生物化学设计实验
西北农林科技大学动物科技学院《动物生物化学》实验设计报告
学年：2011—2012学年第一学期
实验设计类型：设计性实验
实验项目名称：血红蛋白的分离纯化实验
专业：水产养殖
年级：2010级
实验设计人：何俊江
指导教师：王建刚
实验设计时间：2011-12-12
血红蛋白的分离纯化实验
1.血红蛋白介绍
血红蛋白（haemoglobin；hemoglobin；ferrohemoglobin；Hb；HHb ）每一血红蛋白分子由一分子的珠蛋白和四分子亚铁血红素组成，珠蛋白约占96%，血红素占4%。α和β都类似于肌红蛋白，只是肽链稍短：α亚基为141aa；β亚基为146aa。α和β亚基隔
着一个空腔彼此相向。
构成
血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。也是红细胞中唯一一种非膜蛋白。人体内的血红蛋白由四个亚基构成，分别为两个α亚基和两个β亚基，在与人体环境相似的电解质溶液中血红蛋白的四个亚基可以自动组装成α2β2的形态。血红蛋白的每个亚基由一条肽链和一个血红素分子构成，肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红素分子抱在里面，这条肽链盘绕成的球形结构又被称为珠蛋白。血红素分子是一个具有卟啉结构的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上的氮原子与一个亚铁离子配位结合，珠蛋白肽链中第8位的一个组氨酸残基中的吲哚侧链上的氮原子从卟啉分子平面的上方与亚铁离子配位结合，当血红蛋白不与氧结合的时候，有一个水分子从卟啉环下方与亚铁离子配位结合，而当血红蛋白载氧的时候，就由氧分子顶替水的位置。
组成结构
人体内的血红蛋白由四个亚基构成，分别为两个α亚基和两个β亚基，在与人体环境相似的电解质溶液中血红蛋白的四个亚基可以自动组装成α2β2的形态。
血红蛋白的每个亚基由一条肽链和一个血红素分子构成，肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红素分子抱在里面，这条肽链盘绕成的球形结构又被称为珠蛋白。血红素分子是一个具有卟啉结构的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上的氮原子与一个亚铁离子配位结合，珠蛋白肽链中第8位的一个组氨酸残基中的吲哚侧链上的氮原子从卟啉分子平面的上方与亚铁离子配位结合，当血红蛋白不与氧结合的时候，有一个水分子从卟啉环下方与亚铁离子配位结合，而当血红蛋白载氧的时候，就由氧分子顶替水的位置。血红蛋白是脊椎动物红血细胞的一种含铁的复合变构蛋白，由血红素和珠蛋白结合而成。其功能是运输氧和二氧化碳，维持血液酸碱平衡。也存在于某些低等动物和豆科植物根瘤中。分子量约67 000，含有四条多肽链，每个多肽链含有一个血红素基团，血红素中铁为二价，与氧结合时，其化学价不变，形成氧合血红蛋白。呈鲜红色，与氧解离后带有淡蓝色。有多种类型：血红蛋白A(HbA)，α2β2，占成人血红蛋白的98%；血红蛋白A2(HbA2)，α2δ2，占成人血红蛋白的2%；血红蛋白F(HbF)，α2γ2，仅存在于胎儿血中；血红蛋白H(HbH)，β4，四个相同β链组成的四聚体血红蛋白；血红蛋白C(HbC)，β链中Lys被Glu取代的血红蛋白；血红蛋白S(HbS)，镰刀状细胞红蛋白；血红蛋白O2(HbO2，HHbO2)，氧合血红蛋白；血红蛋白CO(HbCO)，一氧化碳结合血红蛋白。在没有氧存在的情况下，四个亚基之间相互作用的力很强。氧分子越多与血红蛋白结合力
越强。中心离子铁(II)进一步和蛋白质链中的组氨酸结合，成为五配位。既是配位中心，又是活性中心。血红蛋白中铁(II)能可逆地结合氧分子，取决于氧分压。它能从氧分压较高的肺泡中摄取氧，并随着血液循环把氧气释放到氧分压较低的组织中去，从而起到输氧作用。一氧化碳与血红蛋白的结合较氧强，即使浓度很低也能优先和血红蛋白结合，致使通往组织的氧气流中断，造成一氧化碳中毒（使氧气与血红蛋白的结合能力下降，使人窒
息而死亡）。
工作原理
血红蛋白与氧结合的过程是一个非常神奇的过程。首先一个氧分子与血红蛋白四个亚基中的一个结合，与氧结合之后的珠蛋白结构发生变化，造成整个血红蛋白结构的变化，这种变化使得第二个氧分子相比于第一个氧分子更容易寻找血红蛋白的另一个亚基结合，而它的结合会进一步促进第三个氧分子的结合，以此类推直到构成血红蛋白的四个亚基分别与四个氧分子结合。而在组织内释放氧的过程也是这样，一个氧分子的离去会刺激另一个的离去，直到完全释放所有的氧分子，这种有趣的现象称为协同效应。
协同效应
血红素分子结构由于协同效应，血红蛋白与氧气的结合曲线呈S形，在特定范围内随着环境中氧含量的变化，血红蛋白与氧分子的结合率有一个剧烈变化的过程，生物体内组织中的氧浓度和肺组织中的氧浓度恰好位于这一突变的两侧，因而在肺组织，血红蛋白可以充分地与氧结合，在体内其他部分则可以充分地释放所携带的氧分子。可是当环境中的氧气含量很高或者很低的时候，血红蛋白的氧结合曲线非常平缓，氧气浓度巨大的波动也很难使血红蛋白与氧气的结合率发生显著变化，因此健康人即使呼吸纯氧，血液运载氧的能力也不会有显著的提高，从这个角度讲，对健康人而言吸氧的所产生心理暗示要远远大于其生理作用。除了运载氧，血红蛋白还可以与二氧化碳、一氧化碳、氰离子结合，结合的方式也与氧完全一样，所不同的只是结合的牢固程度，一氧化碳、氰离子一旦和血红蛋白结合就很难离开，这就是煤气中毒和氰化物中毒的原理，遇到这种情况可以使用其他与这些物质结合能力更强的物质来解毒，比如一氧化碳中毒可以用静脉注射亚甲基蓝的
方法来救治。
缀合蛋白质
血红素和珠蛋白构成的缀合蛋白质，是脊椎动物血液的有色成分。其主要功能是运输氧，也有维持血液酸碱平衡的作用。血红素是含2价铁的卟啉化合物。铁有6个配位键，其中4个与血红素的环状结构相连，并与之处在同一平面中。另2个配位键中的一个与蛋白质部分相连，还有1个则连接氧。珠蛋白含有4个亚基（α2β2），每个亚基连接1个血红素辅基。人和许多动物血红蛋白α链（含141个氨基酸残基）和β链（含146个氨基酸残基）的氨基酸序列已确定，也已用X射线衍射结构分析测定其四级结构。血红蛋白基因的点突变导致异常血红蛋白的产生。已发现数百种异常血红蛋白，其中只有一小部分引起疾病发生，最常见也最了解的疾病是镰刀形红细胞贫血病。在血红蛋白中，血红素辅基的Fe2+能可逆载氧，载氧时Fe2+的状态为低自旋，半径较小，能嵌入卟啉环的平面内，呈六配位。而脱氧后，Fe2+呈高自旋态，半径较大，不能嵌入卟啉环的平面中，高出平面70-80pm，Fe-N
距离220pm，为五配位。
生理意义
血红蛋白的四级结构对其运氧功能有重要意义。它能从肺携带氧经由动脉血运送给组织，又能携带组织代谢所产生的二氧化碳经静脉血送到肺再排出体外。现知它的这种功能与其亚基结构的两种状态有关，在缺氧的地方（如静脉血中）亚基处于钳制状态，使氧不能与血红素结合，所以在需氧组织里可以快速地脱下氧；在含氧丰富的肺里，亚基结构呈松弛状态，使氧极易与血红素结合，从而迅速地将氧运载走。亚基结构的转换使呼吸功能高效进行。氰化高铁法：手指血20微升自动血细胞分析仪：静脉血1～2毫升，EDTAK2抗凝生理情况下，人体每天均约有1/120红细胞衰亡，同时，又有1/120的红细胞产生，使红细胞的生成与衰亡保持动态平衡。多种原因可使这种平衡遭到破坏，导致红细胞和血红蛋白数量减少或增多。
正常参值
成年男性：120～160g/L 成年女性：110～150g/L 新生儿：170～200g/L 儿童：110～160g/L
异常结果
红细胞和血红蛋白增多
1．相对性增多：由于某些原因使血浆中水分丢失，血液浓缩，使红细胞和血红蛋白含量相对增多。如连续剧烈呕吐、大面积烧伤、严重腹泻、大量出汗等；另见于慢性肾上腺皮质功能减退、尿崩症、甲状腺功能亢进等。2．绝对性增多：由各种原因引起血液中红细胞和血红蛋白绝对值增多，多与机体循环及组织缺氧、血中促红细胞生成素水平升高、骨髓加速释放红细胞有关。（1）生理性增多：见于高原居民、胎儿和新生儿、剧烈劳动、恐惧、冷水浴等。（2）病理性增多：由于促红细胞生成素代偿性增多所致，见于严重的先天性及后天性心肺疾病和血管畸形，如法洛四联症、紫绀型先天性心脏病、阻塞性肺气肿、肺源性心脏病、肺动-静脉瘘以及携氧能力低的异常血红蛋白病等。在另一些情况下，病人并无组织缺氧，促红细胞生成素的增多并非机体需要，红细胞和血红蛋白增多亦无代偿意义，见于某些肿瘤或肾脏疾病，如肾癌、肝细胞癌、肾胚胎瘤以及肾盂积水、多囊肾等。
红细胞和血红蛋白减少
一般成年男性血红蛋白<120g/L,成年女性血红蛋白<110g/L为贫血。根据血红蛋白减低的程度贫血可分为四级。轻度：血红蛋白>90g/L、中度：血红蛋白90～60g/L、重度：血红蛋白60～30g/L、极度：血红蛋白<30g/L。1．生理性减少：3个月的婴儿至15岁以前的儿童，因生长发育迅速而致造血原料相对不足，红细胞和血红蛋白可较正常人低10%～20%。妊娠中、后期由于孕妇血容量增加使血液稀释，老年人由于骨髓造血功能逐渐减低，均可导致红细胞和血红蛋白含量减少。2．病理性减少：（1）红细胞生成减少所致的贫血：1）骨髓造血功能衰竭：再生障碍性贫血、骨髓纤维化等伴发的贫血。2）因造血物质缺乏或利用障碍引起的贫血：如缺铁性贫血、铁粒幼细胞性贫血、叶酸及维生素B12缺乏所致的巨幼细胞性贫血。（2）因红细胞膜、酶遗传
性的缺陷或外来因素造成红细胞破坏过多导致的贫血，如遗传性球形红细胞增多症、地中海性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、异常血红蛋白病、免疫性溶血性贫血、心脏体外循环的大手术及一些化学、生物因素等引起的溶血性贫血。（3）失血：急性失血或消化道溃疡、钩虫病等慢性失血所致的贫血。
2.实验
试验原理
1．1 初步获取血红蛋白的原理和方法（样品的处理和粗分离）
实验步骤实验目的实验原理操作方法结果判断
①洗涤红细胞获取较纯净
的红细胞
通过离心将密度不同
的物质分离
低速离心，去除上清
液，反复加生理盐水
并离心
直到上清液未
呈现黄色为止
②释放血红蛋白破裂红细胞，
释放血红蛋
白
低渗溶液中红细胞破
裂；甲苯溶解膜脂，
加速细胞破裂（相似
相溶原理）
加蒸馏水，再加甲
苯，磁力搅拌器充分
搅拌
无明显现象
③分离血红蛋白溶液初步得到血
红蛋白溶液
通过离心将密度不同
的物质分离
离心（较高速）试管溶液分为4
层
④透析去掉液体中
的小分子物
质
小分子物质容易
透出透析袋
透析（12小时）透析袋中物质
的颜色更红
1．2 分离纯化蛋白质的原理与方法──凝胶色谱法（分子筛效应）
凝胶是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质直径小于凝胶网孔，由于静电吸附和扩散作用容易进入凝胶内部的通道，可以自由地进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动的过程中，它们从凝胶颗粒的网孔扩散到凝胶颗粒间的孔隙，再进入另一凝胶颗粒的网孔，如此不断地进出，使流程增长，而最后流出层析柱。而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒的网孔，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着洗脱液流动，流程较短，因此首先流出层析柱。分子量介于二者之间的物质，虽然能够进入凝胶网孔，但比小分子难，因此进入凝胶网孔的几率比小分子小，向下移动的速度比小分子快，而比大分子慢。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
需要注意的是，有部分小分子蛋白质未进入凝胶内部，而在外部移动，因此，如果需要得到纯度更高的蛋白质分子，可将色谱柱中的凝胶溶液进行平衡后进行再次冼脱和分离。
1．3 鉴定蛋白质纯度的原理与方法──电泳
蛋白质分子的基本单位是氨基酸，氨基酸的一些基团在一定的pH下会发生水解或电离从而带有电荷。但总的来说蛋白质分子一般带有负电。在电场的作用下，带电的蛋白质分子会向着电泳槽中的正极方向移动。由于样品中各种蛋白质分子净电荷的量的差异以及蛋白质分子本身的大小等因素，使蛋白质分子产生不同的迁移速率，从而将样品中各种蛋白质分子分离开。
由于蛋白质分子带电电荷比较复杂，净电荷总量与蛋白质分子的质量不成正比，而蛋白质分子的质量又是衡定的，电泳时在带电量和分子质量两种因素的作用下会产生迁移速率的复杂化，不能正确地将分子质量不同的蛋白质分子分离开，因此，实际操作中，一般会将蛋白质分子与SDS（十二烷基硫酸钠）发生反应形成蛋白质—SDS复合物，由于SDS所带负电荷的量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因此掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使蛋白质的迁移率完全取决于蛋白质分子质量的大小。在电场条件下，分子量大的蛋白质迁移率慢，离前沿较远，而分子量小的蛋白质迁移快，离前沿较近。这样，不同分子量大小的蛋白质得到了分离。如果蛋白质的纯度高，迁移率一致，就会形成前沿整齐、清晰的条带。
2.实验前准备
2．1 几种重要实验试剂的配制及注意事项
2．1．1 磷酸缓冲液（20mmol/L）的配制及注意事项
配制步骤配制的溶液配制方法注意事项
①0．2 mol/L的Na
2HPO
4
溶液将71．64 g 的Na
2
HPO
4
·12H
2
0充分溶
解于1000mL的蒸馏水中
在混合两种溶
液时，注意用
酸度计或pH试
纸检测，并调
节溶液的pH在
7．0左右
②0．2mol/L的 NaH
2PO
4
溶液将 31．21 g 的NaH
2
PO
4
·2H
2
0充分溶解于1000mL的蒸馏水中充分溶解
③pH约为7．0的
20mmol/L磷酸缓冲液取61 mL步骤①中配制的Na
2
HPO
4
溶液
与39 mL步骤②中配制的NaH
2
PO
4
溶液混合
2．1．2 丙烯酰胺和N, N-甲叉双丙烯酰胺的配制及注意事项
将29 g丙烯酰胺和1 g N, N-甲叉双丙烯酰胺溶于总体积为70 mL的水中，搅拌过夜使之充分溶解。注意事项：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，因此，操作时需要戴上手套和防毒面具，而且在通风橱内或通风处进行。价格较低的这两种药物中含有一些金属离子，为除去这些金属离子，可以在丙烯酰胺溶液中加入大约0．2倍体积的单床混合树脂，搅拌放置一夜后，再用Whatman 1号滤纸过滤就可以纯化。储存期间，由于光或碱的催化作用，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸，因
此，应将配制好的溶液置于棕色瓶中，置于4 ℃保存，并且使用前应检查该溶液的pH，以确保pH不超过7．0。
2．1．3 SDS的配制及注意事项
将SDS用去离子水配制成10%的贮存液，于室温保存。注意事项：市售的SDS化学纯度不够，需要重结晶后使用。重结晶方法如下：称取20 g SDS,放入500 mL圆底烧瓶中，加半勺活性炭及300 mL无水乙醇，搅拌，摇匀。烧瓶上接一个小冷凝管。在水浴上加热至乙醇微沸，回流约10min，用热过滤漏斗趁热过滤。滤液应透明无色。滤液冷却至室温后，移至-20 ℃过夜。第二天，通过预冷的布氏漏斗抽滤，用少量-20 ℃无水乙醇洗沉淀3次，尽量抽干，将结晶置真空干燥器中干燥或40 ℃烘箱中烘干。
2．2 凝胶色谱柱的制作和装填
2．2．1凝胶色谱柱的制作
取长100cm，内直径1．6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，导致蛋白质分离不彻底。
2．2．2凝胶色谱柱的装填
计算并称取一定量的交联葡聚糖凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。将色谱柱装置固定在支架上，将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，凝胶沉集后，将溶剂放出至胶面不再下降，并且通过2～3倍柱床体积的溶剂（20mmol/L的磷酸缓冲液，pH 7．0）使柱床稳定。装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300 mL的20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7．0）充分洗涤平衡12h。注意事项：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；装填凝胶柱时不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动，从而影响生物大分子物质的分离效果；注意不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
3.实验操作步骤及注意事项
本课题的主要目的是运用凝胶色谱法对蛋白质进行分离纯化，以下是实验操作流程。
样品的处理：取家兔一只，为保证取血量，取其颈动脉血，按1:1加入抗凝剂肝素（1250U/ mL）或适宜浓度的柠檬酸钠溶液（将6ｇ柠檬酸钠溶于100 mL的生理盐水中），若要过夜，温度须控制在4 ℃左右。在样品处理的流程中，第一步用到低速离心，而第三步用到高速离心，这主要是因为血液中除有红细胞外，还有其他细胞及大量的物质，红细胞与这些物质之间的密度存在较大的差异，用低速离心就能将他们分离开；而“分离血红蛋白溶液”步骤中，溶液的主要成份的密度相对要接近些，因此需要用较高速的离心，才能将这些物质初步分离。
搅拌好的混合液离心后明显分为4层（如右图），由上至下依次是甲苯层、脂溶性物质的沉淀层、血红蛋白的水溶液、红细胞破碎物沉淀。取其上清液，用滤纸过滤除去脂类，再使滤液在分液漏斗中静置5min，出现分层，分离出下层的血红蛋白溶液。
粗分离：将血红蛋白溶液装入规格为7000D的透析袋，按1:300的比例放入20mmol/L 的磷酸盐缓冲液（pH为7．0），透析12h。透析的目的一是为了除去小分子蛋白质，二是使血红蛋白处于缓冲液环境中，便于后续的磷酸缓冲液在凝胶柱中进行洗脱。
纯化：可采用柱型为Sephadex G75，柱体积为500 mL的色谱柱；加样量为10 mL（约
含蛋白200 m g）；用20mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH为7．0）进行洗脱，洗脱速度可控制为0．5 mL /min，即20 min /管。此时可用A280的紫外线进行检测，如果测得的数值很高，说明蛋白含量过高，此时需要进行稀释。下图是将每管取0．5 mL稀释10倍后，用紫外线测量的结果（如下图）。
由图中数值可知，33-38管对应的数值为血红蛋白的吸收值，选择此时的试管进行蛋白质纯度的鉴定是比较合适的。
纯度鉴定：经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，以下是实验操作流程。
脱色的目的是脱去背景颜色以体现出蛋白条带。一般来说，条带分明，目的条带清晰，无扩散，前沿比较直，说明实验结果比较好，样品比较纯，下面为兔血实验的电泳结果图。
4.体会
本课题的实验操作相对复杂，影响实验效果的关键环节之一是凝胶色谱柱的制作和装填，对实验者的操作有很高的要求，建议有条件的学校直接购买商品色谱柱。由于甲苯是剧毒试剂,不太适合在中学实验中使用，因此，我们尝试在血红蛋白的释放时，只使用蒸馏水使细胞涨破,也获得了很好的实验效果。电泳过程中制胶、染色和脱色耗时较多，建议由教师完成，其他环节由师生共同完成。此外，本课题也可选用鸡血或猪血作为实验材料。
主要参考文献
1 朱正威,孙万儒,赵占良主编．选修1生物技术实践．北京：人民教育出版社，2007，7：64-70．
2 王镜岩,朱圣庚,徐长法主编．生物化学．北京：高等教育出版社，2005，4：298-312．
3.王秀莉张晓萍赵世萍《教学仪器与实验》2008 第10期
4.戴亚郭家明肖怡宁王茜刘启斌《烟草科技》2001 第1期
5.吴成军赵伟涛《生物学通报》2009 第4期
6.彭倩张坤生任云霞《食品研究与开发》2010 第3期
生物化学设计性实验的开设与探索
生物化学设计性实验的开设与探索（作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【关键词】生物化学设计性实验开设探索 现代医学教育的本质和目的是发展学生的主体性，学生不仅是教育的对象，而且是学习和发展的主体，高等教育过程是发掘和激发学生主体性，培养具有创新精神的高素质人才的过程。实验教学是学生吸收、理解并运用理论知识, 接受科学思维和创新意识培养的平台[1-2]。生物化学是高等医学基础教育的主干课程，以往的生物化学实验教学多以综合性、验证性实验为主。在实验中学生们被动地按照已经制定好的实验步骤和方法去操作，没有可以自我发挥的机会，很容易导致学生学习积极性不高，同时也束缚了学生自由思维的空间，不利于创新精神的培养[3]。为了进一步提高我院生物化学实验课程的教学水平，生物化学与分子生物学教研室积极进行教育教学改革，为2006级临床、麻醉、法医等专业的本科生开出了12学时的设计性实验，同时对教学效果进行了反馈和评价，现总结如下。 1 教学实施方案 1.1 设计性实验内容与要求要求学生在查阅资料的基础上，按
照给定的实验条件，应用所学知识自行设计实验方案进行血浆蛋白质的分离、定量、纯化与鉴定。 1.2 设计性实验实施讲座授课教师在开课前3～4周为学生讲授设计性实验的设计方法、实施原则、选题方案和实施步骤。然后将学生进行分组(4～5人组成1个小组)，给出设计性实验的题目，要求学生在查阅相关资料的基础上,应用所学知识拟定初步的实验设计方案并于开课前2周交给授课教师。设计方案内容包括实验题目、实验目的、实验原理、仪器设备、实验方法和预期结果。 1.3 初步设计方案的审核与论证授课教师收集、整理学生初步设计的方案，然后组织学生进行讨论，每组派代表分别介绍设计方案，由学生和老师共同讨论设计方案的科学性、合理性和可行性，鼓励学生大胆使用新方法,提出新观点和新思路,充分调动学生的积极性、主动性和创造性。讨论后提出改进意见，各组同学按照修改意见重新整理和完善设计方案。 1.4 实验的实施实验室根据学生的设计方案，准备相应的仪器设备和试剂，学生根据自己的设计方案开始实验。实验过程中，主要由学生操作，教师的任务是对学生在查阅资料、方案设计等各环节给予方法上的指导，为学生讲解注意事项和操作要点。即使学生的设计中有明显的错误,只要没有安全问题,就应该允许学生进行尝试,让学生通过反复实验发现和解决问题,进而不断完善实验方案,实现预期目标。如果遇到各种原因导致实验延迟或失败，学生均可利用开放实验室的机会申请重新进行实验。
基础生物化学实验.
生物化学实验 实验基本原理 1 有效数字计算（结合电子天平的应用等） 加减法： 进行数字加减时，最后结果所保留的小数点后的位数应与参与运算的各数中小数点后位数最少者相同，其尾数“四舍五入”。如：0.124+1.2345+12.34=13.6979，应取13.70。 乘除法： 进行数字乘除时，最后结果的有效数字应与参与运算的各数中有效数字位数最少者为准，而与小数点的位数无关，其尾数“四舍五入”。如：1.23×0.12=0.1476,应取0.15。 2 误差分析 误差为实验分析的测定值与真实值之间的差值。误差越小，测定值越准确，即准确度越高。误差可用绝对误差和相对误差表示。 绝对误差= 测定值- 真实值 相对误差= 绝对误差÷真实值×100% 一般用相对误差表示结果的准确度，但因真实值是并不知道的，因此实际工作中无法求出分析的准确度，只得用精确度来评价分析的结果。 3 偏差分析（结合“可溶性蛋白或赖氨酸实验”要求掌握） 精确度表示在相同条件下，进行多次实验的测定值相近的程度。一般用偏差来衡量分析结果的精确度。偏差也有绝对偏差和相对偏差两种表示方法。 绝对偏差= 单次测定值- 算术平均值（不计正负号） 相对偏差= 绝对偏差÷算术平均值×100%
例如：分析某一材料糖含量，共重复测定5次，其结果分别为：16.1%，15.8%，16.3%，16.2%，15.6%，用来表示精确度的偏差可计算如下： 分析结果算术平均值个别测定的绝对偏差（不计正负） 16.1% 0.1% 15.8% 0.2% 16.3% 16.0% 0.3% 16.2% 0.2% 15.6% 0.4% 平均绝对偏差=（0.1%+0.2%+0.3%+0.2%+0.4%）÷5 = 0.2% 平均相对偏差= 0.2÷16.0×100% = 1.25% 在实验中，有时只做两次平行测定，这时就应用下式表达结果的精确度： 两次分析结果的差值÷平均值×100% 4 实验结果的表述：实验结果可用列表法（“影响酶作用的因素”常用）和作图法（综合实验用）表示。 第1章分光光度技术 分光光度技术是光学（光谱）分析技术的一种，它是利用物质的特征吸收光谱来对不同物质进行定性和定量分析的一项技术。我们将重点介绍紫外光-可见光分光光度法。 一、紫外光-可见光分光光度法的基本原理 1、讨论的波长范围：200～400nm的紫外光区和400～760nm的可见光区。 人肉眼可见的光线称可见光，波长范围在400～760nm；
生物化学实验室
参考实验室主要研究项目： 1.国际上有参考测量方法的项目，建立参考方法。 2.根据项目的不同特点，建立不同项目的溯源途径。 3.主要参考测量系统的建立，包括日立、奥林帕斯、贝克曼、东芝和迈瑞仪器系统等。 准备资料 1.项目概况描述及项目性质（新建还是改建项目？）公用工程外围 供应条件（水电汽冷冻空压氮气等）、水文地质等情况。 项目新建，水电汽冷冻空压氮气需咨询园区物业。 2.用途等级要求，项目用途做研发还是质检？使用的原辅料，有生 物实验需确定生物安全防护等级（P1/P2/P3/P4?） 项目用途为研发，生物实验室生物安全防护等级为P1 （P1：1）实验室具备跟一般微生物学实验室相同等级的设备.若在此级实验室内同时进行非基因重组的实验时,需明确划分实验区域,小心进行操作. 2）进行实验时,宜关闭实验室的门窗. 3）每日实验结束时需灭菌实验台,如实验中发生污染,需立即加以灭菌. 4）实验所产生之所有生物材料废弃物,需尽快灭菌后再依院方「感染性废弃物管理」相关办法丢弃.被污染的器具需先经灭菌后,再清洗使用或丢弃. 5）不得用口做吸量操作. 6）实验室内禁止饮食,吸烟及保存食物. 7）操作重组体之后,或离开实验室之前要洗手. 8）在所有操作中,应尽量避免产生气雾. 9）要从实验室搬离被污染物品时,必需将其放入坚固且不漏的容器,在实验室内密封后才可运出. 10）防除实验室的非实验用生物,如昆虫及鼠类等. 分为P1、P2、P3和P4四个生物安全等级，其中P3实验室是生物安全防护三级实验室，适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物或其毒素；P4实验室是生物安全防护四级实验室，适用于对人体具有高度的危险性，通过汽溶胶途径传播或传播途径不明、目前尚无有效疫苗或治疗方法的致病微生物或其毒素标准规范要求，根据实验室用途确认参考的标准规范，中国GMP，还是欧盟GMP还是美国FDA？
食品生物化学实验
食品生物化学实验要求 1.学生做实验前必须写好实验预习报告，做好实验预习，无实验预习报告者不 许进入实验室。每大组实验人数28人，4人一小组。 2.实验试剂的配制，现场由教师指导，学生操作完成。学生在试剂配制过程中， 掌握试剂配置的基本步骤，基本方法和注意事项。 3.实验室所有设备都必须按说明书使用，器皿要小心使用，按规范要求操作， 如有损坏，照价赔偿。 4.卫生要求：每次试验完毕小组成员务必将本试验台及地面收拾整洁，器皿摆 放整齐有序，如哪组成员发现没有搞好自己组的环境卫生，这次试验的所有组员的实验报告都会扣分。 一、10食品科学食品生物化学实验项目表 1. 淀粉的显色、水解和老化（4学时） 2. 蛋白质的功能性质（4学时） 3. 牛奶中酪蛋白等电点测定和氨基酸的分离鉴定（4学时） 4. 或果胶的提取（4学时） 5. 酶的性质实验（4学时） 实验总课时：16学时
二、食品生物化学实验指导书 实验一淀粉的显色、水解和老化 一、实验目的和要求 1、了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。 2、掌握淀粉水解的条件和产物的实验方法。 3、淀粉的老化原理和方法 二、实验原理 1、淀粉与碘的反应直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度，它还可以用来测定水果果实（如苹果等）的淀粉含量。 近年来用先进的分析技术（如X射线、红外光谱等）研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。 在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟6个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。 淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200～980或相对分子质量范围是32 000～160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20～28，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色。 表 2-1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色 淀粉跟碘生成的包合物在pH=4时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。 2、淀粉的水解淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物。虽属糖类，但本身没有甜味，是一种白色粉末，不溶于冷水。在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。淀粉进入人体后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在肠液中麦芽糖酶的催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（C6H12O5）m→(C6H10O5)n→C12H22O11→C6H12O6 淀粉糊精麦芽糖葡萄糖
SICOLAB生化实验室建设布局
生化实验室项目新建、改建的设计规划，不单是对于仪器、设备上的选购，还要综合考虑实验室整体规划的合理性。 实验室整体建设规划在电路、供水、通风、气路、废气处理及排污、环保、安全等方面考虑。 介绍实验室基础建设一般常用项目有： (1)实验台柜包括中央实验台、实验台、边台、仪器台、天平台、药品柜、毒品柜、玻璃器皿柜等。 (2)空调通风设施。在新的化验中心，所有的建筑面积均有空调。通风系统包括通风柜(毒气柜)、排风罩(固定式)、活动式排风罩、排气扇等。 (3)用水设施包括化验盆、洗涤池、化验水龙头等。 (4)安全设施包括消防喷水灭火系统，惰性气体灭火系统，安全柜，紧急事故淋洗器、洗眼器等。 (5)供气设施包括供气站、供气板、用气板及其管路系统等。 SICOLAB生化实验室设计布局： 1、实验室内功能区设置分明，实验室内布局合理，操作安全、方便并能避免污染，能够满足工作需要，保证检验结果不受干扰。如理化实验室与理化仪器室靠近，细菌室与其所使用的仪器设备靠近，设置独立的蒸馏水室(避免所制作的蒸馏水受污染)、更衣室、储藏室(补充：储藏室用于存放少量近期不用的非过期药品。要具备防明火、防潮、防高温、防日光直射等功能。储藏室应朝北、干燥、通风良好，门窗应坚固，窗为高窗，门窗有设遮阳板。门应朝外开。)。 2、实验室所有实验台、边台、器皿柜、药品柜、通风柜由专业的实验室规划设计研究所外加工、成套制作、现场安装，符合各种技术指标的要求，更加规范，使用更安全、方便，给人感觉更加整洁、美观。 3、实验室应设立单独的给水、排水系统，避免受到污染或者污染周围环境。实验室的排气尽可能集中后向高空或者向下水道(适当处理后)排放，减少对周围环境的污染。 4、实验室的环境、使用的装修材料应符合环保和实验室的环境要求，确保不影响人体健康和实验结果。SICOLAB生化实验室之光谱分析室设计 主要是根据物质对光具有吸收、散射的物理特征及发射光的物理特性，在分析化学领域建立化学分析。主要的仪器是原子发射光谱仪、原子吸收光谱仪，分光光度计、原子荧光光谱仪、荧光分光光度计、X射线荧光仪、红外光光谱仪、电感耦合等离子体（LCP）光谱仪、拉曼光谱仪等。实验室应尽量远离化学实验室、以防止酸、碱、腐蚀性气体等对仪器的损害，远离辐射源；室内应有防尘、防震、防潮等措施。仪器台与窗、墙之间要有一定距离，便于对仪器的调试和检修。应设计局部排风。使用原子吸收罩排风较为适宜。 以上实验室，根据实际需要可设置样品处理室，一般有洗涤台、实验台、通风柜等设备，同化学实验室类似。 洁净实验室主要是通过人为的手段，应用洁净技术实现控制室内空气中尘埃、含菌浓度、温湿度与压力、以达到所要求的洁净度、温湿度和气流速度等环境参数。空气洁净度是指洁净空气环境中空气含尘量程度，空气洁净度的级别以含尘浓度划分。洁净度是指每升空气中所含粒径≥0.5um的尘粒的总颗粒。我国空气洁净等级标准分为：100级、1000级、10000级、100000级。国际标准则划分为：1级、2级、3级、4级、5级。
生物化学实验
实验一 纸层析法分离鉴定氨基酸 一、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。 物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用R f 值(比移)来表示 的： …a b R f = =原点到溶剂前沿的距离离原点到层析点中心的距 在一定的条件下某种物质的只R f 值是常数。R f 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、器材 1.层析缸 2.毛细管 3.喷雾器 4.培养皿 5.层析滤纸(新华一号) 四、试剂 1、扩展剂 650mL 4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL 正丁醇和5mL 冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL 水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL 置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。 2、氨基酸溶液 0.5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为0.5％)。各5mL 3、显色剂 50～100mL 0. 1％水合茚三酮正丁醇溶液。 五、操作 1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。 2.取层析滤纸(长22cm 、宽14 cm)一张。在纸的—端距边缘2～3cm 处用用铅 笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm 作一记号如图。 3.点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3 mm 。 4.扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL 扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线 1cm)。待溶剂上升15—20 cm 时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 5.显色 用喷雾器均匀喷上O.1％ 茚三酮 正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。 6.计算各种氨基酸的只R f 值。 思考题 1、何谓纸层析法? 2、何谓片R f 值?影响R f 值的主要因素是什么? 3、怎样制备扩展剂? 层析点 原点
生物化学实验报告
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生化设计实验
蛋白质与核酸的定性与定量 一.实验目的 1.学习和掌握纯化蛋白质的原理和方法、蛋白质等电点的测量原理 和方法。 2.掌握使用双缩脲法对蛋白质的定性测定。 3.学会利用定糖法对核酸的定性与定量测定 二.实验原理 1.区分蛋白质和核酸：蛋白质在碱性溶液中可与Cu2+紫红色反应。这是蛋白质分子中肽键的反应，肽键越多反应颜色越深。核酸由单核苷酸所组成，无此反应。另外，核酸组成成分嘌呤及嘧啶碱基具有强烈的紫外吸收，所以核酸也具有强烈的紫外吸收，最大吸收值在260mn，利用这一性质亦可鉴别核酸样品和蛋白质样品。 2.蛋白质的纯化方法： （1）粗分离：中性盐对蛋白质胶体的稳定性有显著的影响。一定浓度的中性盐可破坏蛋白质胶体的稳定因素而使蛋白质盐析沉淀。盐析沉淀的蛋白质一般保持着天然构象而不变性。 （2）蛋白质类别及分子量的确定：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定样液中含有几种蛋白质，每种蛋白质的分子量大小。由于SDS 是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小
成正比变化。 （3）蛋白质的精制：根据上一步骤得到的蛋白质的分子量，采用葡聚糖凝胶层析的方法。聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。 3.蛋白质的含量测定以及等电点、比旋度等性质 （1）蛋白质的含量测定：采用Folin-酚试剂法。蛋白质中有带酚基的酪氨酸，故能与试剂乙反应而呈蓝色，蓝色深浅与蛋白质溶度相关，在一定溶度范围内呈线性关系，因此可做比色测定。 （2）等电点与比旋度。蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的PH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。蛋白质的比旋度可用旋光仪。
生物化学综合实验报告
存车处 生物化学综合实验实验报告 项目名称：核酸的分离纯化及性质研究 指导教师：商亚芳 班级：食品科学与工程类13-04班 姓名：俞海清 学号：2013218687 日期：2015/07/02-07/03 小组成员：俞海清曾斯棋
核酸的分离纯化及其性质研究 摘要：提取植物组织DNA和动物肝脏的DNA，先要破碎细胞，然后通过离心获得沉淀。分理 出脱氧核糖蛋白（DNP）。利用阴离子除垢剂（SDS），将蛋白质和DNA 分离开来，用氯仿-异戊醇去蛋白质蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，之后用乙醇将DNA沉淀出来，得到粗蛋白质。为了获得高纯度的DNA，采用适量的RNase来降解残留的RNA，再利用乙醇来 提取DNA，重复多次来获得较纯的DNA。再利用DNA紫外吸收特性测定DNA的纯度时，发现提取出来的DNA纯度比较高。利用二苯胺法测定DNA的含量，发现DNA含量偏低。DNA产率很低。最后采用琼脂糖凝胶电泳来分离DNA，测定DNA片段的分子质量。结果实验成功的在紫外线下观察出了标准DNA条带以及待测样品条带。 Abstract: In order to extract the plant’s DNA and the pluck’s DNA.we should break cells,then separate the https://www.wendangku.net/doc/fc5307709.html,e the SDS to break protein and DNA.Phenol – chloroforM – isoaMyl alcohol Mixture can make protein denaturation .place it on the centrifugal machine to remove the protein .Then,take let the DNA dip into ethylalcohol.it can separate the DNA . In order to obtain high purity DNA, use the right amount of RNase to degradate residual RNA, recycled ethanol to extract DNA over and over https://www.wendangku.net/doc/fc5307709.html,ing ultraviolet absorption characteristics determine th e purity o f DNA .we found that the purity of DNA is high.Diphenylamine is used to check the content of DNA, the discovery of DNA’s content is low. DNA’s yield is very low.Finally, agarose gel electrophores is used to separate DNA and check molecular weight of DNA fragments.Under the uv light,we found standard DNA bandin g and the banding whic h belong to pending text sample successfully. 关键词：DNA 分离二苯胺乙醇琼脂糖凝胶电泳氯仿-异戊烷 Key words：DNA separate diphenylamine ethylalcohol agarose gel electrophores Phenol – chloroforM – isoaMyl alcohol Mixture 前言： 核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。核酸是由许多核苷酸 聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞 微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。无论是进行核酸结构，还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。在核 酸分离提取中最重要的是要防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸的 磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 实验原理： 1.植物组织中核酸的分离与纯化原理：DNA存在于细胞核中，天然状态的DNA 大多数是以脱氧核糖核蛋白的形式存在，从细胞中提取DNA时，一般先获得脱氧核糖
生物化学设计性实验
生物化学设计性实验 组员: 牛血清白蛋白的提取与鉴定 【实验目的】掌握牛血清白蛋白的提取与鉴定方法【实验原理】牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分(38／100ml)，分子量68KD。应用相同浓度硫酸铵盐析法降血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。再利用电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的粘度等有关，对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。 【实验步骤】
1.盐析取小牛血清0.5毫升+PBS0.5毫升+饱和硫 酸铵2.3毫升，充分混匀，静止20分钟，2500转／分离心10分钟。 2.透析取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上 清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），放入装有自来水的小烧杯中透析，要不断搅拌，每隔2分钟换一次水，共换15次。用纳氏试剂检查带外液体的铵根离子，观察颜色变化，直至袋内盐分透析完毕。将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。 3.电泳 1）点样 取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿 中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用 干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面 距一端1.5cm处作点样线，将牛血清样品与待测 的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄 膜的点样线处不同位置点样。 2）电泳 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽 面向下，点样端置于阴极，平衡5分钟，开电源 160伏60分钟，关闭电源后用镊子将膜条取出。
3）染色 将膜条直接浸于盛有氨基黑10B的染料中，染2 分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液1、 2、3中各漂洗5分钟，直至背景漂洗干净为止， 用滤纸吸干薄膜。 4.鉴定比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的电 泳结果，看位置是否是一致。 【实验仪器和试剂】 仪器：离心管、离心机、试管、玻璃纸、烧杯、比色瓷盘、滴管、玻璃棒、电泳仪、醋酸纤维素薄膜、分光光度计。 试剂：牛血清待测液、牛血清样品、PBS（磷酸盐缓冲溶液，用0.01mol／L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9％Nacl溶液、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑10B染色液、漂洗液、0.4N氢氧化钠溶液。 5.预测结果 位置一致，试验成功。若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的黑带区域，则说明提取不够纯。
生物化学实验指导
生物化学实验须知 一、实验目的 1．培养学生严谨的科学作风，独立工作能力及科学的思维方法。 2．学习基础的生物化学实验方法，为今后的学习与研究准备更好的条件。 3．培养学生爱护国家财物、爱护集体、团结互助的优良道德品质。 4．培养学生的书面及口头表达能力。 二、实验的总要求 1．按教研室予先公布的实验进度表，了解各次实验的具体内容，并认真做好预习。弄清各步骤的意义，避免教条或机械式做实验。 2．进行实验不仅要求结果良好，而且要求敏捷高效。为达到此目的，实验者应注意：①一切步骤都按正规操作法进行；②样品与试剂勿过量取用；③宜粗者勿细（例如粗天平称量物品即足够准确时，不用分析天平，用量筒取液足够准确时，不用吸量管）；④试剂、仪器防止污染及破损，保持实验环境的整洁。⑤注意力集中，避免差错。 3．实验中观察要仔细，记录要详尽、及时与客观，不得于实验后追记，应直接记在实验报告本中，而且无论实验成功与失败，都应记下。对于失败的实验，要分析其原因。 4．实验室是集体学习与工作的场所，实验时应保持肃静，不得大声喧哗，以免影响他人的工作与思考。对师长尊敬，对同学要团结友爱。实验后应清洗整理用过的仪器及清理自己的实验场所。 三、实验报告 实验报告的书写是培养学生书面表达能力和科学作风的重要手段之一，实验者应该重视。实验报告的内容包括下列各项：实验名称、实验日期、实验目的、实验原理、实验步骤、实验记录、计算（定量测定、解释）、讨论或小结。实验记录除应包括“实验总要求”的第3项要求外，还应包括原始记录。原始记录是随做随记的第一手记录，应由指导教师签字认可。书写实验报告要字迹工整，语句通顺。书写工整的实验报告，是尊师的重要表现之一。 四、组织与分组 1．每一个班学习委员负责①实验报告的收集与分发；②安排清扫值日名单； ③反映同学学习情况及对教学工作的意见；④其它临时性的工作。 2．一般实验都为两个学生单独进行。有的实验要4人一组，由相邻两学生组成固定小组。小组的成员在指导教师的同意下，可作适当的调整。
生物化学实验设计1
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响 一、目的要求 1、掌握从原料物中提取活化分离菠萝蛋白酶的方法。 2、学习酶活力测定的方法。 3、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。 4、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行化学修饰的原理。 5、比较修饰酶与未修饰酶的活力。 二、实验原理 1、本实验先从新鲜的菠萝汁中使用单宁沉淀法提取出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。 2、以陶瓷层析结合超滤法纯化菠萝蛋白酶，吸附材料化学性质好，可用于柱层析。 3、温度恒定时,菠萝中菠萝蛋白的热失活遵循一级蜕变规律dE/dt=-Kd*t,失活半寿期是常数，可以用作衡公菠萝蛋白酶热稳定性的指标。 本实验应用动力学方法，以菠萝蛋白酶的热失活半衰期为热稳定性的指标，定量研究了梭酸盐和Ca2+,Zn2+士对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响，以期找到一种高效、可行的增强菠萝蛋白酶热稳定性的方法。 4、修饰的菠萝蛋白酶对温度和pH值的稳定性均比天然酶有很大程度的提高。菠萝蛋白酶是一种巯基蛋白酶,但它的稳定性较差,影响了它的应用。此外,菠萝蛋白酶易受有关因素的影响而失活。聚乙二醇(PEG) 为一种无毒且具亲水性的免疫惰性大分子，本实验采用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰,提高了其对环境的稳定性,使其半衰期延长。 三、实验材料 （一）试剂和材料 1、新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白 2、柠檬酸钠、单宁、0.1%EDTA溶液、1.5%氯化钠溶液、1%酪蛋白溶液、1mol/L 氢氧化钠溶液、0.05mol/L磷酸缓冲液、激活剂 3、Brolain试剂、牛血清白蛋白、0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液、PEG活性酯。（二）实验仪器 1、榨汁机； 2、离心机； 3、紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）； 4、恒温水浴锅（37℃）； 5、试管、试管架； 6、烧杯、容量瓶； 7、移液管； 四、试验方法 （一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤： 将菠萝切碎→加柠檬酸钠，榨汁→菠萝汁→纱布过滤→澄清液→2000r/min，7min 离心→上清液→加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min4200r/min,5min离心→沉淀物→加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液→4200r/min,5min离心→
生物化学实验内容
《生物化学》实验教学大纲 课程类别：专业基础 适用专业：本科临床学专业 课程总学时：实验学时：32 实验指导书：生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称：生化实验室 一、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科，也是一门重要的实验性较强的基础医学课程．随着医学的发展，该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，它与理论教学既有联系，又是相对独立的组成部分，有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求，开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化，使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念，培养学生的基本技能和科学思维的形成，提高学生的动手能力。 二、基本要求 1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识，加深学生对理论课内容的理解。 2.通过对实验现象的观察，逐步培养学生学会观察，比较，分析和综合各种现象的科学方法，培养学生独立思考和独立操作的能力。 3.通过对各类实验的操作和总结，培养学生严谨的科学态度。 4.进行本学科的基本技能的训练，使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。 三、考试方法及成绩评定方法 四、说明 实验教材及参考书： 1.揭克敏主编：生物化学与分子生物学实验教程（第2版）。科学出版社，2010 参考资料： 1..袁道强主编：生物化学实验（第1版）。化学工业出版社，2011 五、实验项目数据表
2）要求：0：必修1选修 3）类型：0：演示1：验证2：综合3：设计 4）每组人数：指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。 六、各实验项目教学大纲 实验一蛋白质的沉淀反应 【预习要求】 预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。 【实验目的】 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识； 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 【实验内容】 （一）蛋白质的盐折 1. 原理 大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。 2. 操作步骤 ①取小试管1支、加入5％鸡蛋清溶液20滴，饱和硫酸铵溶液20滴，充分摇匀后静置5min，记录结果。
生化大实验实验报告材料
生化大实验 实验报告 姓名： 学号： 专业： 班级： 实验班级： 单位： 指导老师：
实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、实验原理： 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的： 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机； 四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析： 实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净； 3.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃般的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白变性，并注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果； 4.透析时，提前检查透析袋是否完整，避免透析时出现孔洞导致样品丢失。
生物化学设计性实验报告
中央民族大学生命与环境科学学院 生物化学综合性设计实验报告 2012年12月 一种简便快捷提取小白鼠肝脏DNA 的方法 One a simple and convenient Methods of Genome DNA Extraction of mouse
一种简便快捷提取小白鼠肝脏DNA的方法 吕梦春 中央民族大学生命与环境科学学院北京100081） 摘要: 主要运用了盐洗法提取小白鼠肝脏的基因组DNA, 利用分光光度计测定其OD260与OD280的吸光值,计算比率估计核酸的纯度, 并利用琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段在凝胶中的位置, 鉴定DNA.实验结果显示，用盐析法提取的DNA纯度较高。是一种简单高效的提取动物肝脏的方法。 关键词:小白鼠;DNA提取; 琼脂糖凝胶电泳 One a simple and convenient Methods of Genome DNA Extraction of mouse Meng-chun Lv （MINZU university of china,BEIJING,100081） Abstract：The genome DNAs of mouse were extracted with . Then the ration of OD260 andOD280 was determined by ultraviolet spectrophotometer. The purity of the nucleic acid was calculated and the position of DNA segments in the gel was observed by agar sugar gel electrophoresis Finally, the methods was showed a simple, convenient, swift and economic method to genome DNA extraction. Keywords: mouse; genome DNAs; agar sugar gel electrophoresis;
生化实验设计1
实验设计：酶偶联反应测定血清中的肌酐 张燕111004048 周方111004052 周跃慧111004053 一、广泛查阅文献、确定候选方法：经过查阅相关文献，根据方法选择的要求对各种方法进行比较，充分了解各方法的科学依据和真实的使用价值，再根据临床应用价值、实验室条件等综合分析后，目前主要的肌酐测定方法有化学测定法(碱性苦味酸法)、酶法、高效液相层析法、拉曼散射法、同位素稀释质谱法、毛细管电泳法及电极法等。 二、候选方法设计： 1、实验原理：肌酐经肌酐水合酶催化生成肌酸，肌酸与肌酸激酶、丙酮酸激酶、乳 酸脱氢酶的级联催化作用下生成乳酸，并将NADH变成NAD+，测量在340nm处 监测NADH吸光度变化速率，其降低程度与肌酐含量呈正比例，反应式如下 P教材198 2、反应最适条件探讨：设计一系列实验分别探讨该候选方法的最适试剂浓 度、缓冲体系的种类、离子强度、pH值、反应温度和时间、检测波长等。 3、候选方法的初步试验：——对候选方法做初步评价试验，包括： ①标准曲线和重复性； ②质控血清和新鲜标本的重复试验； ③分析浓度不同的标本，并与公认的参考方法的结果对比。 三、方法学评价： （一）重复性试验：检测候选方法的随机误差。 批内重复性试验：目的是测定实验方法的偶然误差，但产生偶然误差的原因也可能由于仪器、温度、试剂、标准品缺乏稳定性，吸量、计时、混匀等操作缺乏重现性造成，应排除这些因素才能把试验所产生的误差归于方法学的误差。重复性试验依据时间间隔可分为批内、天内、天间三种重复性试验。方法学评价重复性试验应由实验者作批内(或天内)及天间重复性试验 原理：批内重复性试验是指在相同条件下(用同样的方法，同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同一实验室由同一人操作，并保持实验期间准确度不变)对同一标本在尽可能短的时间内进行m轮，每轮n次重复测定，以获得批内精密度数据的试验方法。其结果能反映各次测定结果相互接近的程度，用于客观评价酶偶联反应测定血清中的肌酐随机误差的大小。 操作步骤：将血清标本用酶偶联反应测定血清中的肌酐作5轮，每轮4次血糖测定，即可获得20个测定数据。 计算： 1．按照批内精密度的计算公式计算5轮每轮4次测定值的平均数()、标准差(S)和变异系数(CV%)。
生物化学与分子生物学实验室简介
生物化学与分子生物学实验室简介 生物化学（biochemistry）是研究生物体的化学组成和生命过程中化学变化规律的科学。它主要采用化学以及物理学和免疫学等原理和方法，从分子水平来探讨生命现象的本质，故又称生命的化学。通常将核酸、蛋白质等生物大分子的结构、功能及其表达调控等的研究，称为分子生物学（molecular biology）。生物化学既是重要的医学基础学科，又与其它学科有着广泛的联系与交叉。 一、概况 长沙医学院生物化学与分子生物学实验室成立于2008年6月，隶属长沙医学院基础医学系，生化实验室总面积为1979平方米，布局合理，学生实验直接用房面积为1300平方米，每次学生实验人均使用面积为10.8平方米。学科现有教师21人，其中高级职称3人（教授1人、副教授2人）。学历结构合理，博士2人，硕士研究生11人。学科负责人朱传炳教授。 学科设有生物化学实验室、分子生物学实验室、生物化学与分子生物学科学研究室、仪器室、生化实验技术研究室等，具备供教师和学生使用的多种仪器设备。 二、教学 生物化学与分子生物学是长沙医学院主干学科之一。生物化学和分子生物学实验室常年承担临床、护理、药学、预防、口腔、针推、中医、影像专业的《生物化学》、《分子生物学》等实验课课程，年平均完成3557学时实验教学任务。
在实验教学中我们不断更新教学内容，规范教学各环节，注重教师的教学质量，加强实验室的建设，培养学生的实践操作能力，使学生的生物化学学习质量一直处于优秀水平。 2007、2008、2009连续三年获长沙医学院先进集体，2010年获得“三育人”先进集体。还有多名教师获得长沙医学院教学优秀奖。 三、科研 实验室辅助教研室教师从事再生障碍性贫血能量代谢障碍的研究、血吸虫疫苗研究、心脏发育相关基因的蛋白质组学研究、肿瘤的单基因功能研究、动脉粥样硬化、原发性膝骨性关节炎的基因多态性、天然产物的提取纯化及其作用等七个方向的研究，目前共承担湖南省科技厅、教育厅等科研项目十余项，科研经费二十余万，发表论文三十余篇，主编参编学术著作、教材6部。获湖南医学科技奖二等奖一项。