实验二 紫外分光光度计(3.14)
实验一、紫外-可见分光光度法的应用
一．目的要求
1. 掌握紫外-可见分光光度计的原理及其可分析物质的结构特征，学会紫外-可见分光光度计的的使用方法；
2.掌握紫外-可见分光光度计性能的检验方法
3. 学会制作吸收曲线和标准曲线，能正确选择合适的测定波长，并对未知浓度的溶液进行测定；
4. 掌握双波长测定物质的方法；
5. 了解运用紫外-可见分光光度法分析未知化学物质的思路；
6. 学会用解联立方程组的方法同时分别测出吸收曲线相互重叠的二元混合物含量。
二．实验原理
紫外-可见分光光度计的性能的好坏，直接影响到测定结果的准确程度。因此，要对仪器进行性能检查，以保证测定结果的准确性。
根据比尔定律，某有色溶液的光密度D 与其浓度C 成正比，即D=KC 。
当溶液浓度以百分浓度为单位，且液层厚度为1 cm 时， K 称为该物质的比吸收系数。
叶绿素的双波长定量测定：是根据叶绿素对某一特定波长的可见光的吸收，用公式计算出叶绿素含量。此法精确度高，还能在未经分离的情况下分别测出叶绿素a 和叶绿素b 的含量。
欲测定叶绿体色素混合提取植中叶绿素a 和叶绿素b 的含量，只需测定该提取物在某一定波长下的光密度D ，并根据叶绿素a 、叶绿素b 在该波长下的吸收系数即可求出叶绿素的浓度。为了排除类胡萝卜素的干扰，所用的单色光应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a 和叶绿素b 在红光区的最大吸收峰分别位于663nm 和645nm，又知在波长652nm 下，叶绿素a 和叶绿素b 的80% 丙酮溶液的比吸收数分别为82.04 和9.27，而在波长645nm 下，分别为16.75 和45.6。据此可列出光密度D 与浓度（单位mg/l）的下列关系式：
D 663 =82.04C
a
+ 9.27C
b
( 1)
D 645 = 16.75C a + 45.6C b (2)
解方程式（1)、(2) 得：
C a = 12.7
D 663 - 2.69D 645 (3) C b =22.9D 645-4.68D 663 I (4)
将C a 和C b 相加，即得叶绿素总量C T ， 即：
I C T = C a + C b =20.2 D 645+8.02D 663 (5)
另外，由于叶绿素a 、叶绿素b 在 652nm 处有相同的比吸收系数(均为34 .5)，也可在此波长下测定一次光密度(D 652) 而求出叶绿素a 和叶绿素b 的总量，即
CT= D 652×1000/34.5
测定混合物的实验原理：
根据朗伯-比尔定律，用紫外分光光度法可方便的测定在该光谱区域内有简单吸收峰的某一物质含量。若有两种不同成分的混合物共存，但一种物质的存在并不影响另一共存物的光吸收性质，则可以利用朗伯-比尔定律及吸光度的加合性，通过解联立方程组的方法对共存混合物分别测定。
由图1 可以看出，混合组分在h1的吸收等于A 组分和B 组分分别在h1的吸光度之和， 即
B
B h A
A h
B A h B
B h A A h B A h bc
bc A
bc
bc A 2
2
2
111κκκκ+=+=++
若首先用A ，B 组分的标样，分别测定A ，B 两组分在h 1，h 2处的摩尔吸收系数
A h 1κ，
B h 1κ和A h 2κ，B h 2κ， 当再测定未知试样在h 1，h 2处的吸光度A h1，A h2后，解下
列
二元一次方程组：
B
B h A
A
h h B
B h A A h h bc bc A bc bc A 2
2
21
11κκκκ+=+=
即可求出A ，B 两组分各自的浓度值c
A
，c B
。
一般来说，为了提高测定的灵敏度，h 1，h 2应分别选在A ，B 两组分最大吸收峰处或其附近。
三．仪器与试剂
紫外可见分光光度计、比色杯（1cm ）一套、移液器（1~5ml ）、容量瓶（50ml ，1只； 25ml ，6只）、烧杯、洗瓶、10ml 试管等；
锰储备液： 精确称取 A.R 高锰酸钾 0.5754g ，溶于少量 1NH 2SO 4 溶液中，待全部溶解后，移 入 1000ml 容量瓶中，用 1NH 2SO 4 稀释至刻度，摇匀。Mn 浓度 0.2mg·ml －1 。用时稀释10倍 ；
铬储备液： 精确称取 105℃干燥至恒重的重铬酸钾基准试剂 2.829g ，溶于 1N H 2SO 4 溶液中， 待全部溶解后，移入 1000ml 容量瓶中，用 1N H 2SO 4 稀释至刻度，摇匀。Cr 浓 度 1mg·ml －1。用时稀释100倍。
100 mg·ml －1 的K 2Cr 2O 7溶液，50 mg·ml －1 KMnO 4溶液，80%丙酮。 四. 实验步骤
（一）仪器的性能检验
1.波长精度的检查：用KMnO 4 溶液的最大吸收波长525nm 为标准，在待测仪器上测绘KMnO 4 溶液的吸收曲线，如测得的最大吸收波长在525±1nm 以内，则仪器的波长精度符合使用要求；
2. 重复性 以1N 的H 2SO 4溶液的透光率为100%，波长440nm ，用同一K 2Cr 2O 7溶液连续测定5-7次透光度，求出极差，△T=T max -T min < 0.5%，则重复性符合要求；
3.吸收值的准确度考察 取K 2Cr 2O 7溶液，在以下波长处测定并计算其吸收系数，并与规定的吸收系数比较，如下表所示，其相对偏差在±1%以内，则吸收值的准确度符合要求。
（二）测定叶绿素
1、称取0.5g菠菜叶片，剪碎置于研钵中，加2ml 80%丙酮研磨成匀浆，定容至
50ml,摇匀并放在避光处，取上清液测定。
2、在可见光区域进行样品的吸收光谱扫描，分析光谱图，确定叶绿素的最大吸
收峰；
2.以80%丙酮溶液作为空白对照，在645、663、652 nm下读取叶绿素的光密度D663、D652，D645，根据公式计算叶绿素含量。
（三）测定混合物
1. 绘制K2Cr2O7和KMnO4 吸收曲线吸取锰储备液 1.00ml 于10ml 比色皿中，加入9.00ml 1N H2SO4摇匀。吸取铬储备液1.00ml 于10ml 比色皿中，加入9.00ml1N H2SO4摇匀。分别将上述溶液置于1cm 吸收池，以1N H2SO4溶液做参比。（同时进行基线扫描）
在420～600nm 范围内每隔5nm，测一吸光度，待测得的吸光度与相应波长作图得K2Cr2O7和KMnO4吸收曲线，找出最大吸收峰，求出吸光系数。
2. 分别在K2Cr2O7和KMnO4最大吸收波长下测定混合物的吸光度，并根据混合物的计算方法，分别求出铬、锰的浓度。
五、实验结果处理
1、波长精度的检验
2、重复性的检验
3、吸收值的准确度结果与分析
4、叶绿素含量结果计算
5、K
2Cr
2
O
7
与KMnO
4
溶液混合物中K
2
Cr
2
O
7、
KMnO
4
含量结果计算
实验记录：
绘出K
2Cr
2
O
7
与KMnO
4
的A-λ曲线
六、存在的问题和注意事项
1、待测溶液一定要在工作曲线线形范围内，如果浓度超出直线的线形范围，则有可能偏离
朗伯-比耳定律是光吸收的基本定律，就不能使用吸光光度法测定。
2、比色皿的使用中，每改变一次试液浓度，比色皿都要洗干净
七、思考题
1、检查紫外-可见分光光度计的性能对测定有什么实际意义？紫外分光光度法
哪些影响因素？
2、在吸光度的测量中，为了减小误差，应控制吸光度在什么范围内？
一、光度准确度与重复性
定义：多次测量平均值与真值之差为光度准确度（ΔT 、ΔA ）；最大值与最小值之差为光度重复性。偏差越小，准确度越高。光度准确度和光度重复性是非常重要的技术指标，直接关系到测试结果的准确性。
光度准确度在不同的吸光度范围是不同的，因此光度准确度的表示一定要指出在多少吸光度或在多少透射比情况下测试的。影响光度准确度的主要因素有：
①仪器的杂散光大小。④仪器的光谱带宽②仪器的光度噪声⑤试样的制备③仪器的基线平直度⑥比色皿的性能
光度准确度的检查:一般用标准滤色片或的重铬酸钾的0.005mol/L H 2SO 4溶液。酸性重铬酸钾溶液的标准吸收值如下：
吸光度
测量波长(nm) 溶液A (50mg/L K 2Cr 2O 7) 溶液B (100mg/L K 2Cr 2O 7)235（谷）0.626 ±0.09 1.251 ±0.019257（峰）0.727 ±0.007 1.454 ±0.015313（谷）0.244 ±0.004 0.488 ±0.007350（峰）
0.536 ±
0.005 1.071 ±
0.011
UV-2600型紫外分光光度计操作指导书
UV-2600型紫外分光光度计操作指导书 1概况 仪器概况： UV-2600型紫外分光光度计是由日本岛津（Shimadzu）生产制造，与功能强大的操作软件UVProbe结合，操作简单方便，且符合SH/T0181方法的测量精度要求。 主要技术参数 波长范围185nm～900nm （使用积分球附件ISR- 2600Plus时220nm～1400nm） 分辨率 波长准确性± 谱带范围、、、1、2、5nm测光方式双光束方式 杂散光%以下检测器光电倍增管R-928 测光范围-5～5Abs比色池1cm 光源50W卤素灯、氘灯单色器切尼尔-特纳单色器 主电压AC100V～240V主频率50/60Hz 使用条件 操作温度：15～35℃ 操作湿度：30%～805% 2仪器结构 仪器由UV-2600型紫外分光光度计和计算机组成。 3操作步骤 开机 在使用前先确认仪器和计算机的工作电源，检查仪器样品室应无遮挡光路的物品。确认后先开启计算机，然后开启仪器电源。待分光光度计外侧的指示灯显示绿色时，启动电脑桌面上的UVPROBE程序。 首先从下拉式菜单的仪器项上追加需要的仪器，操作完毕如下图①所示，然后点击上图
的连接键②，这样仪器与计算机连接（当然，中间的通讯电缆的连接、通讯口的指定等都是必须的，此处不再赘述）并开始下示的初始化面。 初始化大约需要5分钟左右，进行一系列的检查和初置，如一切顺利通过就可以开始测定。 测定 首先选择测定的方式，在主菜单上能发现右图所示的各键，自左至右 分别为： ①报告生成器：用于制作各种格式的报告。 ① ② ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ ⑾ ⑿ ⒀ ⒁
药物分析设计性实验
logo 药物分析设计性实验 研究报告 学院：xx学院 班级： 组号： 成员： 指导教师: 时间：
鉴别试验实验设计 实验目的： 1.掌握药物结构与分析方法间的关系 2.掌握分析方法基本操作与含量计算 3.熟悉专业文献的查阅,信息检索 4.了解药品分析的全过程 5.了解如何根据文献资料进行实验设计 实验原理： 葡萄糖: (1) 单糖分子中都含有羰基或醛基——还原性。 (2).单糖在水溶液中主要呈半缩醛的环状结构。 阿莫西林: (1)具有酚羟基可以与三氯化铁反应 (2) 具有手性碳,比旋度为+290°至+310° SMZ: (1) 具有磺酰氨基,可以金属离子络合 (2)本品具有芳伯胺基团,显芳香第一胺类的鉴别反应 对乙酰氨基酚: (1)具有酚羟基可以与三氯化铁反应 (2)具有隐性芳伯氨基,水解显芳香第一胺类的 实验药品：葡萄糖、阿莫西林、SMZ、对乙酰氨基酚 实验试剂和仪器： 仪器:旋光仪,IR,超声机,水浴锅,一般玻璃仪器 试剂：蒸馏水、碱性酒石酸铜试液、0.4％氢氧化钠溶液、硫酸铜试液、三氯化铁试液、稀盐酸、亚硝酸钠试液、碱性β-萘酚试液。 实验步骤:
葡萄糖： (1)取本品约0.2g，加水5ml 溶解后，缓缓滴入微温 的碱性酒石酸铜试液中，即生成氧化亚铜的红色沉淀。 (2)本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。 分别称取一定比例干燥的葡萄糖和溴化钾 (1.0:100)，置玛瑙研钵中，在红外灯下研匀，取适量置于压模中，均匀铺布后，抽真空 2 m i n ，加压至 20~30MPa并保持2min，取出制成的供试片，置于红外光谱仪的样品光路中，录制光谱图。 中国药典葡萄糖红外光谱图 ( 光谱号码 7 0 2 ) 阿莫西林： (1)取阿莫西林适量，研细，加pH=7.0磷酸盐缓冲液溶解（必要时冰浴超声助溶10分钟）制成阿莫西林的溶液，静置，滤过，取滤液作为供试品溶液加三氯化铁试液3滴，即显深橘红色。 (2)取本品精密称定，加水溶解并稀释成每1ml中1mg的溶液，依法测定(除另有规定外，本法系采用钠光谱的D线（589. 3nm)测定旋光度，测定管长度为ldm(如使用其他管长，应进行换算）,测定温度为20°C。使用读数至0. 01°并经过检定的旋光计。测定旋光度时，将测定管用供试液体或溶液（取固体供试品，按各品种项下的方法制成）冲洗数次，缓缓注入供试液体或溶液适量（注意勿使发生气泡），置于旋光计内检测读数，即得供试液的旋光度。读取旋光度3次，取3次的平均数，照下列公式计算，即得供试品的比旋度。 )，比旋度为+290度至+310度。 SMZ: (1) 取本品约0.1g，加水与0.4％氢氧化钠溶液各3ml，振摇使溶解.滤过，取滤液，加硫酸铜试液1滴，即生成草绿色沉淀. (2)取供试品约50mg,加稀盐酸lml,必要时缓缓煮沸使溶解，放冷，加0. lmol/L亚硝酸钠溶液数滴，滴加碱性β-萘酚试液数滴，视供试品不同，生成由橙黄到猩红色沉淀。 对乙酰氨基酚:
紫外可见分光光度计常见故障的排除
紫外可见分光光度计常见故障的排除 光源部分： （1）故障：钨灯不亮； 原因：钨灯灯丝烧断（此种原因几率最高）； 检查：钨灯两端有工作电压，但灯不亮；取下钨灯用万用表电阻档检测。 处置：更换新钨灯； （2）故障：钨灯不亮； 原因：没有点灯电压； 检查：保险丝被熔断； 处置：更换保险丝，（如更换后再次烧断则要检查供电电路）； （3）故障：氘灯不亮； 原因：氘灯寿命到期（此种原因几率最高）； 检查：灯丝电压、阳极电压均有，灯丝也可能未断（可看到灯丝发红）； 处置：更换氘灯； （4）故障：氘灯不亮； 原因：氘灯起辉电路故障； 检查：氘灯在起辉的过程中，一般是灯丝先要预热数秒钟，然后灯的阳极与阴极间才可起辉放电，如果灯在起辉的开始瞬间灯内闪动一下或连续闪动，并且更换新的氘灯后依然如此，有可能是起辉电路有故障，灯电流调整用的大功率晶体管损坏的几率最大。 处置：需要专业人士修理； 二．信号部分： （1）故障：没有任何检测信号输出； 原因：没有任何光束照射到样品室内；
检查：将波长设定为530nm，狭缝尽量开到最宽档位，在黑暗的环境下用一张白纸放在样品室光窗出口处，观察白纸上有无绿光斑影像； 处置：检查光源镜是否转到位？双光束仪器的切光电机是否转动了（耳朵可以听见电机转动的声音）？ （2）故障：样品室内无任何物品的情况下，全波长范围内基线噪声大； 原因：光源镜位置不正确、石英窗表面被溅射上样品； 检查：观察光源是否照射到入射狭缝的中央？石英窗上有无污染物？ 处置：重新调整光源镜的位置，用乙醇清洗石英窗； （3）故障：样品室内无任何物品的情况下，仅仅是紫外区的基线噪声大； 原因：氘灯老化、光学系统的反光镜表面劣化、滤光片出现结晶物； 检查：可见区的基线较为平坦，断电后打开仪器的单色器及上盖，肉眼可以观察到光栅、反光镜表面有一层白色雾状物覆盖在上面；如果光学系统正常，最大的可能是氘灯老化，可以通过能量检查或更换新灯方法加以判断； 处置：更换氘灯、用火棉胶粘取镜面上的污物或用研磨膏研磨滤光片（注意：此种技巧需要有一定维修经验者来实施）； （4）故障：样品室放入空白后做基线记忆，噪声较大，紫外区尤甚； 原因：比色皿表面或内壁被污染、使用了玻璃比色皿或空白样品对紫外光谱的吸收太强烈，使放大器超出了校正范围； 检查：将波长设定为250nm，先在不放任何物品的状态下调零，然后将空比色皿插入样品道一侧，此时吸光值应小于0.07Abs；如果大于此值，有可能是比色皿不干净或使用了玻璃比色皿；同样方法也可判断空白溶液的吸光值大小； 处置：清洗比色皿，更换空白溶液； （5）故障：吸光值结果出现负值（最常见）； 原因：没做空白记忆、样品的吸光值小于空白参比液； 检查：将参比液与样品液调换位置便知； 处置：做空白记忆、调换参比液或用参比液配置样品溶液； （6）故障：样品信号重现性不良；
LS55操作说明书荧光-磷光-发光分光光度计中文培训手册
ＬＳ－４５／５５荧光／磷光／发光 分光光度计 使用说明书 美国Perkin Elmer公司 ２００３ 年４月
一、理论基础 荧光、磷光、化学发光及生物发光均属于分子发光。现将其原理简介如下： 室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象被称为“发光”。 每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转动能层。图中基态用Ｓ０表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重态分别用Ｓ１、Ｓ２表示，０、１、２、３…表示基态和激发态的振动能层（见图１），第一、二电子的激发三重态分别用Ｔ１和Ｔ２表示（见图２）。 图１荧光的能级图 １、荧光的产生 当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活化过程的一种形式是以１０－９～１０－６秒左右的短时间内发射一个光子返回基态，这一过程称为荧光发射（见图１）。２、磷光的产生 从单重态回到三重态的分子系间跨越越迁发生后，接着发生快速的振动驰豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在１０－４～１０２秒左右的时间内跃迁回基态而发生磷光（见图２）。 由此可见，荧光与磷光的的根本区别是：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层的跃迁产生的，而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。
图２磷光的能级图 ３、化学发光及生物发光的产生 某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出了一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。化学发光也发生于生命体系，这种发光被称为生物发光。 二、仪器简介 １、仪器原理 图３ＬＳ４５／５５荧光／磷光／发光分光光度计的原理图
752紫外可见分光光度计使用方法解析
752紫外可见分光光度计 一、仪器的工作原理 分光光度计的基本原理是溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光的吸收效应，物质对光的吸收是具有选择性的。各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理—一比耳定律。 τ=I/Io log I/Io=KCL A= KCL 从以上公式可以看出，当入射光、吸收系数和溶液的光径长度不变时．透过的光是根据溶液的浓度而变化的，752紫外可见分光光度计的基本原理是根据上述物理光学现象而设计的。 二、仪器的安装、使用、安装 1 仪器在安装使用前应对仪器的安全性进行检查，电源电压是否正常，接地线是否牢固可靠，在得到确认后方和接通电源使用。 2 仪器经过运输和搬运等原因，会影响波长准确度，应进行仪器调校后使用。 使用：仪器使用前需开机预热30min。 本仪器键盘共有4个键，分别为； 1 A /τ/C/F 1SD 2 ▽／0％ 3?／100％ 4 A /τ/C/F键：每按此键来切换A、τ 、C、F之间的值。 A——吸光度（Absorbance） T——透射比（Trans） C——浓度（conc） F——斜率（Factor） (2)F值通过按键输入（后面介绍如何设置） 5SD键：该键具有2个功能 a)用于RS232串行口和计算机传输数据（单向传输数据，仪器发向计算机）。 b)当处于F状态时，具有确认的功能，即确认当前的F值，并自动转到C，计算当前的C 值（C=F*A）。 6 ▽／0％键：该键具有2个功能 a）调零；只有在τ状态时有效，打开样品室盖，按键后应显示0.000。 b）下降键：只有在F状态时有效，按本键F值会自动减1，如果按住本键不放，目动减1会加快速度；如果F值为0后，再按键它会自动变为1999。而按键开始自动减1。 7 ?／100％键；该键具有2个功能 a）只有在A、τ状态时有效，关闭样品室盖，按键后应显示0.000、100.0。 b）上升键：只有在F状态时有效，按本键F值会自动加1，如果按住本键不放，自动加1会加快速度，如果F值为1999后，再按键它会自动变为0，再往键开始自动加l。 例如：设置斜率为1500。 方法一 T）按A／τ／C／F键切换到F状态。 b）如果当前F值为1000，则按?／100%键，直到F值为1500。 C）再按SD键，表示当前的F值为1500，然后自动回到C状态，假如所测的A值为0．234，则此时显示C值为0351。
邻二氮菲分光光度计法测铁含量文献综述和实验设计
可见分光光度法测定铁的条件实验 可见分光光度法测定铁的条件实验文献综述和实验设计 院系：检验学院 班级：12 级生物技术班 指导老师：杨琴 小组成员：沈艳林、田赋、邓纯纯、 郑祥、谭诗航、苏曼、 邱丽莎、殷良俊、易柳
摘要 (1) 引言 (2) 正文 (3) 1 分光光度技术 (3) 2 分光光度法测定元素铁含量的研究概况 (3) 3 分光光度法测定铁的6种方法 (3) 3.1 邻二氮菲分光光度法 (3) 3.1.1 方法原理 (3) 3.1.2 化学反应式 (3) 3.2 BPT-OP分光光度法 (3) 3.3 硫氰酸盐分光光度法测铁含量 (3) 3.3.1 方法提要 (3) 3.3.2 主要反应 (3) 3.4 磺基水杨酸分光光度法测铁含量 (3) 3.4.1 方法原理 (3) 3.5 固相萃取分光光度法测铁含量 (3) 3.5.1 方法原理 (4) 3.6 用火焰原子吸收分光光度法测铁含量 (4) 3.6.1 方法原理 (4) 4 邻二氮菲分光光度法测铁含量 (4) 4.1 邻二氮菲法简介 (4) 4.2 邻二氮菲法的优点 (4) 5 邻二氮菲分光光度法测铁含量最适条件的选择 (4) 5.1 如何确定适宜的条件 (4) 5.2 最适波长的选择 (4) 5.3 显色剂用量的选择 (4) 5.4 显色时间的选择 (4) 5.5 溶液pH的选择 (4) 5.6 显色温度的选择 (5) 6 对邻二氮菲分光光度法测铁含量实验改进 (5) 参考文献 (6) 实验设计部分 (7)
本文主要研究用邻二氮菲分光光度法测定新血宝胶囊中总铁含量的分析方法。采用了邻二氮菲作显色剂、盐酸羟胺作还原剂，以工作曲线法测定总铁含量，对邻二氮菲分光光度法测定铁主要测量条件如测量波长、显色剂用量及显色时间等进行研究确定，提高分析检测的灵敏度，且讨论了测定的最佳条件，找出处理方法的良好条件和良好效果。本法灵敏、可靠，便于推广。 【关键词】邻二氮菲；分光光度法；新血宝胶囊；铁含量
紫外可见分光光度计的校正
实训二紫外可见分光光度计的校正 一、实训目的 1、了解紫外-可见分光光度的基本构造。 2、熟悉紫外可见分光光度计的操作技术。 3、熟悉校正波长和测量吸收值精度的原理和方法。 二、仪器与试剂 1、仪器：紫外-可见分光光度计，石英吸收池（1cm），容量瓶（1000m1），烧杯。 2、试剂：0.0600g→1000ml的K2Cr2O7的硫酸标准溶液（0.005mol/L），NaI溶液（10g/L），NaNO2溶液（50g/L）。 三、实训原理 紫外-可见分光光度计是单光束手工操作仪器，备有钨灯及氢灯两种光源，可用于可见及紫外光区。它是具有色散能力较高的单色器，狭缝可调，可得到较纯的单色光，适用于定性鉴别和定量分析。 新仪器启用前或仪器修理后或长期使用后均需对仪器的性能进行检定。仪器的性能主要是波长准确度与重现性、单色器的分辨能力、吸光度的准确性和重现性及杂散光等。 四、实训操作 1、吸收池配对性试验 每次测定前，应先用蒸馏水做吸收池配对性试验。两个吸收池透光率T相差应＜0.5％。 2、波长准确性与重现性 校验波长是否准确，可用谱线校正法。在吸收池中置一白纸挡住光路，转动波长至486nm附近，遮光观察白纸上蓝色斑。轻微移动波长，至使此蓝色光斑最亮时止。根据调整的波长范围观察所得到的相应颜色，并进行对比核对，判断波长的准确性。 3、吸收度的准确性与透光率重现性 在紫外-分光光度计中用作读取透光率的电位器的精度可达到0.2％，但是，由于其他原因，例如电压变化等，实际测得的透光率误差大于0.2％。一般要求透光率的精度、稳定性和重现性不超过0.5％。透光率的准确性可用已知吸光系数的物质核对，常用的是重铬酸钾。取在120℃干燥至恒重的基准K2Cr2O7约60mg，精密称定，用H2S04溶液(0.005mol／L)溶解并稀释至1000ml，摇匀。按下表规定的吸收峰与谷波长处测定。 将测得的吸光度，计算出其吸光系数，取平均值与表中规定值核对，如相对偏差在土1％以内，则透光率准确性好。K Cr O的H S0溶液（0.005mol／L)的E cm1% 透光率重现性可结合透光率准确性实验同时进行，即在固定波长、溶液浓度以及狭
分光光度计 原理
72型分光光度计原理 72型分光光度计是可见光分光光度计，波长范围为420nm～700nm，它由三大部分组成:磁饱和稳压器、光源、单色光器和测光机构、微电计。其光学系统如图5-11所示。 72型分光光度计的基本依据是朗伯—比耳定律，它是根据相对测量原理工作的，即先选定某一溶剂作为标准溶液，设定其透光率为100%，被测试样的透光率是相对于标准溶液而言的，即让单色光分别通过被测试样和标准溶液，二者能量的比值就是在一定波长下对于被测试样的透光率。如图所示，白色光源经入射狭缝、反射镜和透光镜后，变成平行光进入棱镜，色散后的单色光经镀铝的反射镜反射后，再经过透镜并聚光于出射狭缝上，狭缝宽度为0.32nm。反射镜和棱镜组装在一可旋转的转盘上并由波长调节器的凸轮所带动，转动波长调节器便可以在出光狭缝后面选择到任一波长的单色光。单色光透过样品吸收池后由一光量调节器调节为适度的光通量，最后被光电电池吸收，转换成电流后由微电计指示，从刻度标尺上直接读出透光率的值。 分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。 分光光度计的简单原理 分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。 核酸的定量 核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从
紫外可见分光光度计 文档
紫外可见分光光度计 一．基本简介 紫外可见分光光度计简介1852年，比尔(Beer)参考了布给尔(Bouguer)1729年和朗伯(Lambert)在1760年所发表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液层厚度相等时，颜色的强度与呈色溶液的浓度成比例，从而奠定了分光光度法的理论基础，这就是著名的比尔朗伯定律。1854年，杜包斯克(Duboscq)和奈斯勒(Nessler)等人将此理论应用于定量分析化学领域，并且设计了第一台比色计。到1918年，美国国家标准局制成了第一台紫外可见分光光度计。此后，紫外可见分光光度计经不断改进，又出现自动记录、自动打印、数字显示、微机控制等各种类型的仪器，使光度法的灵敏度和准确度也不断提高，其应用范围也不断扩大。 [1]从仪器理论上讲，各种紫外可见分光光度计，都是根据比耳定律设计的；而比耳定律研究的是在平行光、单色光的条件下，物质对光的吸收。但是，紫外可见分光光度计的单色器不可能得到真正的单色光。并且，单色器系统不同，它产生的单色光的纯度（光谱带宽）也不同，并且光通过物质时，也不可能是真正的平行光。因此，严格地说，实际工作中，任何紫外可见分光光度计，都不可能真正满足比耳定律。所以，紫外可见分光光度计都是针对近似平行光、近似单色光的条件设计的。所以，就看谁设计、制造仪器最能满足或接近比耳定律（或产生的比耳定律的偏离最小），谁的仪器到了使用者手里，由于非平行光或非单色光产生的分析误差最小，谁的仪器就最好（当然还有杂散光、噪声、稳定性等要求）。这就是从仪器学理论，去看紫外可见分光光度计的设计、制造误差的最根本、最本质的问题；也是使用者从仪器学理论去看紫外可见分光光度计的分析误差的最根本、最本质的问题。 二．工作原理 吸收光谱 物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。
F-27000荧光分光光度计使用操作步骤
F-2700荧光分光光度计操作规程 1、开机： （1）开启计算机 （2）开启仪器主机电源按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP 和RUN指示灯依次亮起来，都显示绿色为正常。 （3）双击桌面图标（FL Solutions 4.1 for F-7000），主机自行初始化，扫描界面自动进入 （4）初始化结束后，须预热15-20分钟，出现操作主界面（界面右下角出现Ready） 2、点击扫描界面右侧“Method” 在“General”选项中的“Measurement”选择“wavelength scan”测量模式 在“Instrument”选项中设置仪器参数和扫描参数 选择扫描模式“Scan Mode”：Emission/Excitation（发射光谱/激发光谱） 选择数据模式“Data Mode”：Fluorescence (荧光测量) 设定波长扫描范围 扫描荧光激发光谱(Excitation)：需设定激发光的起始/终止波长（EX Start/End WL）和荧光发射波长（EM WL） 扫描荧光发射光谱(Emission)：需设定发射光的起始/终止波长（EM Start/End WL）和荧光激发波长（EX WL） 其他选项可选择默认值（也可根据具体实验要求自行设定） 参数设置好后，点击“确定” 3、设置文件存储路径（此步也可不进行参数设置，可以在按5中方法进行保存） （1）点击扫描界面右侧“Sample” （2）样品名可自行命名 （3）选中“Auto File”，可以自动保存原始文件和TXT格式文本文档数据（4）参数设置好后，点击“OK” 4、扫描测试 （1）打开盖子，放入待测样品后，盖上盖子（请勿用力） （2）点击扫描界面右侧“Measure”，窗口在线出现扫描谱图 5、数据处理与保存 （1）选中自动弹出的数据窗口 （2）右键--“Trace”，进行读数并寻峰等操作 （3）“File”--“Save as”对数据进行保存 6、关机顺序： （1）关闭运行软件FL Solution 2.1 for F-7000 （2）选中“Close the lamp，then close the monitor windows？”点击“Yes”窗口自动关闭同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP指示灯暗下来，而RUN指示灯仍显示绿色 （4）约十分钟后，关闭仪器主机电源，即按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）（目的是仅让风扇工作，使Xe灯室散热） （5）从样品池中取出所有比色皿，清洗干净以便下一次使用 （6）关闭计算机
设计实验
燕麦中Cd（隔）元素的测定 一、前言 地球上的各种生命体都是由多种化学元素组成的。就生命的化学及分子生物学的本质而言，人的生长发育、繁殖、遗传、生化反应、能量转换、新陈代谢等重要生理功能的物质基础，都是人体与外环境进行多种元素交换，以及不同元素在机体内进行复杂的合成和分解代谢的生物学过程。 一次大量吸入镉可引起急性肺炎和肺水肿；慢性中毒可致肺纤维化和肾脏病变。痛痛病也是一种慢性锖中毒。由长期摄食被硫酸镉污染的水源中生物或饮食污染的水造成。镉冶炼、喷镀，焊接、切割和浇铸轴承表面、核反应堆的镉棒或覆盖镉的石墨棒作为中子吸收剂，镉蓄电池和其池镉化合物制造的作业工人接触镉。有急性、慢性中毒之分。吸入含镉气体可致呼吸道症状，经口摄入镉可致肝、肾症状。 镉不是人体的必需元素。人体内的镉主要通过食物、水和空气而进入体内蓄积下来。肝脏和肾脏是体内贮存镉的俩大器官，进入体内的镉主要通过肾脏经排出，镉的排出速度很慢，因此会在体内慢性累积而危害到肝脏和肾脏。镉已经成为食品安全监控的重要卫生指标之一。 由于金属、类金属元素在粮油食品中与有机物结合成稳定而牢固的难溶、难解离的化合物，从而失去原有的特性，一般不能直接测定。如需测定这些无机成分的含量，需要在测定前破坏有机结合体，释放出待测组分[1]。本实验运用低温灰化法进行燕麦样品前处理、石墨炉原子吸收法测定燕麦中镉元素的含量。 二、实验原理和方法 a)低温灰化法[2] 低温灰化是相对于高温灰化法而言的，是在相对低的温度下进行灰化。低温灰化的速度与等离子体的流速、时间、功率和样品的体积等因素有关。等离子体消化装置是有消化室、供应系统、真空系统和高频电源组成。此法是将样品放在低温灰化炉中，先将炉内抽至近真空（10Pa左右），然后再不断通入氧气，氧气的流速为0.3～0.8L/min，再用微波或高频激发光源照射，使氧气活化而产生活化氧，这样在低于150℃的温度下便可使样品缓慢地完全灰化（以mg/h计），从而克服哦了高温灰化的缺点，氧化分解是在特殊设计的反应室进行的，内部压力为67～133Pa，试样量一般控制在0.2～10mg范围。 低温灰化必须在专用的低温灰化器中进行（图1.1.1）。O2在低温灰化器中，受高频或超频电场激发产生氧等离子体。氧等离子体由O+、O2+、O-、O2-、O组成，其中O+和O-具有很强的氧化能力，使样品在100～150℃，有时也在60～70℃下缓慢氧化，出去有机物，金属元素留在灰分中。但是，低压的氧气使灰化速度较慢，这也与灰化室活性气体的组成、氧等离子体流速、电场功率、样品表面积和厚度、容器底面积和深度、搅拌因素有关。当O2中含O3或CF2时灰化较快。样品厚2～3mm易灰化完全，样品太轻会因带电使灰分飞扬损失，增加高频功率
高等仪器分析实验-荧光分光光度计的使用
高等仪器分析实验(荧光分光光度计的使用) 实验目的 1．掌握荧光分光光度计的基本使用方法：扫描激发光谱，发射光谱，荧光强度，同步荧光光谱 2．掌握荧光定量分析方法 实验原理 荧光分光光度计是常用的光学仪器，在定量分析，样品的光谱性质表征时经常用到。 荧光分光光度计的基本功能是完成激发光谱，发射光谱的扫描，进行相对荧光强度的测量。从激发光谱可以获得样品激发态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳激发波长。从发射光谱可以知道样品基态能级的分布情况，用来选择定量分析的最佳发射波长。荧光定量分析法的方法与紫外可见吸收光谱法类似，但需要注意荧光强度值是相对值，同一样品，同一仪器在不同仪器参数时获得的荧光强度是不同的。只有当测量时仪器参数完全相同时，不同样品荧光强度的相互比较才有意义。 与紫外可见吸收光谱类似，分子荧光光谱也是分子光谱，其谱峰较宽，特征性不是很强，谱峰重叠现象比较普遍。为了减小谱峰宽度，避免谱峰重叠，提高分析的选择性，在定量分析时常采用同步荧光的方法进行。同步荧光是同时扫描荧光分光光度计的激发和发射单色仪得到的谱图，通过选择合适的扫描参数，可以使样品谱峰变窄，并避免不同组份的谱峰重叠，得到比较好的分析效果。 同步荧光扫描有固定波长同步荧光法，固定能量同步荧光法，可变角同步荧光法，导数同步荧光法等，其中以固定波长同步荧光法最为常用。 扫描已知样品荧光激发和发射光谱时，可先根据参考波长来进行。扫描未知样品的荧光光谱，可以将发射波长先每隔一定波长（例如50nm）扫描一个激发光谱。对比不同位置的激发光谱，从最强的激发光谱中选择最大激发波长，设定该波长为激发波长，扫描发射光谱。再从新得到的发射光谱中找到最大发射波长，在最大发射波长处重新扫描激发光谱。 扫描样品激发光谱和发射光谱时，需要注意：扫描激发光谱时，激发单色器扫描范围的长波端一般应小于发射波长；扫描发射光谱时，发射单色器扫描范围的短波端应大于激发波长。否则在发射光谱（激发光谱）中与激发波长（发射波长）波长相同的位置会出现很强的散射谱峰，这不是样品的荧光引起的，应注意区分。 如果样品不是真正的溶液，或包含有不溶颗粒物，或是固体样品，如果扫描范围较宽时，通常在发射光谱（激发光谱）中激发波长（发射波长）整数倍波长的位置也会出现弱的散射谱峰，称为倍频峰，在分析光谱情况时也应注意区分。对散射倍频峰或样品荧光峰，可通过适当改变激发波长来进行区分，散射倍频峰的位置会随着激发峰位置的变化而变化，而荧光峰位置通常是不变的。如果倍频峰对样品的测量有干扰，可使用合适的滤光片消除倍频峰。合适的消倍频峰滤光片应可以使发射光透过，而阻挡激发光不能透过。 如果样品荧光较弱，使用高灵敏度档测定时，通常会观察到溶剂的拉曼峰，也应注意与样品荧光进行区分。拉曼峰的位置也与激发波长有关，同时会随着激发波长的变化而变化。其位置估算方法：?laman=1/(1/?ex-?H2O/107),其中波长单位为nm，?H2O为溶剂的红外吸收波长，单位为波数，溶剂为水时，主要的红外吸收是O-H伸缩振动，波长在3300波数。 狭缝的选择：激发和发射狭缝通常并不要求严格一致，为获得较好的灵敏度和准确反应谱峰形状，测定激发光谱时，选用较大的发射狭缝和较小的激发狭缝是比较好的。而测定发射光谱时则恰好相反。 灵敏度档的选择：灵敏度档与仪器中光电倍增管的放大倍数有关，对荧光比较弱的样品，应选择灵敏度较高的档位，反之亦反。但注意不同档位之间的荧光强度值没有确定的换算关系，不能相互比较。进行定量分析时，所有样品必须在同样的狭缝和灵敏度档位测量。 仪器及试剂 970MC荧光分光光度计 缓冲溶液：10-2mol/L Na2HPO4-NaOH缓冲溶液，pH=11-12 1-萘酚储备液：10?g/ml
(完整版)紫外分光光度计的使用方法
UV2600型紫外分光光度计操作规程 一、开机 1.打开仪器电源。 2.打开电脑，点击UV Analyst 进入光谱分析软件。 3.软件将自动搜索仪器端口，点击“联机”，软件与仪器联机成功。 二、选择测试模式 根据实验需求选择测试模式。仪器提供的测试模式有“波长扫描”“时间扫描”“定点测量”“定量测量”“核酸测量”和“蛋白质测量” 【波长扫描】主要用以检测样品对一定范围波长光的吸收情况，以便对样品进行定性测量。 1.点击左侧主功能栏中的“波长扫描”即可进入波长扫描界面。 2. 根据实验要求，在“设置”设定检测参数。 3. 在样品室内参比及检测光路同时放入装有空白溶液的比色皿。 4. 点击“基线测量”以扣除空白的背景吸收。 5. 将检测光路中的空白溶液换成待测样品。 6. 点击“扫描”。以完成样品波长扫描检测。 7. 点击“保存”并选择保存路径即可保存谱图。 注意：在“基线测量”中所选择的基线必须与参数设置中基线一致！ 【时间扫描】是检测样品在特定波长范围内吸光度（或透过率）随时间的推移而发生变化情况。主要用以检测样品的稳定性或进行化学动力学研究。 1. 点击左侧主功能栏中的“定量测量”即可进入定量测量界面。 2. 根据实验要求，在“设置”设定检测参数。 3 在样品室内参比及检测光路同时放入装有空白溶液的比色皿。 4. 点击“基线测量”以后扣除样品空白的背景吸收。 5. 将检测光路中的空白溶液换成待测样品。 6. 点击“扫描”。以完成样品波长扫描检测。 7. 点击“保存”并选择保存路径即可保存谱图。 【定点测量】是检测样品在特定波长中的吸光度（或透过率）。 1. 点击左侧主功能栏中的“定量测量”即可进入定量测量界面。 2. 根据实验要求，在“设置”设定检测参数。 3. 在样品室内参比及检测光路同时放入装有空白溶液的比色皿。 4. 点击“自动校零”，以扣除该波长中空白溶液的背景吸收。 5. 将检测光路中的空白溶液换成待测样品。 6. 点击“测量”，以完成样品的吸光度（或透过率）的测量。 7. 点击“保存”并选择保存路径即可保存测量结果。 【定量测量】可通过检测标准样品或输入特定的系数建立标准曲线后测量样品的浓度值。
分光光度法测量溶液色素含量实验方案设计报告
实验方案报告 实验课程：电子科技专业实验 实验项目：分光光度法测量溶液色素含量 班级：学号：姓名： 实验方案报告成绩：教师签名： 实验类型设计性 综合设计性 综合性 验证性 一、实验内容 使用分光光度计测出溶液中柠檬黄、日落黄、和胭脂红的浓度。 二、实验条件 仪器： 紫外可见分光光度计，电子天平；容量瓶、移液管、烧杯等玻璃仪器。 试剂： 柠檬黄、日落黄、胭脂红（试剂说明见附录2）；乙酸铵；光学纯水； 三、实验方案（方法、步骤） 一、先各称取100mg的柠檬黄、日落黄、胭脂红，用三个100ml容量瓶配置成1mg/ml的母液，在分别将每种母液用量筒量取4ml、6ml、8ml、12ml、16ml 到100ml容量瓶稀释成40ug/ml、60ug/ml、80ug/ml、120ug/ml、160ug/ml的子溶液，则有15瓶标准溶液。 二、分别测量80ug/ml（中间浓度）的柠檬黄、日落黄、胭脂红标准溶液的吸光度曲线，记录三者吸光度最大时的波长λ1、λ2、λ3。 λ1λ2λ3 426 nm 482 nm 508 nm
三、分别测量15瓶标准溶液和待测溶液在波长λ1、λ2、λ3时的吸光度。 λ1λ2λ3 柠檬黄40ug/ml0.119 0.036 0.003 60ug/ml0.199 0.061 0.006 80ug/ml0.285 0.087 0.008 120ug/ml0.482 0.146 0.012 160ug/ml0.675 0.204 0.015 日落黄40ug/ml0.050 0.114 0.098 60ug/ml0.080 0.185 0.160 80ug/ml0.121 0.282 0.243 120ug/ml0.222 0.512 0.441 160ug/ml0.320 0.739 0.634 胭脂红40ug/ml0.035 0.094 0.116 60ug/ml0.056 0.153 0.188 80ug/ml0.091 0.231 0.281 120ug/ml0.139 0.366 0.447 160ug/ml0.195 0.526 0.645 待测溶液0.593 0.713 0.624
微区紫外-可见分光光度计的设计与应用
实验7微区紫外-可见分光光度计的设计与应用 利用物质分子或者离子对某一波长范围的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析、以及结构分析，所依据的光谱是分子或者离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。按照所吸收的波长区域不同可以分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外－可见分光光度法。物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础。通过实验掌握紫外－可见吸收光谱分析所依据的物理原理，初步掌握微区紫外-可见分光光度计的设计方法，并利用实验室设备搭建测量光路。初步掌握利用吸收谱分析染料的能级结构和光学参数的方法。 一、实验目的 1.掌握紫外－可见吸收光谱分析所依据的物理原理 2.初步掌握微区紫外-可见分光光度法测量物质吸收谱的光路设计 方法，并利用实验室设备搭建测量光路。 3.初步掌握利用吸收谱分析染料的能级结构和光学参数的方法。 二、实验原理 光谱分析可以分为发射光谱分析和吸收光谱分析两大类。当构成物质的分子或原子受到激发而发光，产生的光谱称为发射光谱，发射光谱的谱线与组成物质的元素及其外围电子的结构有关。吸收光谱是指光通过物质被吸收后的光谱，吸收光谱则决定于物质的化学结构，
与分子中的双键有关。物质对光的吸收，与其分子结构有密切关系，因而不同物质因结构的差异，产生不同的吸收光谱，亦即吸收曲线。 （一）分子吸收谱的产生 分子吸收谱的形成机理是由于能级之间的跃迁所引起的，在分子中除了电子相对于原子核的运动外，还有原子核的相对振动和分子作为整体绕其质心的转动。分子的这三种运动状态都对应一定能级，它们之间的关系为：elec vib rot E E E ?>?>? 处在同一电子能级的分子，可能由于振动能量的不同，处在不同的振动能级上。分子处在同一电子能级和振动能级时，可能由于转动能级的不同而处在不同的转动能级上。所以分子的总能量是三种能量的总和 mol elec vib rot E E E E =++ （1） 当用频率为v 的光照射分子，而该分子的较高能级与较低能级之差E ?恰好等于hv 时，此时在微观上出现分子由较低能级跃迁到较高能级，在宏观上体现为光的强度变弱。若用一连续频率的光照射分子，将照射前后光强度的变化变为电信号记录下来，就可以得到一张光强度变化对波长的关系曲线。即分子吸收光谱图。 图1是双原子分子的能级示意图。从图中可看出，在同一电子能级中有几个振动能级，而在同一振动能级中又有几个转动能级。电子能级间的能量差一般为l ～20电子伏特(eV)。因此，由电子能级
紫外可见分光光度计及其应用
紫外可见分光光度计及其应用 科技论文写作期末作业 西北民族大学生命科学与工程学院 11级生物技术(1)班 符朝方 学号:P112114841 紫外可见分光光度计及其应用 李诗哲 西北民族大学生命科学与工程学院兰州 730100 摘要:紫外可见分光光度计对于分析人员来说是最有用的分析工具之一，几乎每一个分析实验室都离不开紫外可见分光光度计。下面介绍了紫外分光光度计的原理、结构及其特点，并介绍了它在生物领域的应用及其他方面的应用1引言:紫外可见分光光度计是一类很重要的分析仪器，无论在物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学等科学研究领域，还是在化工、医药、环境检测、冶金等现代生产与管理行业，紫外可见分光光度计都获得了日益广泛的应用。 2原理:紫外可见分光光度法 【1】紫外可见分光光度法是根据物质分子对波长为200~760nm的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。操作简单、准确度高、重现性好。波长长的光线能量小，波长短的光线能量大。分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了人射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。由于各种物质具有不同的分子、原子和不同的分
子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的 某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这是分光光度定性和定量分析的基础。分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。 【2】2.1有机化合物的紫外可见吸收光谱 有机化合物的电子跃迁 与紫外可见吸收光谱有关的电子有三种[[4]，即形成单键的σ电子、形成双键的π电子以及未参与成键的n电子。 跃迁类型有:σ?σ*、n?σ*，π?π*、n?π四种。 饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ?σ*，n?σ*跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。不饱合机化合物的电子跃迁类型为n?π*，π?π*跃迁，吸收峰一般大于200nm. 2.2有机化合物的吸收带 吸收带(absorption band):在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。 (1)R吸收带 (2)K吸收带 (3)B吸收带 (4)E吸收带 2.3无机化合物的紫外可见吸收光谱 无机化合物的UV-Vis光谱吸收光谱主要有:电荷 迁移跃迁及配位场跃迁。 (1)电荷迁移光谱
荧光分光光度计- 原理
分子荧光分析法 发光光谱：物质分子或原子吸收辐射被激发后，电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光、磷光。 根据物质接受的辐射能量的大小及与辐射作用的质点不同，荧光分析法可分为以下几种： 1. X射线荧光分析法 用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X 射线范围内的荧光。 2. 原子荧光分析法： 待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。 荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。 荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。 3. 分子荧光分析法： 有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。
基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂， 称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1 其多重性：M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。（二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能
分光光度计的原理与使用
分光光度计的原理与使用 一、目的要求： 1、学会紫外-可见分光光度计的原理和使用方法 2、学会测量溶液的浓度。 二、实验原理： 1、分光光度计原理：分光光度计是目前化验室中使用比较广泛的一种分析仪器，其测定原理是利用物质对光的选择性吸收特性，以较纯的单色光作为入射光，测定物质对光的吸收，从而确定溶液中物质的含量。其特点是灵敏度高；准确度高；测量范围广；在一定条件下，可同时测定水样中两种或两种以上的物质组分含量等。 分光光度计按其波长范围可分为可见分光光度计（工作范围360～800nm）、紫外-可见分光光度计（工作范围200～1000nm）和红外分光光度计（工作范围760～400000nm）等。 2、在日常使用及维护当中应注意以下几点： 第一，在使用仪器前，必须仔细阅读其使用说明书。 第二，若大幅度改变测试波长，需稍等片刻，等灯热平衡后，重新调零及满度后，再测量。 第三，指针式仪器在未接通电源时，电表的指针必须位于零刻度上。若不是这种情况，需进行机械调零。 第四，操作人员不应轻易触动灯泡及反光镜灯，以免影响光效率。 第五，放大器灵敏度换挡后，必须重新调零。 第六，比色皿使用时要注意其方向性，并应配套使用，以延长其使用寿命。新的比色皿使用前必须进行配对选择，测定其相对厚度，互相偏差不得超过2%透光度，否则影响测定结果。使用完毕后，请立即用蒸馏水冲洗干净（测定有色溶液后，应先用相应的溶剂或（1+3）的硝酸进行浸泡，浸泡时间不宜过长，再用蒸馏水冲洗干净），并用干净柔软的纱布将水迹擦去，以防止表面光洁度被破坏，影响比色皿的透光率。
第七，比色皿架及比色皿在使用中的正确到位问题。首先，应保证比色皿不倾斜。因为稍许倾斜，就会使参比样品与待测样品的吸收光径长度不一致，还有可能使入射光不能全部通过样品池，导致测试准确度不符合要求。其次，应保证每次测试时，比色皿架推拉到位。若不到位，将影响到测试值的重复性或准确度。 第八，干燥剂的使用问题。干燥剂失效将会导致以下问题：①数显不稳，无法调零或满度。②反射镜发霉或沾污，影响光效率，杂散光增加。因此分光光度计应放置在远离水池等湿度大的地方，并且干燥剂应定期更换或烘烤。 第九，分光光度计的放置位置应符合以下条件：避免阳光直射；避免强电场；避免与较大功率的电器设备共电；避开腐蚀性气体等。 3、吸光光度法测定溶液浓度原理 基于物质对不同波长的光波具有选择性吸收的能力而建立起来的分析方法。（1）光线： 光线的波长： 200nm-400nm 紫外线，400-750nm可见光， >750nm 红外线 光具有波粒二相性，波长不同，其能量不同。 （2）物质的吸收光谱及颜色： A．物质的原子吸收光谱和原子发射光谱：原子的最外层电子可以选择性吸收特征波长的电磁波成为激发态而产生的光谱称为原子吸收光谱。激发态原子恢复到基态，则释放出特征波长的光子，形成原子发射光谱。不同的溶液其光谱不同，即不同溶液对不同波长的光其吸收能力不同，对某一特定波长的光存在吸收峰。B．可见光由赤橙黄绿青兰紫等能量不同的光线组成，当可见光穿过某一溶液时，由于特定波长的光被吸收而使溶液呈现相应的颜色。（如CuSO4由于吸收了可见光中的黄光(600nm)而成蓝色）不同颜色的溶液对不同波长的光其吸收能力不同。（3）光吸收的基本定律（Lambert-Beer 定律）： 一束平行单色光（Io）通过有色的透明溶液时，一部分的光可以透过溶液（It），另一部分被溶液吸收（Ia）,还有一部分被器皿表面反射（Ir）,则： Io=It+Ia+Ir 。那么，该溶液透光率为: T = It / Io 。 1． Lambert 定律：设有一束平行单色光,通过液层厚度为b 的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力: A=Ig(Io/It)=Ig(1/T)=k2b