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流式细胞仪原理及操作步骤

流式细胞仪细胞分选的操作步骤

细胞分选的简要操作步骤一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制键RUN。 10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次，共需要1h。 13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次，共需要1h。 20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本二、分选细胞

流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 Annexin V 检测细胞凋亡

A n n e x i n V检测细胞凋亡实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。实验用品 1. 一次性12?75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8?C保存。 3. 微量加样器和加样头。

4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为 10?，使用时，用稀释为1?浓度的应用液。 5. Annexin V试剂与核酸染料： Annexin V 核酸染料 Annexin V-Biotin（Cat. No. 65872X）Streptavidin-FITC（Cat. No. 13024D） PI（Cat. No. 66211E）或7-AAD（Cat. No. 34321X） Annexin V-FITC（Cat. No. 65874X）PI（Cat. No. 66211E）Annexin V-PE（Cat. No. 65875X）7-AAD（Cat. No. 34321X） 6. FACS流式细胞仪：上样检测。 7. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。 8. Annexin V检测对照管： Annexin V A-阴性对照B-补偿1 C-补偿2 Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin 和SAv-FITC PI 和SAv-FITC PE 未染色细胞Annexin V-PE 7-AAD FITC 未染色细胞Annexin V-FITC PI 操作步骤 1.取Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。 2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1?Binding Buffer缓冲液制成1?106 细胞/ml的悬液。 3.Falcon试管中加入100 μl细胞悬液。 4.按以下体积加入Annexin V与核酸染料： 1阴性对照-- 2单阳1 AV-FITC - 4样本AV-FITC PI 5.轻轻混匀，室温（20?C ~25?C）避光处放置15分钟。

流式细胞仪操作规程

FACSCalibur流式细胞仪操作规程一、编号：YQ0606 二、标题：FACSCalibur流式细胞仪操作规程三、关键词：流式细胞仪操作规程四、目的：保证流式细胞仪的安全及有效操作五、背景知识：流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。六、原理待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过A/D转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双

《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程

流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)

Annexin V 检测细胞凋亡实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。

流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)

一、开机程序： 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印机。 3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以排除管路中气泡。二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过程中是否需要清洗样品。 4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果，退出FACSComp程序。备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。三、样品分析软件：CellQuest Pro 软件，选择“联机”。 1.

（2）对实验样本进行命名；（3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。备注：如果界面被关闭，重新调出步骤： 2.调出质控模板。 3.画图选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能够选中图形），将更改横纵坐备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC 。（1一般获取10000个细胞。（2 （ 3）将所有补偿调为0 （4）将非 52 （5）FSC和SSC （6 4.上阴性对照将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。通过移动通

自己总结：流式细胞仪的原理和用途

流式细胞仪（Flow Cytometry） 1 流式细胞仪的概念及其发展历史 1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。 1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。 2 流式细胞仪的工作原理和技术指标 2．1 流式细胞仪工作原理除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。流动室和液流系统

8. Attune NxT流式细胞仪标准操作规程

Attune NxT流式细胞仪标准操作规程一、启动Attune NxT流式细胞仪 1、依次打开电脑主机电源、显示器及仪器电源。电脑用户名为INSTR-ADMIN，密码为INSTR-ADMIN（全部大写）。 2、双击Attune软件图标，用户名为admin，密码为password1（全部小写）。 3、检查仪器内四个液体容器，清空“waste”桶中的废液，确认“Focusing fluid”、 “Wash solution”和“Shutdown solution”三个桶中的液体量是否满足实验要求（液面较高）。 4、点击startup，等待机器启动，整个过程大约需要3分钟。仪器指示灯显示为绿色，软件左下角出现绿色对勾即为启动完成。 5、点击performance test，在2mL鞘液中滴入3滴performance tracking beads，混匀后上机，点击Run Performance test。Performance test每天运行1次。这个过程大约耗时3分钟。二、检测样品 1、点击new experiment新建一个实验，选择tube或plate实验，输入实验名称，采用默认的Workspace和仪器设置参数，输入Tube Groups和Tube Samples 的数量，点击OK。 2、双击软件右侧Experiment下的Compensation，在弹出的对话框中选择相应的荧光通道，点击OK。 3、双击UC后上样，点击Run，并调节电压，电压调好后点击Record，依次将每个单染色的样本上样，并点击Record记录其荧光信号。 4、荧光补偿调好之后双击sample，上样后点击Run即可得到样本的荧光信号。根据需要建立散点图并建门。三、关闭Attune NxT流式细胞仪 1、确认”wash solution”和”shutdown solution”桶中液面高度至少在桶高的一半以上，清空“waste”桶。 2、点击shutdown，选择Quick、Standard或Full，样品管内加入3ml 10% bleach 液，点击next启动关机程序，此时请勿关闭软件或者终止shutdown过程，关

流式细胞仪的原理及应用

山西大学研究生学位课程论文（2013 ---- 2014 学年第一学期）学院（中心、所）：生物技术研究所专业名称：微生物学课程名称：论文题目：流式细胞仪的原理及其应用授课教师（职称）：崔晓东研究生姓名：常姣年级：研一学号：201323001003 成绩：评阅日期：山西大学研究生学院年月日

流式细胞仪的原理及其应用姓名常姣专业微生物学摘要本文简要论述了流式细胞仪( flowcyt ometry, FCM) 的工作原理, 并对其某些科学领域研究中的应用进行阐述, 包括在生物学、免疫学、临床学中的研究应用。关键词 FMC；生物学；免疫学；临床学流式细胞仪( fl o w c y to me tr y, F CM) 研制、发展、革新和应用领域的扩展，都是由生物学、生物技术、计算机科学、电子工程学、流体力学、激光技术、分子生物学、有机化学和物理学等多个学科综合发展和应用而实现的。近代流式细胞仪，由于单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、临床医学等众多研究领域的应用愈来愈广泛和重要，尤其在生物学中对细胞周期的动力学分析、细胞因子、细胞凋亡、信号传导、R N A / D N A 的分析、细胞表面受体及特异性抗原的分析等领域发挥着独特作用，具有操作简单、分析精确、重复性好、费用低廉、分析速度快等优点。 1流式细胞仪的构成及工作原理流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统、分析系统和细胞分选系统五个部分组成。将待测细胞制成单细胞悬液, 经荧光染料染色后加入样品管, 在一定气体压力下待测样品被压入流动室。待测细胞在鞘液的包裹下单行排列, 依次通过检测区, 被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后, 产生散射光和荧光信号。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管(PMT) 接收。散射光分为前向角散射(forwardscatter, FSC) 和侧向角散射(sidescatter, SSC) 。前者主要反映被测细胞的大小, 后者主要反映被测细胞的胞质、胞膜、核膜的折射等, 以及细胞内颗粒的性状。光信号通过波长选择通透性滤片后, 经光电倍增管接收后转为电信号, 再经数/模转换器转换为可被计算机识别的数学信号, 以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来[1,2]。流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选, 它是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体, 可以产生高频振荡, 使液流断裂为均匀的液滴, 待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷, 当带电液滴通过电场, 便会在电场的作用下发生偏转, 然后落入相应的收集器中, 从而实现细胞分选[2]。 2流式细胞仪的应用流式细胞术的应用，简单用一句话概括就是，凡能被荧光分子标记的细胞或微粒均能用流式细胞仪检测。其中细胞生物学领域是流式细胞术在基础研究中应用范围最广泛的领域，因为最初这个技术就是为此目的而设计的。 2.1流式细胞仪在生物学中的应用流式细胞仪在生物学中的应用越来越广泛,如在细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学、神经生物学、微生物学、分子免役学、植物学等等许多生物学基础学科的应用和在细胞凋亡、细胞周期调控、细胞因子及细胞分型等研究中的应用[3]。 2.1.1 对凋亡细胞的分析细胞凋亡是生物体生长发育过程中出现的正常现象, 在生物体形态构成、正常细胞更替以及维持

流式细胞仪操作方法

一、样品制备 1、取样（大约1×106 cells），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl的Rnase（GenScript试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl的PI染液（GenScript试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells，二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow），拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。 1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。结束后自动STANDBY，5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest，最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H（选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)

流式细胞仪使用方法

流式细胞仪的使用方法及相关资料仪器名称：流式细胞仪生产厂家：美国贝克曼库尔特有限公司使用方法：一．开机程序 1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。 2．打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。排出过滤器内的气泡。 4．如果需要打印，打开打印机电源。 5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。 6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。 7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files) 1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。 2．选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。 3．选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。4．将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。三．用CELLQuest进行仪器的设定和调整 1．从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。 2．从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。3．从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status 等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用+1，2，3，4获得此四个对话框。 4．在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode)：线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周

BDFACSCalibur流式细胞仪培训手册

B D F A C S C a l i b u r流式细胞仪 FACS101 Handbook 本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报。如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载。如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载。一、BD FACSCalibur基本结构 1.1仪器本体： 1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。 2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACSCalibur 基本型为例 FSC Diode 只收488 nm波长散射光 SSC PMT 只收488 nm波长散射光 FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm） FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm） FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm） 3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。流速控制： LO：样品流速：12 ?l /min MED：样品流速：35 ?l /min HI: 样品流速：60 ?l /min

功能控制： ?RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。） ?STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。 ?PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态。 4. 储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。 ?鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约 3小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。 ?废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。 ?鞘液过滤器：0.22?m过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液是干净的。 ?气路减压阀：沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。 ?空气过滤网：用于过滤冷却雷射的空气。 5. 上样品区：上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分，一个是进样针 Sample Injection Tube，将样本输入流动室，还有就是支撑架 Tube Support Arm、和液滴存留系统 Droplet Containment System。 ?进样针：是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管，是液滴保留系统的一部分。 ?支撑架：用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置：位于样本管之下的中位，样本管左侧或右侧。液滴存留系统：系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启动，将液体从外管吸入废液筒内。上样时，须注意将支撑架位于中位，以避免过多样品被抽吸到废液筒内（当支撑架位于中位，真空帮浦停止工作）。更换样品时，让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；切换到 STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。

流式细胞仪操作流程

查看文章流式细胞仪-细胞凋亡检测Ⅰ 2008-11-01 10:20 一PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面： 1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。 2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。试剂与仪器 l PBS溶液（配制方法见附录）； l PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。 l 70%乙醇 l 400目筛网 l 流式细胞仪实验步骤 1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去

流式细胞仪操作规程

流式细胞仪的使用程序分子病毒实验室一．开机程序 1．检查稳压器电源，打开电源，稳定 5 分钟。 2.打开储液箱，倒掉废液，并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至 4/5 满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFIow），合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 3.将 FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是 STANDBY，预热5- 10分钟。排出过滤器内的气泡。 4.如果需要打印，打开打印机电源。 5.打开电脑 , 等待屏幕显示出标准的苹果标志。 6.执行仪器 PRIME 功能一次，以排除 Flow cell 中的气泡。 7.分析样品时，先用 FACAFIow或PBS进行HIGH RUN约2分钟。。做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个 50ml 离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。预设获取模式文件(Acquisition Template Files) 从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个 1.

获取模式文件。 2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。从 Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的 x 轴和y 轴参数。 3.选取屏幕左列绘图工具中的 Histogram，同上法可绘出 Histogram （直方图）。 4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。 . 本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP 文件夹中，ACQ 用于细胞 DNA 检测， EXP 用于细胞表面标志分析。三.用CELLQuest进行仪器的设定和调整 1.从苹果画面中选取 CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。 2.从屏幕上方 Acquire指令栏中，选取Connect to Cytomete（（快捷键： + B）进行电脑和仪器的连机。将出现的 Acquisiton Control对话框移至合适位置。 3.从 Cytometer指令栏中，开启 Detectors/Amps、Threshold、Compensation Status等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用+1，2, 3, 4获得此四个对话框。 4.在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式（amplifier mode）:线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSC和SSC多以线性模式Lin测量，且DDM Param选择FL2，而FL1, FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时，FSC, SSC, FL1，FL2，FL3皆以Lin进行测量，且 DDM Param选择 FL2;分析血小板表

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于 100mm培养皿内 ↓ 24h后，进行所需的处理（比如加药,照射） ↓ 特定时间后终止培养，进行下一步的实验 ↓ 收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml 离心管中 ↓ 1000rpm离心5min（短时低速离心） ↓ 弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片 ↓ 加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。 ↓ 1000r/min,离心5min ↓

将乙醇吸除，加PBS清洗混匀 ↓ 1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去 ↓ 吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min) ↓ 加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min ↓ 将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管 ↓ 提前一天网上预约 ↓ 开机（先开仪器后开软件） ↓ 流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。 ↓ 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上

↓ 流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱 ↓ 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源） ↓ 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例） ↓ 在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析

BD FACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤_corr_ZYH_20140520

电子版本: \\NOVOPUBLIC\NovoBio\流式细胞仪\BD FACSCalibur 流式细胞仪简易操作步骤 _corr_ZYH_20140520 - 1 - BD FACSCalibur 流式细胞仪简易操作步骤一、开机 1）先打开净化交流稳压电源，其次打开110V 稳压输出电源，再次打开流式细胞仪，最后打开计算机。 2）向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，先将减压阀（红色箭头所示）方向调在VENT 位置（箭头方向），再加入超纯水，保持水位在鞘液桶的3/4左右，加好后拧紧桶盖并将减压阀方向调在RUN 位置。二、开启CellQuest 软件、编辑实验文件 1）在屏幕下方点击CELLQuest （第四个图标）启动软件。桌面会出现一’Untitled’ 实验文件，可点击实验文件的左上角的放大钮（绿色），将实验文件窗口放大。

2）从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框（当所要编辑的图窗口被选中时，会在其四角出现四个小黑块）。 3）在出现的散点图对话方框中点击Plot Source，选择Acquisition and Analysis (收取、分析) ，确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。 4）从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：FL1-H 1024；如果是双标，Y轴选择：FL2-H 1024(根据实验检测样品确定所选通道，本步骤选FL1/FL2来说明)，如果是单标，Y轴选择：SSC-H。点击OK，FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。

流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)

流式细胞仪操作方法

一、样品制备 1、取样（大约1×106 cells），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl的Rnase（GenScript试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl的PI染液（GenScript试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells，二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow），拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。 1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。结束后自动STANDBY，5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest，最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H（选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X 参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)

流式细胞技术原理

流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。 1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年Crosland –Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。 1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：(1)细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。(2)细胞的不同组