醛糖还原酶基因AR的克隆
醛糖还原酶基因AR的克隆
一、醛糖还原酶DNA模板的构建
抽取人体血液，经过亲和色谱法提取mRNA，该过程可用商业化的试剂盒分离系统，得到高纯度mRNA。再用RT-PCR法，逆转录出c-DNA,再合成AR基因。
二、引物设计
登陆NCBI网站，进入“核酸”中，输入醛糖还原酶的登陆码：U37100，找到该序列：
1 CAAAAACAGC AACAGAAAGC AGGACGTGAG ACTTCTACCT GCTCACTCAG AATCATTTCT 61 GCACCAACCA TGGCCACGTT TGTGGAGCTC AGTACCAAAG CCAAGATGCC CATTGTGGGC 121 CTGGGCACTT GGAAGTCTCC TCTCGGCAAA GTGAAAGAAG CAGTGAAGGT GGCCATTGAT 181 GCAGGATATC GGCACATTGA CTGTGCCTAT GTCTATCAGA ATGAACATGA AGTGGGGGAA 241 GCCATCCAAG AGAAGATCCA AGAGAAGGCT GTGAAGCGGG AGGACCTGTT CATCGTCAGC 301 AAGTTGTGGC CCACTTTCTT TGAGAGACCC CTTGTGAGGA AAGCCTTTGA GAAGACCCTC 361 AAGGACCTGA AGCTGAGCTA TCTGGACGTC TATCTTATTC ACTGGCCACA GGGATTCAAG 421 TCTGGGGATG ACCTTTTCCC CAAAGATGAT AAAGGTAATG CCATCGGTGG AAAAGCAACG 481 TTCTTGGATG CCTGGGAGGC CATGGAGGAG CTGGTGGATG AGGGGCTGGT GAAAGCCCTT 541 GGGGTCTCCA ATTTCAGCCA CTTCCAGATC GAGAAGCTCT TGAACAAACC TGGACTGAAA 601 TATAAACCAG TGACTAACCA GGTTGAGTGT CACCCATACC TCACGCAGGA GAAACTGATC 661 CAGTACTGCC ACTCCAAGGG CATCACCGTT ACGGCCTACA GCCCCCTGGG CTCTCCGGAT 721 AGACCTTGGG CCAAGCCAGA AGACCCTTCC CTGCTGGAGG ATCCCAAGAT TAAGGAGATT 781 GCTGCAAAGC ACAAAAAAAC CGCAGCCCAG GTTCTGATCC GTTTCCATAT CCAGAGGAAT 841 GTGATTGTCA TCCCCAAGTC TGTGACACCA GCACGCATTG TTGAGAACAT TCAGGTCTTT 901 GACTTTAAAT TGAGTGATGA GGAGATGGCA ACCATACTCA GCTTCAACAG AAACTGGAGG 961 GCCTGTAACG TGTTGCAATC CTCTCATTTG GAAGACTATC CCTTCGATGC AGAATATTGA 1021 GGTTGAATCT CCTGGTGAGA TTATACAGGA GATTCTCTTT CTTCGCTGAA GTGTGACTAC 1081 CTCCACTCAT GTCCCATTTT AGCCAAGCTT ATTTAAGATC ACAGTGAACT TAGTCCTGTT 1141 ATAGACGAGA ATCGAGGTGC TGTTTTAGAC ATTTATTTCT GTATGTTCAA CTAGGATCAG 1201 AATATCACAG AAAAGCATGG CTTGAATAAG GAAATGACAA TTTTTTCCAC TTATCTGATC 1261 AGAACAAATG TTTATTAAGC ATCAGAAACT CTGCCAACAC TGAGGATGTA AAGATCAATA
1321 AAAAAAATAA TAATCAT
该段序列在70---1020bp可以合成蛋白质
1、将上述数据导入到软件中（Primer Premier）
2、根据起始密码子（AUG）和终止密码子(UAG、UGA、UAA)，点击“Find”分别找出各位置：
ATG：70、106、502、925
TAG：1115
TGA：1018
TAA：1114
选择起始密码为502，终止密码为1018.输入软件300bp到900bp
选择如下片段
5` TCGGCAAAGTGAAAGAAG 3`
3` CTGATAGGGAAGCTACGT 5`
根据所选序列（143—1011）选择酶切位点
在143—1011序列含有的酶切位点有
在目的序列外的限制性内切酶有
选择EcoR Ⅰ和XbaⅠ作为双酶切限制性内切酶，
EcoRI G^AATTC
XbaI T^CTAGA
则上游引物序列：5` ATAT G^AATTC GAT---TCGGCAAAGTGAAAGAAG 3`
下游引物序列：5` TGC T^CTAGA T---TGCATCGAAGGGATAGTC 3`
三、PCR扩增
1、为了减少非靶序列的扩增，采用嵌套结构：即利用第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR 扩增的起始材料。
2、反应的dNTP的浓度要一致。
3、反应的条件有：模板、引物、原料（dNTP）、耐热的DNA聚合酶（Taq酶）、Mg离子浓度、反应缓冲液（BSA）、PCR促进剂等。
4、用琼脂糖凝胶电泳提纯扩增的DNA，在紫外灯下用刀片将目的区段切下来，放入DNA提取试剂盒中提纯。
变性：温度为94摄氏度，时间为30秒
退火：温度为52.9摄氏度
延伸：温度为72摄氏度，时间为30秒
循环次数：30次
四、载体的选择
选择Pcmv-n-His质粒
pCMV-N-His是碧云天自行研发的用于在哺乳动物细胞中表达N端和His tag (His标签)融合的目的蛋白的表达质粒。含有CMV启动子可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达；在多克隆位点的5’端含有一个可以编码His标签的序列，因此可以表达出含有His标签的融合蛋白，可以方便地使用抗His的抗体来识别目的蛋白，有利于目的蛋白检测和分离纯化。质粒为卡那霉素抗性。转染细胞后，可使用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。
pCMV-N-His质粒中对于插入片断进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物T7的序列如下：
T3 primer(620–639): 5′AATTAACCCTCACTAAAGGG 3′
T7 primer(815-836): 5′GTAATACGACTCACTATAGGGC 3′
五、重组质粒的构建
1、用限制性内切酶EcoR1、Xbal酶切Pcmv-n-His和AR基因。12 h后于75℃高温10 min 灭活两种酶。（反应条件由提供内切酶的公司提供）
2、用琼脂糖凝胶电泳法纯化酶切后的AR基因片段和Pcmv-n-His载体,再用DNA回收试剂盒回收。
3、酶切后的AR基因及载体DNA浓度用分光光度法260nm测定，目的基因/载体基因为 6/1或更高，加T4 DNA连接酶，于16℃连接过夜, 构建成重组质粒。
4、转染时的细胞密度对转染效率影响非常显著。阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数，有的要求细胞90%汇片；而有些多胺或者非脂质体的配方则要求在40%—80%之间，总之是尽量在细胞最适的生理状态下转染，以求最佳的转染效果
六、质粒的表达及检测
在小鼠肝脏细胞组织培养中计入抗His的抗体，如果重组质粒能够表达，则利用该抗体可以筛选出目标蛋白，从而可以判断目的片段是否表达。
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