检测莱克多巴胺胶体金免疫层析试验的建立

中国动物检疫2009年第26卷第12期

莱克多巴胺是一种β２－肾上腺素能兴奋剂，具有再分配营养，促进蛋白质合成，提高动物机体瘦肉率的作用。由于莱克多巴胺在食品中的残留对人类健康有着很大的危害，被禁止在畜产品生产中使用［１－２］。欧盟早已明确禁止在食用性动物中使用包括莱克多巴胺在内的所有β－肾上腺素兴奋剂类药物，我国也于２００２年明确将其列入《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》。但迄今为止，仍有美国、加拿大、巴西等国家允许将莱克多巴胺限量用于食用性动物。近几年来，国家质量监督检验检疫总局下属的出入境检验检疫部门多次从美国和加拿大进口的冻猪肾、冻猪小排等猪副产品中检出莱克多巴胺残留。目前莱克多巴胺的检测主要依靠色谱技术，饲料中莱克多巴胺检测的高效液相色谱法国家标准（ＧＢ／Ｔ２０１８９－２００６）规定的检测限为０．５μｇ／ｇ；液相色谱质谱联用法国家标准（ＧＢ／Ｔ２２１４７－２００８）规定的检测限０．０１ｍｇ／ｋｇ，定量限０．０５ｍｇ／ｋｇ。

色谱技术灵敏准确，但是样品处理烦

琐费时，成本高，而且需要专业人员来操作复杂的仪器设备［３］。胶体金免疫层析试验是近年来兴起的一种快速检测技术，具有简单快速、特异灵敏的特点，适合对大量样品的筛检。本研究旨在建立检测莱克多巴胺的胶体金免疫层析试验，其原理是将莱克多巴胺－蛋白质偶联抗原先固定于硝酸纤维素膜的某一区域，检测样品与胶体金标记的莱克多巴胺单克隆抗体从硝酸纤维素膜一端向前移动，莱克多巴胺－蛋白质偶联抗原与样品中的莱克多巴胺竞争性地与胶体金标记的莱克多巴胺单克隆抗体相结合，从而实现特异性免疫检测。1材料和方法1.1试剂和仪器

针对莱克多巴胺的单克隆抗体５Ｃ３由扬州大学农业部畜禽传染病学

重点开放实验室研制［４］，

小鼠腹水采用ＰｒｏｔｅｉｎＡ柱层析提纯，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定；莱克多巴胺、氯金酸（ＨＡｕ－Ｃｌ４·３Ｈ２Ｏ）、羊抗鼠ＩｇＧ、ＰＥＧ２００００、牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、鸡卵清白蛋白（Ｏ－

ＶＡ）、吡啶、Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺、丁二酸酐、１，４－二氧六环、三正丁胺、氯甲酸异丁酯、克伦特罗、沙丁醇胺购自

美国Ｓｉｇｍａ公司；柠檬酸三钠、碳酸钾（Ｋ２ＣＯ３）购自上海化学试剂公司；硝酸纤维素膜、玻璃纤维购自德国Ｓｈｃｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ公司；ＸＹＺ３０００三维喷点平台系统为美国Ｂｉｏｄｏｔ公司产品；紫外分光光度计德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司产品。1.2莱克多巴胺与ＯＶＡ偶联

采用混合酸酐法制备莱克多巴胺－蛋白质偶联抗原［５］。称取莱克多巴胺３４ｍｇ加入到１０ｍｇ丁二酸酐（含２ｍＬ吡啶）中，室温下搅拌过夜，置于通风橱中将吡啶蒸发完全，此反应产物为莱克多巴胺－半丁二酸酐。将其溶于２ｍＬＮ，Ｎ－二甲基甲酰胺和２ｍＬ１，４－二氧六环混合物中，再加２６．２μＬ的三正丁胺，在冰浴中搅拌１０ｍｉｎ，再加氯甲酸异丁酯１５μＬ，室温反应，搅拌１ｈ。将此混合物逐滴加入预冷的蛋白溶液（１００ｍｇＯＶＡ溶解于０．１ＭｐＨ８．５硼酸钠），室温反应过夜，在ＰＢＳ中透析７２ｈ以上。测定莱克多巴胺－ＯＶＡ偶联抗原的浓度和紫外吸收谱的变化。

1.3莱克多巴胺单克隆抗体胶体金标记

检测莱克多巴胺胶体金免疫层析试验的建立

高以明1，4

，吴艳涛2，王寿利2，张小荣2，薛峰3，陆承平4

（1.南京出入境检验检疫局，江苏南京210001；2.扬州大学兽医学院，江苏扬州225009；3.江苏出入境检验检疫局，江苏南京210001；4.南京农业大学，江苏南京210001；）

摘要：采用混合酸酐法制备莱克多巴胺-O V A 偶联抗原，胶体金标记莱克多巴胺单克隆抗体，建立了检测莱克

多巴胺的胶体金免疫层析试验。该试验具有较好的敏感性和特异性，最低可检测10ng/m L 的莱克多巴胺，而与克伦特罗和沙丁醇胺无交叉反应。胶体金免疫层析试验对尿液和饲料样品中莱克多巴胺的最低检测量分别为10ng/m L 和0.01m g/kg 。

关键词：莱克多巴胺；胶体金；残留检测

中图分类号：TS207.53文献标识码：A 文章编号：1005－944X （2009）12－0037－03

Establishment of a colloidal gold immunochromatographic assay for detection of ractopamine

GAO Yi-Ming 1，WU Yan-tao 2，WANG Shou-li 2，ZHANG Xiao-rong 2，XUE feng 3

(1.Nanjing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing 210001,China ；2.College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China;3.Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing 210001,China ；4.Nanjing Agricultural University,Nanjing 210001,China)

Abstract :Ractopamine-OVA conjugated antigen was synthesized by the mixed anhydride method,and the mono-clonal antibody specific to ractopamine was labeled with colloidal gold for establishment of an immunochromato-graphic assay.High sensitivity and specificity of the assay was showed,with detecting limit of 10ng/mL towards ractopamine and no cross-reactivity to clenbuterol and salbutamol.The ractopamine detecting limits of the assay were 10ng/mL and 0.01mg/kg for the pig urine and feed samples respectively.Key words :ractopamine ；colloidal gold ；residue detection 基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目（2006B A K 10B 09）通信作者：吴艳涛

试验研究

－37－

1.3.1胶体金制备

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金［６］

。

称取１ｇ氯金酸溶于１００ｍＬ双蒸水中，配成１％氯金酸溶液。取５ｍＬ１％氯金酸溶液加入一个装有４９５ｍＬ超纯水的圆底烧瓶中，用电热恒温器加热煮沸，加入１％柠檬酸三钠溶液４．５ｍＬ。当溶液的颜色变为透明的红色时，继续回流１０ｍｉｎ后停止加热，冷却至室温，４℃贮存备用。1.3.2单克隆抗体胶体金标记

取１０ｍＬ胶体金溶液，用０．２ＭＫ２ＣＯ３溶液调节胶体金溶液的ｐＨ值为８．２，缓慢加入提纯的莱克多巴胺单克隆抗体５Ｃ３，使单克隆抗体的浓度为０．５μｇ／ｍＬ，继续搅拌３０ｍｉｎ；加入１％ＰＥＧ至终浓度为０．１％，继续搅拌３０ｍｉｎ，加入１０％ＢＳＡ溶液至终浓度为１％，继续搅拌３０ｍｉｎ；４℃、１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清；４℃、５０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，小心吸去上清，沉淀用缓

冲液（２５％蔗糖、

１．０％ＢＳＡ、０．１％ＰＥＧ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＮａＮ３的０．０１ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ）重悬。

1.4胶体金免疫层析试纸制备

将玻璃纤维浸置于７％蔗糖中，２５℃干燥２ｈ。用ＸＹＺ３０００三维点喷平台系统以１５μＬ／ｃｍ将胶体金标记的莱克多巴胺单克隆抗体５Ｃ３点喷在玻

璃纤维上，２５℃干燥２ｈ，

即为胶金垫。用ＸＹＺ３０００三维点喷平台系统以０．７４μＬ／ｃｍ将莱克多巴胺－ＯＶＡ偶联抗原（０．３ｍｇ／ｍＬ）点喷在硝酸纤维素膜上，即为检测线；在离检测线４ｍｍ处喷上羊抗鼠ＩｇＧ（０．５ｍｇ／ｍＬ），即为质控线，２５℃干燥２ｈ。取出一块胶板，将喷有检测线和质控线的硝酸纤维素膜粘贴在中央区；分别将吸水纸和胶金垫粘贴于硝酸纤维素膜的上方和下方，两者之间重叠约２ｍｍ；再在胶金垫的下方粘贴玻璃纤维作为样本垫，组装成胶体金免疫层析试纸（见图３）。1.5胶体金免疫层析试验的敏感性和特异性试验

配制１ｎｇ／ｍＬ、

５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ的莱克多巴胺溶液和１００ｎｇ／ｍＬ的克伦特罗、沙丁醇胺溶液。分别取５０μＬ上述溶液加入胶体金免疫层析试纸的样本垫，１０ｍｉｎ后，当检测线和质控线分别出现红色条带，判定为阴性；当检测线无红色条带，质控线出现红色条带，判定为阳性；当检测线和质控线均未出现红色条带，试纸条无效。1.6模拟样品检测

采集２０份健康猪尿液样品，分

别添加１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ和１００ｎｇ／ｍＬ的莱克多巴胺。各取５０μＬ样品用胶体金免疫层析试验进行检测，确定尿液样品莱克多巴胺最低检测量。

采集２０份生长猪配合饲料，分

别添加０．００５ｍｇ／ｋｇ、

０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ和０．１ｍｇ／ｋｇ的莱克多巴胺。分别取２ｇ猪饲料试样于５０ｍＬ离心管中，加入６ｍＬ提取液（１０ｍＬ甲醇加入９０ｍＬＰＢＳ缓冲液），混匀，加入６ｍｌ碳酸盐缓冲液，再加入８ｍＬ乙酸乙酯，振荡３０ｍｉｎ；以４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，移取４．０ｍｌ上层有机相至另一新试管中，氮吹至干。加入５０μＬ甲醇溶解残余物后，再加入４５０μＬＰＢＳ缓冲液。各取５０μＬ样品用胶体金免疫层析试验进行检测，确定饲料样品莱克多巴胺最低检测量。2结果与讨论

2.1单克隆抗体提纯

经ＰｒｏｔｅｉｎＡ柱层析提纯后的莱克多巴胺单克隆抗体ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳出现５１ＫＤ的抗体重链条带和２６ＫＤ的

抗体轻链条带，不含杂蛋白（图１）

。以纯化的单克隆抗体进行胶体金免疫层析试验可以提高敏感性和特异性。

2.2莱克多巴胺－ＯＶＡ偶联物鉴定

紫外吸收特征曲线显示，莱克多巴胺的最大吸收峰为２９１ｎｍ；ＯＶＡ在２７８ｎｍ和２２３ｎｍ处有两个吸收峰；莱克多巴胺－ＯＶＡ偶联物在３４６ｎｍ处出现了新的吸收峰，并且原有的两个吸收峰也发生了不同程度的偏移，表明莱克多巴胺与ＯＶＡ偶联成功（图２）。2.3胶体金免疫层析试验的敏感性和特异性

胶体金免疫层析试验对１ｎｇ／ｍＬ和５ｎｇ／ｍＬ的莱克多巴胺溶液检测为阴性，对１０ｎｇ／ｍＬ莱克多巴胺的溶液

检测为阳性，１００ｎｇ／ｍＬ的克伦特罗和

沙丁醇胺溶液检测为阴性，表明胶体金免疫层析试验具有良好的敏感性

和特异性（图３）

。胶体金免疫层析试验对１ｎｇ／ｍＬ

和５ｎｇ／ｍＬ的莱克多巴胺溶液检测为阴性，对１０ｎｇ／ｍＬ莱克多巴胺的溶液检测为阳性，１００ｎｇ／ｍＬ的克伦特罗和沙丁醇胺溶液检测为阴性，表明胶体金免疫层析试验具有良好的敏感性和特异性（图３）。

2.4胶体金免疫层析试验的应用

应用胶体金免疫层析试验对模拟样品进行了检测，猪尿液样品中莱克多巴胺的最低检测量为１０ｎｇ／ｍＬ，猪饲料样品的最低检测量为０．０１ｍｇ／ｋｇ。胶体金免疫层析试验对模拟样品检测的敏感性较高，能满足快速筛查的需要。随着我国对盐酸克

仑特罗俗称

“瘦肉精”监管力度的加大，盐酸克伦特罗的使用逐渐减少，莱克多巴胺正作为盐酸克仑特罗的替代品被广泛使用，因此检测莱克多巴胺的胶体金免疫层析试验的建立必将在养殖业、动物源性食品生产经营行业和相关产品的进出境检验检疫工作中具有广阔的应用前景。

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参考文献

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细粒棘球蚴病是由细粒棘球绦

虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｒａｎｕｌｏｓｌｌｓ）的幼虫棘球蚴（ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）寄生于哺乳动物脏器所引起的疾病。其成虫

寄生于犬、

狼、狐等肉食动物的小肠中，幼虫中绦期主要寄生在多种动物和人的脏器中，形成包囊俗称包虫病。家畜被棘球蚴侵袭后，幼畜发育迟缓，成畜生产效能急剧减低，严重时可引起死亡。此病为人畜共患病，严重危害人的身体健康。对于目前民和县家畜棘球蚴的感染情况和危害

程度，笔者于２００８年４月—６月对民和县部分乡镇，羊棘球蚴感染情况进行了调查，现报告如下。1材料与方法

1.1材料被检羊来自民和县川口镇、满坪镇、西沟乡、李二堡镇四个乡镇。

1.2方法按羊的来源分群，在屠宰过程中，随机抽样，主要是以眼观和手摸的方法检查羊肺脏和肝脏的棘

球蚴包囊，登记、计算。2结果

本次调查抽检羊５３０只，感染羊有１８１只，感染率为３４．１５％，包囊感染数为８８１个，平均感染强度为４．８７，其中肺脏感染的羊有１２２只，共检出包囊数３６６个，平均感染强度为３；肝脏感染的羊有１１８只，共检出包囊数５３２个，平均感染强度为４．５１，但不同乡镇抽检羊棘球蚴的感染情况也各有所异，详情见表１。

民和县屠宰羊棘球蚴感染情况调查

张海英

（青海省民和县满坪镇兽医站，青海民和810805

）中图分类号：

S852.7文献标识码：C

文章编号：1005－944X （2009）12－0042－01

3结果分析

3.1通过本次对羊棘球蚴感染情况的调查发现，不同乡镇其感染状况也有所不同。满坪镇属民和县脑山地区，以散养放牧为主，且牧羊犬、猪、牛羊混群，为本病的传播提供了条件，因此本地羊棘球蚴感染较为严重，川口镇地处县城中心，私屠乱宰现象严重，废弃物未经无害化处理，随时扔到小草丛或河水中，于是造成了当地比其它乡镇羊棘球蚴感染程度也较严重；相比而言，西沟乡、李二堡镇两乡基本实施棚圈饲养，再加环境污染较小，其感染程度也较轻。3.2鉴于犬在本病传播过程中有至关重要的作用，建议在今后药物预防过程中，加强对犬的计划性驱虫，严

格检疫，尤其要加强屠宰犬、

牛、羊内脏的检查和管理，对检出的已感染的肺脏和肝脏要妥善处理。对羔羊采取计划性免疫或驱虫等预防措施。3.3本次调查中，被检乡镇和被检羊的数量较少。因此，对于本病在民和县的感染有无地域差异，尚待日后进一步调查落实，这对本病的防制有一定参考价值。4防治措施

4.1棘球蚴病的防治必应采取综合性防治措施，大力宣传有关知识，开展群众性的防治活动，才能收到良好的效果。

4.2严格执行检疫制度，严禁用患病器官喂犬或者任意抛弃，应销毁或深埋或高温修理病脏器。

4.3定期给家养犬驱虫，驱虫药物可先用吡喹酮（０．５ｍｇ／ｋｇ）或丙硫咪唑８－１０ｍｇ／ｋｇ，驱虫时应注意投药前一定要将犬拴起来，事先饥饿１８－２４小时，投药后可给予饮水。通常在投药后１－６小时开始排虫，２４－４８小时内排完。排出的粪便和虫体必需仔细收集深埋或焚烧，以免散布病原。4.4注意个人卫生，养成饭前饭后洗手的习惯，避免玩弄被感染的犬而发生人感染。

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