醋酸纤维素薄膜电泳分离及定量测定血清蛋白成分
醋酸纤维素薄膜电泳分离及定量测定血清蛋白成分
一、实验目的
1．掌握醋酸薄膜电泳的原理及操作。
2．定量测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量。
3．掌握分光光度计的原理及操作
二、实验原理
采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素，是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为120μm。
醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术。它具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点。该技术已广泛应用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同功酶的分离和测定等方面。目前，醋酸纤维薄膜电泳趋向于代替纸电泳。
四、试剂和器材
（一）试剂
（1）新鲜血清——无溶血现象。
（2）巴比妥——巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.07M，离子强度0.06)：称取巴比妥
1.66g和巴比妥钠1
2.76g，溶于少量蒸馏水后定容1 000ml。
（3）染色液①：称取氨基黑10B 0.5g，加入蒸馏水40ml，甲醇50ml和冰乙酸10ml，混匀，在具塞试剂瓶内贮存。
（4）漂洗液①：取95％乙醇45ml，冰乙酸５ml和蒸馏水50ml。混匀，在具塞试剂瓶内贮存。[易挥发、密封]
（5）透明液①[易挥发、密封]
甲液—取冰乙酸15ml和无水乙醇85ml，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。
乙液—取冰乙酸25ml和无水乙醇75ml，混匀，装入试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。
（6）液体石腊。
（7）0.4mol氢氧化钠溶液：称取16g氢氧化钠（分析纯）用少量蒸馏水溶解后定容到1000ml。
（二）器材
（1）醋酸纤维素薄膜—2㎝×8㎝（浙江黄岩曙光化工厂等处生产）
（2）培养皿（直径9～10㎝）（3）血色素吸管或点样器
（4）直尺和铅笔（5）镊子
（6）电泳仪和电泳槽（7）万用电表
（8）玻璃板（8㎝×12㎝）（9）普通滤纸
（10）试管和试管架（11）吹风机
（12）单面刀片（13）擦镜纸
（14）吸量管（2ml、5ml）和吸量管架（15）722型分光光度计
五、实验仪器介绍
（1）722型分光光度计
①测量原理
分光光度法测量的理论依据是伯郎—比耳定律：当容液中的物质在光的照射和激发下，产生了对光吸收的效应。但物质对光的吸收是有选择性的，各种不同的物质都有其各自的吸收光谱。所以根据定律当一束单色光通过一定浓度范围的稀有色溶液时，溶液对光的吸收程度A与溶液的浓度c（g/l）或液层厚度b(cm)成正比。其定律表达式A=abc
（a是比例系数）。当c的单位为mol/l时，比例系数用ε表示，则A=εbc称为摩尔吸光系数。其单位为L·mol-1·cm-1它是有色物质在一定波长下的特征常数。 T(透光率)=I/I0 A(吸光度)= -lgT 或 A=K·C·L(比色皿的厚度) 测定时，入射光I, 吸光系数和溶液的光径长度不变时，透过光是根据溶液的浓度而变化的，即“K”为常数。比色皿厚度一定，“L”、“I0”
也一定。只要测出A即可算出“C”。（分光光度计的表头上，一行是透光率，一行是吸光度。）
②722型分光光度计的使用
1、将灵敏度旋钮调至“1”档（信号放大倍率最小）。
2、开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调至到测试用波长。仪
器预热20分钟。
3、打开试样室（光门自动关闭），调节透光率零点旋钮，使数字显示为000.0。
（调节100%T旋钮），盖上试样室盖，将比色皿
架处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透光率100%旋钮使数字显
示100.0。如显示不到100.0，则可适当增加微电流放大的倍数。（增加
灵敏度的档数同时应重复（3）调节仪器透光率的“0”位）但尽量使倍
率置于低档使用。这样仪器会有更高的稳定性。
4、预热后，按（3）连续几次调整透光率的“0”位和“100%”的位置，待稳
定后仪器可进行测定工作。
③吸光度“A”的测量
将选择开关置于A 。调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为零，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。
④浓度c的测量
将选择开关由“A”旋至“C”将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路即可读出被测样品的浓度值。
⑤注意事项
1、测量完毕，速将暗盒盖打开，关闭电源开关，将灵敏度旋钮调至最低档，
取出比色皿，将装有硅胶的干燥剂袋放入暗盒内，关上盖子，将比色皿中的溶液倒入烧杯中，用蒸馏水洗净后放回比色皿盒内。
2、每台仪器所配套的比色皿不可与其它仪器上的表面皿单个调换。
⑥使用方法
（1）预热仪器将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。
为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室
盖打开，使光路切断。
（2）选定波长根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。（3）固定灵敏度档在能使空白溶液很好地调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低的挡，使用时，首先调到“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升
高。但换挡改变灵敏度后，须重新校正“0%”和“100%”。选好的灵敏度，实验过程中不要再变动。
（4）调节T=0%轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”，（此时试样室是打开的）。
（5）调节T=100% 将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率
“100%”旋钮，使数字显示正好为“100.0”。
（6）吸光度的测定将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架
拉手，使待测溶液进入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。
读数后，打开试样室盖，切断光路。
重复上述测定操作1-2次，读取相应的吸光度值，取平均值。
（7）浓度的测定选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，此时数字
显示值即为该待测溶液的浓度值。
（8）关机实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架用软纸擦净。（2）醋酸纤维素薄膜
1原理
醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate membrance electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。
2应用
醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、廉价。已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点
3特点
（ 1）醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的
精确性。
（2）快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。
（3）灵敏度高，样品用量少。血清蛋白仅需2μl血清，甚至加样体积少至0.1μl，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。
（4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。
（5）醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。
4注意事项
1、醋酸纤维素薄膜的预处理
市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮15s—30s时，膜片吸水不均匀，则有白斑点或条纹，这提示膜片厚薄不匀，应舍去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小，浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹感染，取膜时，应戴指套或用镊子。
2、缓冲液的选择
醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液，其浓度为0.05mol/L—
0.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。选择时，先初步
定下某一浓度，如电泳槽两极之间的膜长度为8 cm—10cm，则需电压25V/cm膜长，电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm膜宽。当电泳达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中不易分辨。
3、加样量
加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量则越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品0.1μl—
0.5μl约相当于5μg—1000μg蛋白。血清蛋白常规电泳分离时，每厘
米加样线加样量不超过1μl，相当于60μg—80μg的蛋白质。但糖蛋白
和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验
加以选择。
点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。
4、电量的选择
电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm 宽膜为宜。电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。
5、染色液的选择
对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免引起醋酸纤维素膜溶解。
应控制染色时间。时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅不宜区分，或造成条带染色不均，必要时可进行复染。
6、透明及保存
透明液应临用前配制，以免冰乙酸及乙醇挥发影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前，薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好，如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。
透明后的薄膜完全干燥后才浸入石蜡中，使薄膜软化。如有水，则体石
蜡不易浸入，薄膜不易平展
六、操作方法
一、仪器和薄膜的准备
1．醋酸纤维素薄膜的润湿的选择：将薄膜小心地放入盛有缓冲液的培养皿内，使它漂浮在液面。若迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地均匀；若润湿时，薄膜上出现深浅不一的条纹或斑点等，则为薄厚不匀的薄膜。实验中应选用质地均匀的薄膜。因为，纤维素薄膜的质量对电泳的结果影响很大。例如，膜厚薄不均可以造成区带歪扭不齐、各区带界限不情、背景脱色困难、实验结果难于重复等现象。
将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面。
2．制作“滤纸桥”：剪裁尽寸合适的滤纸条。取双层附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电泳槽的缓冲液内。然后，用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸
桥”。按照同样的方法，在另一个电泳槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。
它们的作用是联系醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液之间的中间“桥梁”。
3．平衡：用平衡装置（或自制的平衡管），使两个电泳槽内缓冲液的液面彼此处于水平的状态。一般需要平衡15～20min。注意，平衡后应将平衡装
置的活塞关好（或除去平衡管）。
二、点样
在薄膜无光泽的一面点样。点样区距负极端1.5㎝处。点样时，先用血色素吸管将2～3微升的血清均匀地涂在点样器表面，再用点样器“印”在薄膜的点样区内（见图4－1）。注意。应使血清均匀分布在点样区，形成具有一定宽度、精细匀称的直线，切不可用力过大把薄膜弄破。事先可在滤纸上练习点样，掌握点样技术，这是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。
三、电泳
将已点样的薄膜使无光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上，参照图4－2。平衡10min，仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后,通电。打开电源开头，调节电压和电流强度，先旋动仪器粗调旋钮，再旋动细调旋钮。调节到薄膜每厘米宽的电流强度为0.3mA，通电10～15min后，再将电压和电流强度提高到薄膜每厘米长度电压为10V左右，薄膜每厘米宽的电流强度为
0.4～0.6mA。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高或偏低。
待电泳区带展开约3.5㎝时，则并闭电源，一般通电时间为60min左右①。
电泳时间的长短，应以获得血清各组分的最佳分离效果为标准。因为，使用不同型号电泳仪进行实验，有时所需电泳时间差异较大。另外，电泳时产生大量的热，为了获得重复性强、区带清晰的电泳图谱，应使用冷却装置降温。
在炎热的夏季，更为必要。
四、染色
电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。然后，用漂洗液浸洗，每隔10min左右换一次漂洗液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。
将膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。操作中，要注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。
五、结果判断
一般的染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。
六、透明
将染色后漂洗干净的薄膜用吹风机吹干，再浸入透明液的甲液中，浸泡2min 后立即浸入透明液的乙液中，浸泡1min （要准确），然后迅速取出薄膜，将它紧贴在玻璃板上，不要存留气泡。大约2～3min 内的薄膜完全透明，放置10～15min 后，用吹风机将膜吹干。在水笼头下将玻璃板上透明的薄膜润湿后，用单面刀片从膜的一角撬起，并划开一端，再用手捏住撬起的膜轻轻撕下，可以容易地从玻璃板上取下透明的薄膜。用滤纸吸干，浸入液体石腊中，约３min 后取出。再用干净的滤纸吸干，压平，则成为色泽鲜艳而又透明的血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱，可长期保存不褪色。
七、定量
未经透明处理的血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱可直接用于定量测定。一般采用洗脱法或光密度计法，测定各蛋白质组分的相对百分含量。
１．洗脱法：将电泳图谱的各区带剪下，分别浸入盛有0.4mol 氢氧化钠溶液的
试管中，清蛋白管加入4ml ，其余每管各加２ml ，摇匀，放入37℃恒温水浴上浸提30min ，每隔10min ，充分摇动一次，以便将色泽完全洗脱下来。该溶液颜色较稳定，在室温下24小时内颜色强度无显著变化。然后在620nm 波长处比色，测定各管的光密度值为O.D A 、O.D α1、O.D α２、O.D β、O.D γ。按下列方法计算血清各部分蛋白质所占百分率。
（１）先计算光密度值总和（简写为Ｔ）：
Ｔ＝２×O.D A ＋O.D α1＋O.D α２＋O.D β＋O.D γ
（２）再计算血清各部分蛋白质所占百分率（即相对百分含量）：
α1球蛋白％= O.D α1 ×100 γ球蛋
白％=
O.D γ ×100 T T α2球蛋白％= O.D α2 ×100
T
正常值：清蛋白54.0～73.0；α１球蛋白2.8～5.1% ；α2球蛋白6.3～0.6%；β球蛋白5.2～1.0%；γ球蛋白12.5～0.0%。
２．光密度计法：将干燥的血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱放入自动扫描光密
度仪（或色谱扫描仪）内，通过反射（使用未透明的薄膜时）或透射（用已透明的薄膜时）方式，在记录器上自动绘出血清蛋白质各组分曲线图，横坐标为膜的长度，纵坐标为光密度（或光强度），每一个峰代表一种蛋白质组分。然后，用求积仪测量出各峰的面积，计算每个峰的面积与它们总面积的百分比就代表血清中各种蛋白质组分的百分含量。或将曲线图上各峰沿曲线剪下，称量各峰的重量，计算每个峰的重量与它们总重量的查分比也可以代表血清中各种蛋白质组分的百分含量。在使用具有电子计算机附件的自动扫描光密度仪时，可以由显示部分或打字带上获得血清蛋白醋酸纤维素薄膜电清蛋白％
= ２×O.D A
×100 β球蛋白％=
O.D β ×100 Ｔ T
泳图谱上每条区带所代表的蛋白质组分的含量。
八、醋酸纤维素电泳血清蛋白结果
醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白 【实验目的】 掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法。 【实验原理】 蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。 血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。 表1 人血清中各种蛋白质的等电点及相对分子质量 蛋白质名称等电点相对分子质量 白蛋白 4.88 69000 α1-球蛋白 5.06 200000 α2-球蛋白 5.06 300000 β-球蛋白 5.12 90000~150000 γ-球蛋白 6.85~7.50 156000~300000 在一定范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH 溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。 肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时α1、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。 【实验器材及试剂】 器材：醋酸纤维薄膜，人血清或牛血清，烧杯，培养皿，镊子，载玻片，盖玻片，电吹风，电泳槽，直流稳压电泳仪，剪刀，手套，滤纸；
醋酸纤维素薄膜电泳指导
醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白目的和要求? 目的和要求? 掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理及操作方法原理? 原理? 带电质点在电场中向着反向电极移动的现象称为电泳其移动方向及速度取电泳，电泳决于本身所带电荷的性质和数量、电场强度以及溶液pH 等因素。蛋白质分子在溶液中的电泳是因其分子具有一些游离的可解离基团如-COOH、-NH2、-OH 等，因而在某种pH 值溶液中蛋白质分子带有一定的电荷。混合蛋白样品中由于各蛋白质的等电点不同，在同一pH 溶液中所带的电荷性质及电荷数目不同，因此在电场中各种蛋白质泳动的方向和速度也不同，从而使蛋白质混合样品得以分离。血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白等，其氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状等均有所不同。由下表可见，血清中 5 种蛋白质的等电点大多低于pH7.0，pH8.6 的缓冲液中都电离成负离子(羧基解在离)，故在电场中均向阳极移动。蛋白质种类清/白蛋白α1-球蛋白α2-球蛋白β-球蛋白γ-球蛋白等电点(pI) 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85~7.50 相对分子量(Mr) 69 000 200 000 300 000 90 000~150 000 156 000~300 000 在一定范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将各蛋白质区带剪下，分别用0.4 mol/L NaOH 溶液浸洗下来，通过比色法或将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，以测定特定电泳区带的蛋白质相对含量。本实验采用的醋酸纤维薄膜电泳法是以醋酸纤维薄膜为支持物。醋酸纤维素是将纤维素的羟基乙酰化后形成的纤维醋酸酯，将其溶于有机溶剂(如丙酮、氯仿、乙酸乙酯等)后于聚乙烯材料上涂
生物化学实验报告 姓名： 学号: 专业年级: 组别: 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目得 1、１、学习醋酸纤维薄膜电泳得基本原理与操作方法； 1、2、了解电泳技术得一般原理； １、3、掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量得方法。 二、实验原理 2、1、血清中各种蛋白质得等电点不同，一般都低于pＨ７、4。它们在pH8、6得缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动.由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带得电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳得速度也不同。因此可以将它们分离
为清蛋白(Ａlbumin）、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β－球蛋白、γ-球蛋白5条区带. 2、2、血清中不同蛋白质得等电点、分子量及含量 血清蛋白质等电点分子量占总蛋白 得% 清蛋白4、64６9，0０0 57~72 α1－球蛋白5、０6 2００，0０0 2～５ α2—球蛋白 5、06 3０0,000 4～9 β－球蛋白 5、12 ９0，000～１5０，０00 6、5～１２ γ—球蛋白 6、８5～7、３ 1５６,000~950，000 12~2０ 缓冲液ｐH=8、6，ｐI＜pH. 血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动。 预测血清蛋白电泳区带图 血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白得α１、α2、β、γ五个区带 2、3、①膜条经过氨基黑1０B染色后显出清晰色带;②各色带蛋白质含量与染料结 合量基本成正比；③可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中；④用分光光度法计算各种 蛋白质得百分数。
三、材料与方法： 3、1、实验材料： 3、1、1、实验试剂：①样品:健康人血清（新鲜、无溶血);②巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8、６,离子强度０、０6mol/L）;③氨基黑１0Ｂ染色液;④漂洗液;⑤洗脱液：0、4mol/NaOH溶液。 ３、１、2、实验器材：①Ｖ－１100分光光度计(×1）；②恒温水浴箱(×１）; ③试管(×6)、试管架(×1）；④1000μL加样枪(×1)、加样枪架(×1);⑤醋酸纤维薄膜（2cm*8ｃm,厚度１20μm）；⑥培养皿(×5)；⑦点样器或载玻片(×１）；⑧平头镊子(×2）;⑨剪刀（×1）;⑩电泳槽（×１)；?直流稳压电泳仪（×１) 3、2、实验步骤
醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白 [目的与原理] 掌握醋酸纤维素薄膜电泳原理及操作技术，利用该电泳技术分析和测定人或鱼血清中各种蛋白质相对百分含量。 醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate membrance electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。 本实验以醋酸纤维素为支持物，分离各种血清蛋白，血清中含有清蛋白，α—球蛋白、β—球蛋白、γ—球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同（表1-2-8），在电场中迁移速度不同，分子量小、等电点低、在相同碱性pH 缓冲系统中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快 例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白（如图1-2-7）。这些区带经洗脱后可用分光光度计法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。临床医学常利用它们间相对百分比的改变或异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。此法由于操作简单、快速、分辨率高及重复性好等优点。目前，以成为临床生化检验的常规操作之一。它不仅可用于分离血清蛋白，还可以分离脂蛋白，血红蛋白及同工酶的分离测定。 图1-2-7正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1．为清蛋白，2，3，4，5，分别为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6为点样原点 [试剂与器材] 试剂： 1、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，备用。 2、血清蛋白染色 （1）染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml混匀溶解后置具塞试剂瓶中贮存。 （2）漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50 ml混匀置具塞试剂瓶贮存。 （3）透明液：临用前配制。
血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验报告 实验名称血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 实验日期实验地点xx实验室 合作者xxx 指导老师xxx 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.1.学习醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作方法； 1.2.了解电泳技术的一般原理； 1.3.掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。 二、实验原理 2.1.血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。 血清蛋白质等电点分子量占总蛋白的％ 清蛋白 4.64 69,000 57～72 α1－球蛋白 5.06 200,000 2～5 α2－球蛋白 5.06 300,000 4～9 β－球蛋白 5.12 90,000～150,000 6.5～12 γ－球蛋白 6.85～7.3 156,000～950,000 12～20 缓冲液pH=8.6，pI＜pH。
血清蛋白带负电荷，在电场中向正极移动。 预测血清蛋白电泳区带图 血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带 2.3.①膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带；②各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比；③可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中；④用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。 三、材料与方法： 3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①样品：健康人血清（新鲜、无溶血）；②巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06mol/L）；③氨基黑10B染色液；④漂洗液；⑤洗脱液：0.4mol/NaOH溶液。 3.1.2.实验器材：①V-1100分光光度计（×1）；②恒温水浴箱（×1）；③试管（×6）、试管架（×1）；④1000μL加样枪（×1）、加样枪架（×1）；⑤醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm）；⑥培养皿（×5）；⑦点样器或载玻片（×1）；⑧平头镊子（×2）；⑨剪刀（×1）；⑩电泳槽（×1）；?直流稳压电泳仪（×1） 3.2.实验步骤 1．准备与点样：①取2×8cm的膜条；②亚光面距一端1.5cm处取一点样线；③充分浸透在巴比妥缓冲液中；④取出膜条，用滤纸吸去多余的缓冲液；⑤点样器下端粘上薄层血清；⑥垂直点样。 点样示意图：
实验三血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素薄膜电泳分析技术是目前临床常规测定中应用最广的方法，具有微量、快速、简便、吸附作用和电渗作用小、分离区带清晰、灵敏度及分辨率高等特点。醋酸纤维素薄膜还可进行透明化处理，便于照相和扫描计算结果。广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同工酶的分离和测定。 【目的】 1.掌握电泳法分离蛋白质的原理、操作方法。 2.了解电泳法分离蛋白质的临床意义。 【原理】 带电粒子在电场中向与其电性相反的电极泳动的现象称为电泳。血清中各种蛋白质的等电点大多在pH4.0～7.3之间，在pH8.6的缓冲液中均带负电荷，在电场中都向正极移动。由于血清中各种蛋白质的等电点不同，因此在同一pH环境中所带负电荷多少不同，又由于其分子大小不同，所以在电场中泳动速度也不同。分子小而带电荷多者，泳动速度较快；反之，则泳动速度较慢。因此通过电泳可将血清蛋白质分为5条区带，从正极端依次分为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β-球蛋白和γ球蛋白等，经染色可计算出各蛋白质含量的百分数。 【器材】 醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）、培养皿、滤纸、无齿镊、剪子、加样器（可用盖玻片或或微量加样器）、直尺、铅笔、玻璃板（8cm×12cm）、试管、试管架、吸管、电泳仪、电泳槽、分光光度计或吸光度扫描计。 【试剂】 1. 巴比妥缓冲液(pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06) 称取巴比妥钠12.76g、巴比妥1.66g，加500毫升蒸馏水，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水至1000毫升。 2. 氨基黑10B染色液 称取氨基黑10B 0.5g加入冰醋酸10ml、甲醇50ml,混匀，加蒸馏水至100ml。 3. 漂洗液 甲醇45ml、冰醋酸5ml，混匀后加蒸馏水至100ml。 4. 洗脱液 0.4mol／LNaOH溶液。
山东大学实验报告2011年 3月27日 张行润系年级2009级生科4班学号7 同组者于潜 科目生物化学实验题目醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白仪器编号105 一、实验目的 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法。二、实验原理 蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。 血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。
在一定范围内，蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。 肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时α1、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。 三、实验器材 1、醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm） 2、人血清； 3、烧杯及培养皿数只； 4、点样器； 5、竹镊子； 6、玻璃棒； 7、电吹风； 8、试管六只； 9、恒温水浴锅； 10、电泳槽； 11、直流稳压电泳仪； 12、剪刀 四、实验试剂 1.电极缓冲液 2.染色液（可重复使用，使用后回收）
实验三血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 一、目的： 1、掌握醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作方法 2、学会常用电泳的使用方法 3、了解用醋酸纤维薄膜作支持物的优点及使用范围 二、原理： 由于各种血清蛋白质的等电点不同，因此在pH8.6的缓冲液中，各种血清蛋白质所带电荷量不同，同时由于它们的分子量也不同，造成电泳迁移率不同，所以在醋酸纤维薄膜上，电泳后，可将各种血清蛋白质分离开。 三、器材： 醋酸纤维薄膜（2×8cm）、电泳仪、点样器（盖玻片）、培养皿、粗滤纸、玻璃板（载玻片）、镊子等。 四、试剂： 巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07。巴比妥钠12.7g、巴比妥1.66g于蒸馏水中加热溶解后再加水至1000ml） 氨基黑染色液（氯基黑10B0.5g、甲醇50ml、冰醋酸10ml、蒸馏水10ml） 漂洗液（95％乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml） 血清 五、操作： 1、识别标记：将薄膜切成2.5×8cm的小片。在薄膜无光泽面(正面)的一端约2cm处用铅笔划一线，以标明点样位置。 2、浸泡：用镊子将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上(缓冲液盛于培养皿中)，使膜条自然浸湿下沉。大约10min。 3、点样：取出薄膜，用滤纸将表面的明水吸干，然后平铺在载玻片上（无光泽面朝上），将盖玻片先在小培养皿中的血清中沾一下，再在距膜条一端2cm处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。 4、电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲溶液内。用缓冲溶液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥）。点样端靠近负极，盖严电泳室，160V，45min。 5、染色：将膜条取出，放在显色液中显色10min。
实验九醋酸纤维薄膜电泳 一、实验目的 学习掌握电泳原理 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及染色鉴定 二. 实验原理 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。电泳的基本原理 带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。 在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（X）的乘积。F＝QX 质点的前移同样要受到阻力（ f ）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：f ＝6πr ην（r为质点半径，η为介质粘滞系数，ν为质点移动速度） 当质点在电场中作稳定运动时：F＝f 即：QX＝6πrην 在具体实验中，移动速度V为单位时间t（单位为s）内移动的距离d（单位为cm），即V＝d/t。电场强度X为单位距离L（单位为cm）内电势差E （单位为伏特），即 X＝E/L。将这两个公式代入上述公式，得到 U=v/X=dL/Et d=u*Et/L 由此可以得到两种物质移动距离的差为 △d=(d A-d B)=(u A-u B)Et/L 从这个公式可以看出物质能否进行分离决定于二者的迁移率。 影响因素 1. 待分离大分子的性质：所带的电荷、分子大小和形状，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快 2. 缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验 一．实验原理 1、电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离。 2、影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。 3、影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。 4、采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。 5、醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。 6、本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白。 二．实验仪器和试剂 ?器材 醋酸纤维素薄膜（3×8cm），培养皿，载玻片，电泳仪，电泳槽，粗滤纸，镊子 ?材料 新鲜血清（未溶血） ?试剂 1、巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.06）： 巴比妥1.66g, 巴比妥钠12.76g，加水至1000ml。置4℃冰箱保存，备用。（已配置） 2、染色液：氨基黑10B 0.5g, 甲醇50ml, 冰醋酸10ml，蒸馏 水40ml，混匀。 3、漂洗液：含95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀。 4、NaOH溶液：称取NaOH 16g，定容至1000ml。 三．实验过程 一.准备与点样 1.将薄膜剪成3×8cm的小条，在薄膜无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻轻划一条直线，表示点样位置。
实验3 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 一、实验目的 学习醋酸纤维薄膜电泳法的原理及操作。 测定人血清中各种蛋白质相对百分含量。 二、基本原理 蛋白质是两性电解质。在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，分别为白蛋白,α1球蛋白,α2球蛋白,β球蛋白,γ球蛋白,它们所具有的可解离基不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，因此在电场中移动速度不同，故可利用电泳法将它们分离。 醋酸纤维(二乙酸纤维素)薄膜具有匀一的泡沫状结构 (厚约120 μm)，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用，应用范围广和快速简便等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 三、试剂与器材 1．巴比妥—巴比妥钠缓冲液(pH 8.6，0.075 mol／L)： 称取巴比妥钠(A．R)15.4g和巴比妥(A．R．)2.76g，溶于蒸馏水，稀释至1000mL。用酸度计校测后使用。 2．染色液： 氨基黑10B 0.2g、甲醇(A．R)20mL、冰乙酸(A．R.)4mL，加蒸馏水16mL，混匀即可。 3. 漂洗液： 乙醇(A．R)90mL、冰乙酸(A．R)10 mL，加蒸馏水100mL，混匀即可。（现配现用）4．透明液： 冰乙酸(A．R)10mL、无水乙醇30mL（1：3），混匀即得。（现配现用） 5．人血清(新鲜、无溶血现象)。 6．器材： 醋酸纤维薄膜(12×8cm，2×8cm)；厚度120μm；培养皿直径Ф10cm(×8)；点样器(或载玻片)；直尺；铅笔；竹镊子；玻璃棒；烧杯50ml(×2)，200ml (×1)；试管1．5×15cm(×8)；吸管5mL(×1)；水浴锅；电泳槽；直流稳压电泳仪；分光光度计；剪刀。 三、操作步骤 1．搭滤纸桥： 取干净滤纸，折两次使之成为三层滤纸，再折一次，然后附着在电泳槽的支架上，使它一端支架的前沿对齐，而另一端浸入电泳槽的缓冲液中，用缓冲液将滤纸全部湿润驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上。 2．点样： 将醋酸纤维薄膜切成8×2cm条状(或根据需要决定薄膜的大小)，在距一端1.5cm处用铅笔轻轻划一直线，然后浸入缓冲液中，完全浸透后（大约30min），用镊子轻轻取出，将薄膜无光泽的一面向上，平放在于净滤纸上，薄膜上再放一张干净滤纸，吸去多余的
1.不悔梦归处，只恨太匆匆。 2.有些人错过了，永远无法在回到从前;有些人即使遇到了，永远都无法在一起，这些都是一种刻骨铭心的痛! 3.每一个人都有青春，每一个青春都有一个故事，每个故事都有一个遗憾，每个遗憾都有它的青春美。 4.方茴说：“可能人总有点什么事，是想忘也忘不了的。” 5.方茴说：“那时候我们不说爱，爱是多么遥远、多么沉重的字眼啊。我们只说喜欢，就算喜欢也是偷偷摸摸的。” 6.方茴说：“我觉得之所以说相见不如怀念，是因为相见只能让人在现实面前无奈地哀悼伤痛，而怀念却可以把已经注定的谎言变成童话。” 7.在村头有一截巨大的雷击木，直径十几米，此时主干上唯一的柳条已经在朝霞中掩去了莹光，变得普普通通了。 8.这些孩子都很活泼与好动，即便吃饭时也都不太老实，不少人抱着陶碗从自家出来，凑到了一起。 9.石村周围草木丰茂，猛兽众多，可守着大山，村人的食物相对来说却算不上丰盛，只是一些粗麦饼、野果以及孩子们碗中少量的肉食。 附录ⅣA醋酸纤维素薄膜电泳法 试剂（1)巴比妥缓冲液(pH8.6) 称取巴比妥2.76g、巴比妥钠15.45g，加水溶解使成1000ml。 （2)氨基黑染色液称取氨基黑10B 0.5g，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。 （3)漂洗液量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。 （4)透明液量取冰醋酸25ml、无水乙醇75ml，混匀。 测定法取醋酸纤维素薄膜，裁成2cm×8cm膜条，将无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液后，将膜条无光泽面向上，置含巴比妥缓冲液(pH8.6)的电泳槽架上，通过滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中。于膜条上距负极端2cm处，条状滴加蛋白含量约5％的供试品溶液2～3μl,在0.4～0.6mA/cm ［总电流量=电流量(mA/cm)×每条膜的宽度（cm）×膜条数］电流条件下电泳；同时取新鲜人血清作对照，电泳时间以白蛋白与丙种球蛋白之间的电泳展开距离约2cm为宜。电泳完毕，将膜条取下浸于氨基黑或丽春红染色液中，2～3分钟后，用漂洗液浸洗数次，直至脱去底色为止。将洗净并完全干燥的膜条浸于透明液中，待全部浸透后，取出平铺于洁净的玻板上，干燥后即成透明薄膜，可供测定纯度和作标本长期保存。将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪采用反射（未透明薄膜）或透射（已透明薄膜）方式在记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图，以人血清作对照，按峰面积计算各蛋白组分的含量(%)。 附注：采用全自动电泳仪操作时，参考仪器使用说明书进行。 1.“噢，居然有土龙肉，给我一块！” 2.老人们都笑了，自巨石上起身。而那些身材健壮如虎的成年人则是一阵笑骂，数落着自己的孩子，拎着骨棒与阔剑也快步向自家中走去。 3.石村不是很大，男女老少加起来能有三百多人，屋子都是巨石砌成的，简朴而自然。 4.在村头有一截巨大的雷击木，直径十几米，此时主干上唯一的柳条已经在朝霞中掩去了莹光，变得普普通通了。 5.这些孩子都很活泼与好动，即便吃饭时也都不太老实，不少人抱着陶碗从自家出来，凑到了一起。 6.石村周围草木丰茂，猛兽众多，可守着大山，村人的食物相对来说却算不上丰盛，只是一些粗麦饼、野果以及孩子们碗中少量的肉食。
实验十：血清醋酸纤维薄膜电泳 【实验名称】：血清醋酸纤维薄膜电泳 室温：25° （一）实验目的： 1.学习醋酸纤维薄膜电泳原理。 2.掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的技术。 3.熟悉血清蛋白组分定量方法，并确定血清中蛋白与球蛋白的比值。（二）实验原理： 血清绝大多数蛋白质的等电点在pH5.0～7.0。在pH8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白全部带负电荷，在直流电场中向正电极移动，移动的速度与带电蛋白质颗 粒所带电荷成正比，与蛋白质颗粒的大小成反比。如果样品点在醋酸纤维薄膜的同 一条线上，电泳相同的时间，不同的蛋白质颗粒移动的距离不同，通过染色，薄膜 条上的血清的蛋白质被分离成不同的条带。将此薄膜条透明，可以进行扫描，或将 色带剪下，将颜色洗脱，进行比色，都能获得各色带所含蛋白质占血清总蛋白的百 分比，并可计算血清中清蛋白／球蛋白比值，正常值为1.5～2.5。 （三）实验材料与仪器： 1．实验仪器材料：1、醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm）2、人血清；3、烧杯及培养皿数只；4、x光片；5、镊子；6、试管六只；7、电泳槽；8、 直流稳压电泳仪；9、7220型分光光度计；10、剪刀 2．实验试剂：1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液：取两个大烧杯，分别称取巴比妥钠和巴比妥溶解于500ml蒸馏水中；2、染色液，可反复使用；3、漂洗液：取 乙醇45ml，冰醋酸10ml，混匀；4、浸出液：0.4mol/L NaOH溶液； （四）实验步骤： 1、准备和点样 取一条醋酸纤维薄膜，侵入缓冲液中，完全侵泡后，用镊子轻轻取出，将薄膜 无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，再放一张干净滤纸吸取多余的缓冲液。 用X光片蘸取少量血清，然后轻轻于距离薄膜端1.5cm处接触，样品即成一条 线突于纤维膜上。待血清透入膜内，将薄膜放在电泳槽上。 2、电泳 接通电源，设定电泳电压为100V，通电50min. 3、染色漂洗 电泳完毕后，将薄膜侵泡在染色液中5min～10min.取出，用漂洗液漂至背景 无色。 4、定量 取出六只试管，将漂净的薄膜用滤纸吸干，剪下薄膜上各条蛋白质色带，另取 一条与各区带相近似宽的无蛋白质附着的空白薄膜，分别侵泡于4.0ml 0.4mol/L NaOH 溶液中，然后用7200型分光光度计在650nm处比色，以空白条薄膜洗 出液为空白调零，测定各管的吸光度。 (五) 实验数据记录：
前言 血清蛋白： 血清蛋白是血液中脂肪酸的携带者。当身体需要能量或者需要 建造材料时，脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中 ，脂肪酸被血清蛋 白获取，并被运送到需要的部位。 牛血清白蛋白的相对分子质量为10 的4次方这个级别，它不是一定的，是多聚物，有的地方测的70 000，这就是一个数据了。在做PCR 的时候会用到它。 牛血清蛋白是血液的主要成分，分子量68kD 。等电点4.8。含 氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。 白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二 硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴 离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作 用、PH 缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中， 添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。醋酸纤维薄膜电泳： 、管路敷设技术通过管线不仅可以解决吊顶层配置不规范高中资料试卷问题，而且可保障各类管路习题到位。在管路敷设过程中，要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标高等，要求技术交底。管线敷设技术包含线槽、管架等多项方式，为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题，合理利用管线敷设技术。线缆敷设原则：在分线盒处，当不同电压回路交叉时，应采用金属隔板进行隔开处理；同一线槽内，强电回路须同时切断习题电源，线缆敷设完毕，要进行检查和检测处理。、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行 高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系，根据生产工艺高中资料试卷要求，对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验；对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作；对于继电保护进行整核对定值，审核与校对图纸，编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案，编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案；对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。对于调试过程中高中资料试卷技术问题，作为调试人员，需要在事前掌握图纸资料、设备制造厂家出具高中资料试卷试验报告与相关技术资料，并且了解现场设备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。 、电气设备调试高中资料试卷技术电力保护装置调试技术，电力保护高中资料试卷配置技术是指机组在进行继电保护高中资料试卷总体配置时，需要在最大限度内来确保机组高中资料试卷安全，并且尽可能地缩小故障高中资料试卷破坏范围，或者对某些异常高中资料试卷工况进行自动处理，尤其要避免错误高中资料试卷保护装置动作，并且拒绝动作，来避免不必要高中资料试卷突然停机。因此，电力高中资料试卷保护装置调试技术，要求电力保护装置做到准确灵活。对于差动保护装置高中资料试卷调试技术是指发电机一变压器组在发生内部故障时，需要进行外部电源高中资料试卷切除从而采用高中资料试卷主要保护装置。
实验十：血清醋酸纤维薄膜电泳【实验名称】：血清醋酸纤维薄膜电泳 09救援一班第3大组李岚宇2009222336 室温：25° （一）实验目的： 1.学习醋酸纤维薄膜电泳原理。 2.掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的技术。 3.熟悉血清蛋白组分定量方法，并确定血清中蛋白与球蛋白的比值。（二）实验原理： 血清绝大多数蛋白质的等电点在pH5.0～7.0。在pH8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白全部带负电荷，在直流电场中向正电极移动，移动的速度与带电蛋白质颗 粒所带电荷成正比，与蛋白质颗粒的大小成反比。如果样品点在醋酸纤维薄膜的同 一条线上，电泳相同的时间，不同的蛋白质颗粒移动的距离不同，通过染色，薄膜 条上的血清的蛋白质被分离成不同的条带。将此薄膜条透明，可以进行扫描，或将 色带剪下，将颜色洗脱，进行比色，都能获得各色带所含蛋白质占血清总蛋白的百 分比，并可计算血清中清蛋白／球蛋白比值，正常值为1.5～2.5。 （三）实验材料与仪器： 1．实验仪器材料：1、醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm）2、人血清；3、烧杯及培养皿数只；4、x光片；5、镊子；6、试管六只；7、电泳槽；8、 直流稳压电泳仪；9、7220型分光光度计；10、剪刀 2．实验试剂：1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液：取两个大烧杯，分别称取巴比妥钠和巴比妥溶解于500ml蒸馏水中；2、染色液，可反复使用；3、漂洗液：取 乙醇45ml，冰醋酸10ml，混匀；4、浸出液：0.4mol/L NaOH溶液；（四）实验步骤： 1、准备和点样 取一条醋酸纤维薄膜，侵入缓冲液中，完全侵泡后，用镊子轻轻取出，将薄膜 无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，再放一张干净滤纸吸取多余的缓冲液。 用X光片蘸取少量血清，然后轻轻于距离薄膜端1.5cm处接触，样品即成一条 线突于纤维膜上。待血清透入膜内，将薄膜放在电泳槽上。 2、电泳 接通电源，设定电泳电压为100V，通电50min. 3、染色漂洗 电泳完毕后，将薄膜侵泡在染色液中5min～10min.取出，用漂洗液漂至背景 无色。 4、定量 取出六只试管，将漂净的薄膜用滤纸吸干，剪下薄膜上各条蛋白质色带，另取 一条与各区带相近似宽的无蛋白质附着的空白薄膜，分别侵泡于4.0ml 0.4mol/L NaOH 溶液中，然后用7200型分光光度计在650nm处比色，以空白条薄膜洗 出液为空白调零，测定各管的吸光度。
醋酸纤维素薄膜电泳 原理： 醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate membrance electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm 为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。 应用： 醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、廉价。已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。 特点： 1.（1）醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。 （2）快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用
小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。 （3）灵敏度高，样品用量少。血清蛋白仅需2μl血清，甚至加样体积少至0.1μl，仅含5μg 蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。 （4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。 （5）醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。 2、醋酸纤维素薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，操作简单，但分离效果不太好。如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只能分离出5—6条区带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带。 补充： 根据样品理化性质，从提高电泳速度和分辨力出发选择缓冲液的种类，pH和离子强度。选择好的缓冲液最好是挥发性强，对显色或紫外光等观察区带没有影响，若样品含盐量较高时，宜采用含盐缓
醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白实验报告 前言 血清蛋白: 血清蛋白是血液中脂肪酸的载体当身体需要能量或建筑材料时，脂肪细胞将脂肪酸释放到血液中，脂肪酸被血清蛋白捕获并运送到所需的位置 牛血清白蛋白的相对分子质量是10的四次方，这是不确定的，但是是一种聚合物，并且在一些地方测量到70，000，这是一个数据。它将用于聚合酶链反应 牛血清蛋白是血液的主要成分，分子量为68kD。等电点4.8氮含量16%，糖含量0.08%只含有己糖和己糖胺，脂肪含量仅为0.2%白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸残基形成17个二硫键，在肽链的第34位有一个游离巯基白蛋白可以与各种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合血液中的白蛋白主要起维持渗透压、缓冲液、载体和营养的作用。在动物细胞的无血清培养中，白蛋白的加入可以起到生理和机械的保护作用和载体作用。 醋酸纤维素薄膜电泳: 醋酸纤维素薄膜电泳以醋酸纤维素薄膜为载体它是纤维素的乙酸酯，由纤维素的羟基乙酰化而成。它溶解在有机溶液如丙酮中，并可被涂覆成厚度为0.1毫米-0.15毫米的均匀微孔膜太稠，吸水性差，分离效果差；如果它太薄，如果它缺乏应有的机械强度，膜就会变脆。
醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、廉价。它已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖白蛋白、甲胎蛋白、类固醇激素和同工酶等的分离和分析。虽然其分辨率低于聚丙烯酰胺凝胶电泳，但具有简单、快速的优点。功能: 1。(1)醋酸纤维素膜对蛋白质样品的吸附很少，没有“拖尾”现象。染色后，背景可以完全脱色，各种蛋白染色带可以清晰分离，提高了测定的准确性。 (2)快速节省时间醋酸纤维素膜的亲水性比滤纸差，膜中含有的缓冲溶液少，电渗少，电泳时大部分电流由样品传导，分离速度快，电泳时间短。一般来说，电泳时间只有45-60分钟。染色和脱色后，整个电泳过程只需约90分钟。 (3)灵敏度高，样品消耗少。血清蛋白仅需要2μl血清，即使样品体积小至0.1μl，对于仅含5μg蛋白的样品也可获得清晰的分离带。临床医学检查用它来检测病理条件下微量异常蛋白的变化。(4)应用广泛有些蛋白质不容易用纸电泳分离，如胎儿α球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等。醋酸纤维素膜电泳可以更好地分离。(5)电泳染色后，醋酸纤维素膜可浸泡在冰醋酸、乙醇混合溶液或其他溶液中，形成透明的干板，有利于扫描定量和长期保存。2.与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，醋酸纤维素薄膜电泳操作简单，但分离效果不是很好。例如，在醋酸纤维素薄膜电泳中，只有5-6条带能与白蛋白分离，而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，只有10条带能与白蛋白分离。 1。实验目的
实验一血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳 【实验目的】 （1）了解电泳的一般原理，掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术。 （2）测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量。 【实验原理】 带电荷的胶体粒子在电场中移动的现象称电泳。醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋酸纤维素薄膜作为支持物。 血清中含多种蛋白质，当在pH这8.6时，这些蛋白质均带负电，它们在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质所带负电荷多少及颗粒大小不同，所以在同一电场，同一pH环境中涌动速度不同。 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白，α~球蛋白，β~球蛋白，γ~球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分，立体构象，分子量，等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。分子量小，等电点低，相同碱性pH。 表1 人血清中12种蛋白质的等电点及分子量 缓冲体系中，带负电喝多的蛋白质颗粒在电场中移动速度快。例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清中pH=8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条区带。清
蛋白泳动最快，其余依次为α1~，α2~,β~及γ~球蛋白。这些区带经洗脱后可用分光光度法 定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。临床医学常利用它们异 常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。此法由于操作简单，快速。 图1 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 为清蛋白，2，3，4，5分别为α1,α2,β~及γ~球蛋白，6为点样原点 清蛋白球蛋白附注 α1 α2 βγ 妊娠↓↓↑↓中毒时更明显，产后2-3个月正常婴儿↑↑↑6个月时γ正常，其他成分6-10岁时正常糖尿病↓ 多发性骨髓瘤↑↑↑↑异常球蛋白，可在β和γ区带间出现M区带肝硬变↓↓↑↑↑↑在晚期失代偿时 阻塞性黄疸↑ 无丙种球蛋白血症↓↓ 全身性红斑狼疮↓↑↑↑ 类风湿性关节炎↓↑ 风湿热↑↑ 淀粉样变性↓↓↑↑ 肾病↓↑↑↑↓
生物化学实验报告 姓名: 学号: 专业年级: 组别: 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1、1、学习醋酸纤维薄膜电泳的基本原理与操作方法; 1、2、了解电泳技术的一般原理; 1、3、掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。 二、实验原理 2、1、血清中各种蛋白质的等电点不同,一般都低于pH7、4。它们在pH8、6的缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清
蛋白(Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 2、2、血清中不同蛋白质的等电点、分子量及含量 血清蛋白质等电点分子量占总蛋白的％ 清蛋白 4、64 69,000 57～72 α1－球蛋白 5、06 200,000 2～5 α2－球蛋白 5、06 300,000 4～9 β－球蛋白 5、12 90,000～150,000 6、5～12 γ－球蛋白 6、85～7、3 156,000～950,000 12～20 缓冲液pH=8、6,pI＜pH。 血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动。 预测血清蛋白电泳区带图 血清蛋白依次分为清蛋白,球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带 2、3、①膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带;②各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比;③可将各色带剪开,分别溶于碱性溶液中;④用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。 三、材料与方法: 3、1、实验材料: 3、1、1、实验试剂:①样品:健康人血清(新鲜、无溶血);②巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8、6,离子强度0、06mol/L);③氨基黑10B染色液;④漂洗液;⑤洗脱液:0、4mol/NaOH溶液。
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醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白（验证性） 相关知识 １．血清蛋白：血清中含有多种蛋白质，它们之中有的和某些糖类结合，形成糖蛋白。 ２．醋酸纤维素薄膜 醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强（厚度120微米），对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，可以很好的消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，具有用样量少（5μg的蛋白质可得到满意的分离效果），分离清晰，无吸附作用。 醋酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。 是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常 用的蛋白质染料。带有负电荷的磺酸基，能与蛋白分子上带正 电荷的侧链相结合。氨基黑分子含有较多的亲水基团，和蛋白 质亲水微区有很大的亲和力。因此，以凝胶基质作为电泳支持 洗，一般不使用它进行染色。 ４．根据电荷不同的纯化方法之一―――电泳 ５．血液：分为血细胞和血浆 ①血细胞：包括红细胞白细胞 ②血浆：是不含血细胞的。血浆中溶解着血纤蛋白原，它可转变成不溶性的血纤蛋白。 ③血清：是不含血纤蛋白原的血浆 ６．临床意义 急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭时，清蛋白降低，α1、α2和β-球蛋白升高； 慢性活动性肝炎、肝硬化时，清蛋白降低，β、γ-球蛋白升高；急性炎症时，α1、α2- 球蛋白升高；慢性炎症时，清蛋白降低，α2、γ-球蛋白升高；红斑狼疮、类风湿关节炎时， 清蛋白降低，γ-球蛋白显著升高；多发性骨髓瘤时，清蛋白降低，γ-球蛋白升高，于β 和γ-球蛋白区带之间出现“M”带。 一、实验目的 掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴 极移动；在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含 有数种蛋白质，它们所具有的可解离基不同，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对 分子质量、等电点及形状不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷也不同，因此，在电场中 迁移速度不同。在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，因此在电场中移动速度不同，故可