技术第10卷第2期
Fig1:The procedure of cloning MDH gene into vector pET-28a
标准曲线制备:使用D-苹果酸作标准曲线。由于Kr ebs法要求溶液浓度范围在0.06%～1%有最佳线形关系,所以D-苹果酸浓度分别为0～10mg ml,取:D-苹果酸溶液7.5ml,29%四水合钼酸铵13.5ml,0.4mol L柠檬酸三钠7.5ml,冰醋酸
1.5ml,混合后室温下静置15min即可测定。
2.5.3 重组子拆分DL-苹果酸能力的测定 取含重组质粒E.c oli.BL21培养至A600=0.4时加入IPTG使终浓度为100mmol L,于30℃300r min剧烈振摇培养,诱导表达;5h后,4000r min离心5min,收集菌体,将菌体混悬于不同浓度的DL-苹果酸溶液中(0.4,0.6,0.8,1.0mol L),于30℃220r min振摇培养,分别于24,48,72h后测定A600(稀释1倍测菌体浓度),A370(稀释1000倍测总苹果酸浓度),旋光
79
杨柳青等:苹果酸脱氢酶的克隆、表达与生物活性的研究
度(稀释5倍测D -苹果酸浓度)。由于发酵过程中发酵液pH 值不断升高,应调节pH 值在6.5～7.0,以保持最大酶活力。2.6 D -苹果酸的分离和纯化
取120ml 菌液于5000r min 离心10min ,取上清;将上清用薄膜浓缩至25ml ,用等体积6%的高氯酸沉淀蛋白,离心去除蛋白;向上清中加入2mol L 的KHCO 3,调节pH 至7～8;用离子交换法除盐:将溶液通过50ml 经预处理的732(H +型)强酸型阳离子交换柱,再用1倍柱体积的蒸馏水洗柱,合并两次的流出液;混合液通过50ml 717(甲酸盐型)强碱型阴离子交换柱,然后用2倍柱体积的蒸馏水洗柱,再用2倍柱体积20%的甲酸过柱,将苹果酸洗脱下来,最后用1倍柱体积的蒸馏水洗柱,合并洗脱液和最后一次的洗柱液;将混合液通过薄膜浓缩至浆状,冷却结晶;结晶用冰乙醚洗涤后干燥,称重,计算收率。
取0.6g 干燥结晶溶于20ml 蒸馏水中,配制成浓度为30g L 的溶液,测定吸光度和旋光度,确定其纯度。
2.7 重组菌的遗传稳定性研究
从重组菌平板上挑取8个单菌落,于37℃固体培养基上培养16h 传代,反复传代15次。取第5、10、15代的菌落按照2.3.4(1)中的方法进行PCR ,检测插入的序列;同时,按照2.4中的方法发酵拆分0.8mol L 的D L -苹果酸,以检测苹果酸脱氢酶的活力。3 结 果
3.1 标准曲线3.1.1 DL -苹果酸浓度—
吸光度标准曲线
Fig 2 DL -malic acid Concentration —absorbency Standard curve
回归方程:y =1.6683x +0.0113,R 2
=0.9984,由
此可见,用β-萘酚法测定苹果酸总含量是准确可行
的,DL -苹果酸浓度与吸光度线性关系良好。
3.1.2 D -苹果酸浓度—旋光度标准曲线
Fig 3 D L -malic acid Concentration —Rotation Standard curve
Lane
A -DNA Marker (bp )Lane
B -Recombinant ,undigested Lane
C -pET28a ,undigested
Lane D -Recombinant ,diges ted by BamH ⅠLane E -pET28a ,digested by Ba mH ⅠLane F -R ec ombinant diges ted by Nde Ⅰ BamH ⅠLane G -Recombinant diges ted by Kpn ⅠLane H -PCR products of Recombinant using primers B0012 W42493Lane Ⅰ-PCR product of E .coli .DH5αusing primers W42492 W42493
Fig 4:Electrophoresis of fragments of the Recombinant digested by Nde I BamH I
Lane
A -Ecoli .BL21containing Recombinant ,after 5hours induction Lane
B -Ecoli .BL21pET -28a ,after 5hours induction Lane
C -Ecoli .BL21containing Recombinant ,after 3hours inducti on Lane
D -Ecoli .BL21containing pET -28a ,after 3hour 3hours induction Lane
E -Marker (u )Lane
F -Ecoli .BL21containing R ec ombinant ,without induction Lane
G -Ecoli .BL21containing pET -28a ,without induction Lane
H -Ecoli .BL21containing pET -28a ,without induction
Fig 5 SDS -PAGE of the expression products of MDH
80
药物生物技术第10卷第2期
回归方程:y=0.0875x+0.0272,R2=0.9993。由此可见,用旋光法测定D-苹果酸含量是准确可行的,D-苹果酸浓度与旋光度线性关系良好。
3.2 MDH基因的克隆结果
MDH基因的酶切结果见图2,由图2可见, Lane F中的短片段的位置与文献MDH的基因936bp大小相符,说明目的基因大小正确,被正确地连接上载体,并且能正确地酶切下来。
3.3 MDH基因的序列测定
测定结果与文献提供的MDH序列完全一致。
3.4 MDH的表达结果
MDH的表达结果见图,由图可见,Lane A和Lane C中表达蛋白的位置与文献MDH的分子质量34300u相符,由此可见目的蛋白MDH已正确表达。
3.5 重组子拆分DL-苹果酸的能力初步测定
重组子拆分DL-苹果酸的结果见表1。
Tab1 The ability of recombinant strain resoluting DL-malic acid
Concentration of
D L-malic acid(mol L)
24hr
0.400.600.80
48hr
1.000.600.80
72hr
1.000.801.00
A6000.8020.8140.7250.3470.7580.6330.2950.4120.251 A
370
0.3780.5530.9321.3370.5200.7181.3510.6601.281 Concentration of
malic acid(mol L)
0.220.3250.5520.8190.3050.4240.8030.3890.761 Rotation(-)3.5975.0154.7873.0025.2256.3973.7887.1504.490 Concentration of resoluted
D-malic acid(mol L)
0.2030.2870.2730.1700.2960.3630.2150.4070.255 Concentration of total
D-malic acid(mol L)
0.20.30.40.50.30.40.50.40.5 Res olution ratio(%)10295683499914310251
重组子对0.4mol L的DL-苹果酸,24h内可拆分完全;对0.6mol L的DL-苹果酸,48h内可拆分完全;对0.8mol L的D L-苹果酸,72h内可拆分完全;对1.0mol L的DL-苹果酸,由于菌浓不断下降,难以拆分完全。所以,对0.8m ol L的DL-苹果酸进行拆分更为可行,理论产量可达到53.6g(游离酸)L。
Tab2 The abilities of the wild strains resoluting D L-malic acid
Concentration
of DL-malic acid(mol L)
24hr48hr72hr
0.100.200.300.400.500.300.400.500.400.50
A
600
0.8050.7950.8270.8020.6860.7400.4300.2050.3800.155
A3700.0960.1690.3110.5000.7950.2780.3930.7500.3420.702 Concentration of malic
acid(mol L)
0.0510.0950.1800.2930.4700.1600.2290.4430.1980.413
Rotation(-)0.8841.8112.2322.0550.7282.7042.9681.0753.5971.865 Concentration of resoluted
D-malic acid(mol L)
0.0490.1020.1260.1160.0400.1530.1680.0600.2040.105 Concentration of total
D-malic acid(mol L)
0.050.100.150.200.250.150.200.250.200.25 Resolution ratio(%)98102845816102842410242
3.6 D-苹果酸的初步分离结果
125ml培养液中D-苹果酸的理论产量为:0.4 mol L×134.09(MW)×0.125L=6.70g,由于分离纯化过程中的损耗,D-苹果酸粗品的实际产量为5.53g;
对纯化产物的测定显示(表3),结晶中D-苹果酸含量为88%,光学纯度为97.5%。
81
杨柳青等:苹果酸脱氢酶的克隆、表达与生物活性的研究
Tab3 Concentration and purity of D-malic acid in purified product Concentration of
purified product Sample(g L)A370
Concentration of
total malic acid
(mol L)
Rotation
(-)
Concentration of
D-malic acid
(mol L)
Concentration of
D-malic acid
(g L)
Optical purity of
D-malic acid
(%)
Content of
D-malicacid
(%)
30.00.3480.2023.4750.19726.497.588
D-苹果酸的实际发酵得率为5.53×88%
125
×100%=3.9%。3.7 重组菌遗传稳定性初步测定结果
重组菌遗传稳定性初步测定结果见表4。
Tab4 The abilities of the5th,10th,15th generations of recombinant strains resoluting0.8mol L DL-malic acid in72hours. Strain No.12345678
A
600
0.4160.3850.3970.4060.4230.3590.3540.396
The A3700.6870.6970.6740.6920.6790.6580.6880.692 5th Concentration of malic acid(mol L)0.4050.4110.3970.4080.4000.3880.4060.408 generation Rotation(-)6.7687.0736.8796.9466.7927.2426.6357.018 Concentration of resoluted
D-malic acid(mol L)
0.3850.4030.3920.3950.3870.4120.3770.400
Resolution ratio(%)96.11019898.896.810394.3100 Strain No.12345678
A
600
0.4020.3980.3570.3960.3640.4080.3490.413
The A3700.6550.7070.6870.6650.6800.6580.6720.698
10th
Concentration of
malic acid(mol L)
0.3860.4170.4050.3920.4010.3880.3960.412
generation Rotation(-)7.0416.4597.0136.7576.8856.9536.8606.665 Concentration of resoluted
D-malic acid(mol L)
0.4010.3680.3990.3840.3920.3960.3900.379
Resolution ratio(%)1009299.896989997.594.8 Strain No.12345678
A
600
0.3880.4010.3890.3780.4110.3860.3790.398
The A3700.6750.6800.6700.6980.6600.6520.6790.643
15th
Concentration of
malic acid(mol L)
0.3980.4010.3950.4120.3890.3840.4000.379
generation Rotation(-)6.9556.8456.4686.6876.9267.0686.9696.716 Concentration of resoluted
D-malic acid(mol L)
0.3960.3890.3680.3810.3940.4020.3970.382
Resolution ratio(%)9997.39295.398.510199.395.5
重组菌经多次传代后PCR检测结果均为阳性,且72h拆分0.8mol L DL-苹果酸的能力几乎没有改变,说明该重组菌是稳定的。
4 讨 论
由于纯的D-苹果酸旋光度很小,采用Krebs法后能使其旋光度增加20倍以上。通过测定不同比例D-∶DL-∶L-苹果酸混合溶液,研究使用比旋光度法测定D-苹果酸的旋光度是否受溶液中共存的D L-苹果酸或L-苹果酸的影响。实验表明,由于DL-苹果酸是消旋的,测定结果不受溶液中共存的DL-苹果酸的影响;L-苹果酸的旋光度与D-苹果酸大小相等,方向相反,能抵消D-苹果酸的旋光度,所以测定结果反映的是溶液中D-苹果酸比L-苹果酸多出部分的浓度,因此,使用比旋光度法测定D-苹果酸的浓度是行之有效的。
由于重组菌高表达苹果酸脱氢酶,在目前培养条件下其消耗L-苹果酸的能力是野生菌的2倍。如果对培养条件进行进一步优化,有望提高拆分能力。表2为野生菌拆分不同浓度D L-苹果酸的能
82药物生物技术第10卷第2期
力,理论产量为28.6g (游离酸) L 。实验表明,重组
菌的遗传稳定性很高,经过15次传代,其选择性消耗L -苹果酸的能力几乎没有改变。
由于目的基因来源于Ec oli DH5α,在用PCR 检测重组子是否为阳性时,若使用设计的上游引物W42492,则会出现假阳性,这是因为在抽提重组子质粒时,很可能带有少量宿主菌的染色体DNA ,以此为模板,使PCR 结果呈阳性。若使用T7promoter primer 为上游引物,可以避免出现假阳性;为避免质粒的小量抽提产物和酶切产物中的杂质对一些核酸内切酶(尤其是Nde I )和T4-DNA 连接酶活力的影响,必须用试剂盒对其进行纯化回收,以提高酶切和连接的效率;另外,尚需进一步研究发酵条件和产物的分离纯化工艺,以提高重组菌的拆分能力和产品的纯度;还可以尝试用固定化细胞或固定化酶的手段对DL -苹果酸进行拆分,提高产率,实现生产的连续化,探索其工业化条件。
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Cloning and Expression of Malate Dehydrogenase Gene in E .coli
YANG Liu -qing 1
,LI Ping 2
,HE Nan 3
,YUAN Wei -chun 2
,ZHANG Yu -bin 1
(1.School of Biophar maceutics ,China Pharmaceutical University ,Nanjing ,210009;2.National Laborato ry of Molecular &Biomolecular Electronics ,Southeast University ,Nanjing 210096;3.China Pharmaceutical University Pharmaceutical C ompany ,Nanjing ,210009)
A bstract In order to produce D -malic acid more efficiently ,inexpensive and envir onmental friendly ,we attempted to use genetic engineering strain which enantiospecifically assimilated L -malic acid to resolute D L -malic acid .The gene
encoding Malate dehydr ogenase (MDH )was cloned from E .coli .DH5αby PCR method and inserted into the expres -sion vector pE T -28a to get recombinant plasmid .We transformed the recombinant into host E .c oli .BL21,then in -duced this bacteria to express MDH protein and to resolute D L -malic acid ,the data of the experiments indicated that this strain can c onsume L -malic acid completely after 72hours 'incubation in medium containing 0.8mol L DL -malic acid and the yield of D -malic acid was 53.6g L .Key words D -malic acid ,Malate dehydrogenase (MDH ),Cloning ,E xpression
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杨柳青等:苹果酸脱氢酶的克隆、表达与生物活性的研究