Tet-pLKO-puro慢病毒载体使用说明
Tet-pLKO-puro
Tet-pLKO-puro 载体基本信息：
载体名称:
Tet-pLKO-puro 质粒类型: 慢病毒载体；RNAi 载体；四环素诱导载体；Tet-On 载体 高拷贝/低拷贝: 低拷贝
克隆方法: AgeI ；EcoRI
启动子:
CMV 载体大小
:
10633 bp 5' 测序引物及序列:
5’ GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA 3’ 3' 测序引物及序列:
-- 载体标签:
-- 载体抗性: 氨苄青霉素
筛选标记:
Puromycin 克隆菌株: Stbl3 感受态细胞 ，以维持质粒的稳定性。 宿主细胞（系）: 哺乳动物细胞
备注: 其它筛选标记 Tet-pLKO-neo
稳定性: 稳表达
组成型/诱导型: 诱导型
病毒/非病毒: 慢病毒
Tet-pLKO-puro 载体质粒图谱和多克隆位点信息：
Tet-pLKO-puro载体序列
ORIGIN
1 TTGGGGTTGC GCCTTTTCCA AGGCAGCCCT GGGTTTGCGC AGGGACGCGG CTGCTCTGGG
61 CGTGGTTCCG GGAAACGCAG CGGCGCCGAC CCTGGGTCTC GCACATTCTT CACGTCCGTT 121 CGCAGCGTCA CCCGGATCTT CGCCGCTACC CTTGTGGGCC CCCCGGCGAC GCTTCCTGCT 181 CCGCCCCTAA GTCGGGAAGG TTCCTTGCGG TTCGCGGCGT GCCGGACGTG ACAAACGGAA 241 GCCGCACGTC TCACTAGTAC CCTCGCAGAC GGACAGCGCC AGGGAGCAAT GGCAGCGCGC 301 CGACCGCGAT GGGCTGTGGC CAATAGCGGC TGCTCAGCAG GGCGCGCCGA GAGCAGCGGC 361 CGGGAAGGGG CGGTGCGGGA GGCGGGGTGT GGGGCGGTAG TGTGGGCCCT GTTCCTGCCC 421 GCGCGGTGTT CCGCATTCTG CAAGCCTCCG GAGCGCACGT CGGCAGTCGG CTCCCTCGTT 481 GACCGAATCA CCGACCTCTC TCCCCAGGGG GATCTGTGAG TTTGGGGACC CTTGATTGTT 541 CTTTCTTTTT CGCTATTGTA AAATTCATGT TATATGGAGG GGGCAAAGTT TTCAGGGTGT 601 TGTTTAGAAT GGGAAGATGT CCCTTGTATC ACCATGGACC CTCATGATAA TTTTGTTTCT 661 TTCACTTTCT ACTCTGTTGA CAACCATTGT CTCCTCTTAT TTTCTTTTCA TTTTCTGTAA
721 CTTTTTCGTT AAACTTTAGC TTGCATTTGT AACGAATTTT TAAATTCACT TTTGTTTATT
781 TGTCAGATTG TAAGTACTTT CTCTAATCAC TTTTTTTTCA AGGCAATCAG GGTATATTAT
841 ATTGTACTTC AGCACAGTTT TAGAGAACAA TTGTTATAAT TAAATGATAA GGTAGAATAT 901 TTCTGCATAT AAATTCTGGC TGGCGTGGAA ATATTCTTAT TGGTAGAAAC AACTACATCC 961 TGGTCATCAT CCTGCCTTTC TCTTTATGGT TACAATGATA TACACTGTTT GAGATGAGGA 1021 TAAAATACTC TGAGTCCAAA CCGGGCCCCT CTGCTAACCA TGTTCATGCC TTCTTCTTTT 1081 TCCTACAGCT CCTGGGCAAC GTGCTGGTTA TTGTGCTGTC TCATCATTTT GGCAAAGAAT 1141 TGTAATACGA CTCACTATAG GGCGAATTGA TATGTCTAGA TTAGATAAAA GTAAAGTGAT 1201 TAACAGCGCA TTAGAGCTGC TTAATGAGGT CGGAATCGAA GGTTTAACAA CCCGTAAACT 1261 CGCCCAGAAG CTAGGTGTAG AGCAGCCTAC ATTGTATTGG CATGTAAAAA ATAAGCGGGC 1321 TTTGCTCGAC GCCTTAGCCA TTGAGATGTT AGATAGGCAC CATACTCACT TTTGCCCTTT 1381 AGAAGGGGAA AGCTGGCAAG ATTTTTTACG TAATAACGCT AAAAGTTTTA GATGTGCTTT 1441 ACTAAGTCAT CGCGATGGAG CAAAAGTACA TTTAGGTACA CGGCCTACAG AAAAACAGTA 1501 TGAAACTCTC GAAAATCAAT TAGCCTTTTT ATGCCAACAA GGTTTTTCAC TAGAGAATGC 1561 ATTATATGCA CTCAGCGCTG TGGGGCATTT TACTTTAGGT TGCGTATTGG AAGATCAAGA 1621 GCATCAAGTC GCTAAAGAAG AAAGGGAAAC ACCTACTACT GATAGTATGC CGCCATTATT 1681 ACGACAAGCT ATCGAATTAT TTGATCACCA AGGTGCAGAG CCAGCCTTCT TATTCGGCCT 1741 TGAATTGATC ATATGCGGAT TAGAAAAACA ACTTAAATGT GAAAGTGGGT CCGCGTACAG 1801 CGGCTCCCGG GAGTTCTAGG GATCTGCCCC TCTCCCTCCC CCCCCCCTAA CGTTACTGGC 1861 CGAAGCCGCT TGGAATAAGG CCGGTGTGCG TTTGTCTATA TGTTATTTTC CACCATATTG 1921 CCGTCTTTTG GCAATGTGAG GGCCCGGAAA CCTGGCCCTG TCTTCTTGAC GAGCATTCCT 1981 AGGGGTCTTT CCCCTCTCGC CAAAGGAATG CAAGGTCTGT TGAATGTCGT GAAGGAAGCA 2041 GTTCCTCTGG AAGCTTCTTG AAGACAAACA ACGTCTGTAG CGACCCTTTG CAGGCAGCGG 2101 AACCCCCCAC CTGGCGACAG GTGCCTCTGC GGCCAAAAGC CACGTGTATA AGATACACCT 2161 GCAAAGGCGG CACAACCCCA GTGCCACGTT GTGAGTTGGA TAGTTGTGGA AAGAGTCAAA 2221 TGGCTCTCCT CAAGCGTATT CAACAAGGGG CTGAAGGATG CCCAGAAGGT ACCCCATTGT 2281 ATGGGATCTG ATCTGGGGCC TCGGTGCACA TGCTTTACAT GTGTTTAGTC GAGGTTAAAA 2341 AAACGTCTAG GCCCCCCGAA CCACGGGGAC GTGGTTTTCC TTTGAAAAAC ACGATGATAA 2401 GGATCCACCG GAGCTTACCA TGACCGAGTA CAAGCCCACG GTGCGCCTCG CCACCCGCGA 2461 CGACGTCCCC AGGGCCGTAC GCACCCTCGC CGCCGCGTTC GCCGACTACC CCGCCACGCG
2521 CCACACCGTC GATCCGGACC GCCACATCGA GCGGGTCACC GAGCTGCAAG AACTCTTCCT 2581 CACGCGCGTC GGGCTCGACA TCGGCAAGGT GTGGGTCGCG GACGACGGCG CCGCGGTGGC 2641 GGTCTGGACC ACGCCGGAGA GCGTCGAAGC GGGGGCGGTG TTCGCCGAGA TCGGCCCGCG 2701 CATGGCCGAG TTGAGCGGTT CCCGGCTGGC CGCGCAGCAA CAGATGGAAG GCCTCCTGGC 2761 GCCGCACCGG CCCAAGGAGC CCGCGTGGTT CCTGGCCACC GTCGGCGTCT CGCCCGACCA 2821 CCAGGGCAAG GGTCTGGGCA GCGCCGTCGT GCTCCCCGGA GTGGAGGCGG CCGAGCGCGC 2881 CGGGGTGCCC GCCTTCCTGG AGACCTCCGC GCCCCGCAAC CTCCCCTTCT ACGAGCGGCT 2941 CGGCTTCACC GTCACCGCCG ACGTCGAGGT GCCCGAAGGA CCGCGCACCT GGTGCATGAC 3001 CCGCAAGCCC GGTGCCTGAC GCCCGCCCCA CGACCCGCAG CGCCCGACCG AAAGGAGCGC 3061 ACGACCCCAT GCATCGGTAC CTTTAAGACC AATGACTTAC AAGGCAGCTG TAGATCTTAG 3121 CCACTTTTTA AAAGAAAAGG GGGGACTGGA AGGGCTAATT CACTCCCAAC GAAGACAAGA 3181 TCTGCTTTTT GCTTGTACTG GGTCTCTCTG GTTAGACCAG ATCTGAGCCT GGGAGCTCTC 3241 TGGCTAACTA GGGAACCCAC TGCTTAAGCC TCAATAAAGC TTGCCTTGAG TGCTTCAAGT 3301 AGTGTGTGCC CGTCTGTTGT GTGACTCTGG TAACTAGAGA TCCCTCAGAC CCTTTTAGTC 3361 AGTGTGGAAA ATCTCTAGCA GTAGTAGTTC ATGTCATCTT ATTATTCAGT ATTTATAACT 3421 TGCAAAGAAA TGAATATCAG AGAGTGAGAG GAACTTGTTT ATTGCAGCTT ATAATGGTTA 3481 CAAATAAAGC AATAGCATCA CAAATTTCAC AAATAAAGCA TTTTTTTCAC TGCATTCTAG 3541 TTGTGGTTTG TCCAAACTCA TCAATGTATC TTATCATGTC TGGCTCTAGC TATCCCGCCC 3601 CTAACTCCGC CCATCCCGCC CCTAACTCCG CCCAGTTCCG CCCATTCTCC GCCCCATGGC 3661 TGACTAATTT TTTTTATTTA TGCAGAGGCC GAGGCCGCCT CGGCCTCTGA GCTATTCCAG 3721 AAGTAGTGAG GAGGCTTTTT TGGAGGCCTA GGGACGTACC CAATTCGCCC TATAGTGAGT 3781 CGTATTACGC GCGCTCACTG GCCGTCGTTT TACAACGTCG TGACTGGGAA AACCCTGGCG 3841 TTACCCAACT TAATCGCCTT GCAGCACATC CCCCTTTCGC CAGCTGGCGT AATAGCGAAG 3901 AGGCCCGCAC CGATCGCCCT TCCCAACAGT TGCGCAGCCT GAATGGCGAA TGGGACGCGC 3961 CCTGTAGCGG CGCATTAAGC GCGGCGGGTG TGGTGGTTAC GCGCAGCGTG ACCGCTACAC 4021 TTGCCAGCGC CCTAGCGCCC GCTCCTTTCG CTTTCTTCCC TTCCTTTCTC GCCACGTTCG 4081 CCGGCTTTCC CCGTCAAGCT CTAAATCGGG GGCTCCCTTT AGGGTTCCGA TTTAGTGCTT 4141 TACGGCACCT CGACCCCAAA AAACTTGATT AGGGTGATGG TTCACGTAGT GGGCCATCGC 4201 CCTGATAGAC GGTTTTTCGC CCTTTGACGT TGGAGTCCAC GTTCTTTAAT AGTGGACTCT 4261 TGTTCCAAAC TGGAACAACA CTCAACCCTA TCTCGGTCTA TTCTTTTGAT TTATAAGGGA 4321 TTTTGCCGAT TTCGGCCTAT TGGTTAAAAA ATGAGCTGAT TTAACAAAAA TTTAACGCGA 4381 ATTTTAACAA AATATTAACG CTTACAATTT AGGTGGCACT TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG 4441 AACCCCTATT TGTTTATTTT TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCTCA TGAGACAATA 4501 ACCCTGATAA ATGCTTCAAT AATATTGAAA AAGGAAGAGT ATGAGTATTC AACATTTCCG 4561 TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT TTGCGGCATT TTGCCTTCCT GTTTTTGCTC ACCCAGAAAC 4621 GCTGGTGAAA GTAAAAGATG CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT ACATCGAACT 4681 GGATCTCAAC AGCGGTAAGA TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TTCCAATGAT 4741 GAGCACTTTT AAAGTTCTGC TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTATTGACG CCGGGCAAGA 4801 GCAACTCGGT CGCCGCATAC ACTATTCTCA GAATGACTTG GTTGAGTACT CACCAGTCAC 4861 AGAAAAGCAT CTTACGGATG GCATGACAGT AAGAGAATTA TGCAGTGCTG CCATAACCAT 4921 GAGTGATAAC ACTGCGGCCA ACTTACTTCT GACAACGATC GGAGGACCGA AGGAGCTAAC 4981 CGCTTTTTTG CACAACATGG GGGATCATGT AACTCGCCTT GATCGTTGGG AACCGGAGCT 5041 GAATGAAGCC ATACCAAACG ACGAGCGTGA CACCACGATG CCTGTAGCAA TGGCAACAAC 5101 GTTGCGCAAA CTATTAACTG GCGAACTACT TACTCTAGCT TCCCGGCAAC AATTAATAGA
5161 CTGGATGGAG GCGGATAAAG TTGCAGGACC ACTTCTGCGC TCGGCCCTTC CGGCTGGCTG 5221 GTTTATTGCT GATAAATCTG GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CGCGGTATCA TTGCAGCACT 5281 GGGGCCAGAT GGTAAGCCCT CCCGTATCGT AGTTATCTAC ACGACGGGGA GTCAGGCAAC 5341 TATGGATGAA CGAAATAGAC AGATCGCTGA GATAGGTGCC TCACTGATTA AGCATTGGTA 5401 ACTGTCAGAC CAAGTTTACT CATATATACT TTAGATTGAT TTAAAACTTC ATTTTTAATT 5461 TAAAAGGATC TAGGTGAAGA TCCTTTTTGA TAATCTCATG ACCAAAATCC CTTAACGTGA 5521 GTTTTCGTTC CACTGAGCGT CAGACCCCGT AGAAAAGATC AAAGGATCTT CTTGAGATCC 5581 TTTTTTTCTG CGCGTAATCT GCTGCTTGCA AACAAAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT 5641 TTGTTTGCCG GATCAAGAGC TACCAACTCT TTTTCCGAAG GTAACTGGCT TCAGCAGAGC 5701 GCAGATACCA AATACTGTTC TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA GGCCACCACT TCAAGAACTC 5761 TGTAGCACCG CCTACATACC TCGCTCTGCT AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG 5821 CGATAAGTCG TGTCTTACCG GGTTGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA AGGCGCAGCG 5881 GTCGGGCTGA ACGGGGGGTT CGTGCACACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA 5941 ACTGAGATAC CTACAGCGTG AGCTATGAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC 6001 GGACAGGTAT CCGGTAAGCG GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCCAGG 6061 GGGAAACGCC TGGTATCTTT ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG 6121 ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT 6181 TTTACGGTTC CTGGCCTTTT GCTGGCCTTT TGCTCACATG TTCTTTCCTG CGTTATCCCC 6241 TGATTCTGTG GATAACCGTA TTACCGCCTT TGAGTGAGCT GATACCGCTC GCCGCAGCCG 6301 AACGACCGAG CGCAGCGAGT CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA GAGCGCCCAA TACGCAAACC 6361 GCCTCTCCCC GCGCGTTGGC CGATTCATTA ATGCAGCTGG CACGACAGGT TTCCCGACTG 6421 GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CTCACTCATT AGGCACCCCA 6481 GGCTTTACAC TTTATGCTTC CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATTGTGAGCG GATAACAATT 6541 TCACACAGGA AACAGCTATG ACCATGATTA CGCCAAGCGC GCAATTAACC CTCACTAAAG 6601 GGAACAAAAG CTGGAGCTGC AAGCTTAATG TAGTCTTATG CAATACTCTT GTAGTCTTGC 6661 AACATGGTAA CGATGAGTTA GCAACATGCC TTACAAGGAG AGAAAAAGCA CCGTGCATGC 6721 CGATTGGTGG AAGTAAGGTG GTACGATCGT GCCTTATTAG GAAGGCAACA GACGGGTCTG 6781 ACATGGATTG GACGAACCAC TGAATTGCCG CATTGCAGAG ATATTGTATT TAAGTGCCTA 6841 GCTCGATACA TAAACGGGTC TCTCTGGTTA GACCAGATCT GAGCCTGGGA GCTCTCTGGC 6901 TAACTAGGGA ACCCACTGCT TAAGCCTCAA TAAAGCTTGC CTTGAGTGCT TCAAGTAGTG 6961 TGTGCCCGTC TGTTGTGTGA CTCTGGTAAC TAGAGATCCC TCAGACCCTT TTAGTCAGTG 7021 TGGAAAATCT CTAGCAGTGG CGCCCGAACA GGGACTTGAA AGCGAAAGGG AAACCAGAGG 7081 AGCTCTCTCG ACGCAGGACT CGGCTTGCTG AAGCGCGCAC GGCAAGAGGC GAGGGGCGGC 7141 GACTGGTGAG TACGCCAAAA ATTTTGACTA GCGGAGGCTA GAAGGAGAGA GATGGGTGCG 7201 AGAGCGTCAG TATTAAGCGG GGGAGAATTA GATCGCGATG GGAAAAAATT CGGTTAAGGC 7261 CAGGGGGAAA GAAAAAATAT AAATTAAAAC ATATAGTATG GGCAAGCAGG GAGCTAGAAC 7321 GATTCGCAGT TAATCCTGGC CTGTTAGAAA CATCAGAAGG CTGTAGACAA ATACTGGGAC 7381 AGCTACAACC ATCCCTTCAG ACAGGATCAG AAGAACTTAG ATCATTATAT AATACAGTAG 7441 CAACCCTCTA TTGTGTGCAT CAAAGGATAG AGATAAAAGA CACCAAGGAA GCTTTAGACA 7501 AGATAGAGGA AGAGCAAAAC AAAAGTAAGA CCACCGCACA GCAAGCGGCC GCTGATCTTC 7561 AGACCTGGAG GAGGAGATAT GAGGGACAAT TGGAGAAGTG AATTATATAA ATATAAAGTA 7621 GTAAAAATTG AACCATTAGG AGTAGCACCC ACCAAGGCAA AGAGAAGAGT GGTGCAGAGA 7681 GAAAAAAGAG CAGTGGGAAT AGGAGCTTTG TTCCTTGGGT TCTTGGGAGC AGCAGGAAGC 7741 ACTATGGGCG CAGCGTCAAT GACGCTGACG GTACAGGCCA GACAATTATT GTCTGGTATA
7801 GTGCAGCAGC AGAACAATTT GCTGAGGGCT ATTGAGGCGC AACAGCATCT GTTGCAACTC 7861 ACAGTCTGGG GCATCAAGCA GCTCCAGGCA AGAATCCTGG CTGTGGAAAG ATACCTAAAG 7921 GATCAACAGC TCCTGGGGAT TTGGGGTTGC TCTGGAAAAC TCATTTGCAC CACTGCTGTG 7981 CCTTGGAATG CTAGTTGGAG TAATAAATCT CTGGAACAGA TTTGGAATCA CACGACCTGG 8041 ATGGAGTGGG ACAGAGAAAT TAACAATTAC ACAAGCTTAA TACACTCCTT AATTGAAGAA 8101 TCGCAAAACC AGCAAGAAAA GAATGAACAA GAATTATTGG AATTAGATAA ATGGGCAAGT 8161 TTGTGGAATT GGTTTAACAT AACAAATTGG CTGTGGTATA TAAAATTATT CATAATGATA 8221 GTAGGAGGCT TGGTAGGTTT AAGAATAGTT TTTGCTGTAC TTTCTATAGT GAATAGAGTT 8281 AGGCAGGGAT ATTCACCATT ATCGTTTCAG ACCCACCTCC CAACCCCGAG GGGACCCGAC 8341 AGGCCCGAAG GAATAGAAGA AGAAGGTGGA GAGAGAGACA GAGACAGATC CATTCGATTA 8401 GTGAACGGAT CTCGACGGTA TCGATCACGA GACTAGCCTC GAGCGGCCGC AATATTTGCA 8461 TGTCGCTATG TGTTCTGGGA AATCACCATA AACGTGAAAT CCCTATCAGT GATAGAGACT 8521 TATAAGTTCC CTATCAGTGA TAGAGACACC GGTGTGTTGT AAATGAGCAC ACAAAATACA 8581 CATGCTAAAA TATTATATTC TATGACCTTT ATAAAATCAA CCAAAATCTT CTTTTTAATA 8641 ACTTTAGTAT CAATAATTAG AATTTTTATG TTCCTTTTTG CAAACTTTTA ATAAAAATGA 8701 GCAAAATAAA AAAACGCTAG TTTTAGTAAC TCGCGTTGTT TTCTTCACCT TTAATAATAG 8761 CTACTCCACC ACTTGTTCCT AAGCGGTCAG CTCCTGCTTC AATCATTTTT TGAGCATCTT 8821 CAAATGTTCT AACTCCACCA GCTGCTTTAA CTAAAGCATT GTCTTTAACA ACTGACTTCA 8881 TTAGTTTAAC ATCTTCAAAT GTTGCACCTG ATTTTGAAAA TCCTGTTGAT GTTTTAACAA 8941 ATTCTAATCC AGCTTCAACA GCTATTTCAC AAGCTTTCAT GATTTCTTCT TTTGTTAATA 9001 AACAATTTTC CATAATACAT TTAACAACAT GTGATCCAGC TGCTTTTTTT ACAGCTTTCA 9061 TGTCTTCTAA AACTAATTCA TAATTTTTGT CTTTTAATGC ACCAATATTT AATACCATAT 9121 CAATTTCTGT TGCACCATCT TTAATTGCTT CAGAAACTTC GAATGCTTTT GTAGCTGTTG 9181 TGCATGCACC TAGAGGAAAA CCTACAACAT TTGTTATTCC TACATTTGTG CCTTTTAATA 9241 ATTCTTTACA ATAGCTTGTT CAATATGAAT TAACACAAAC TGTTGCAAAA TCAAATTCAA 9301 TTGCTTCATC ACATAATTGT TTAATTTCAG CTTTCGTAGC ATCTTGTTTT AATAATGTGT 9361 GATCTATATA TTTGTTTAGT TTCATTTTTT CTCCTATATA TTCATTTTTA ATTTTAATTC
9421 TTTAATAATT TCGTCTACTT TAACTTTAGC GTTTTGAACA GATTCACCAA CACCTATAAA 9481 ATAAATTTTT AGTTTAGGTT CAGTTCCACT TGGGCGAACA GCAAATCATG ACTTATCTTC 9541 TAAATAAAAT TTTAGTAAGT CTTGTCCTGG CATATTATAC ATTCCATCGA TGTAGTCTTC 9601 AACATTAACA ACTTTAAGTC CAGCAATTTG AGTTAAGGGT GTTGCTCTCA ATGATTTCAT 9661 TAATGGTTCA ATTTTTAATT TCTTTTCTTC TGGTTTAAAA TTCAAGTTTA AAGTGAAAGT 9721 GTAATATGCA CCCATTTCTT TAAATAAATC TTCTAAATAG TCTACTAATG TTTTATTTTG
9781 TTTTTTATAA AATCAAGCAG CCTCTGCTAT TAATATAGAA GCTTGTATTC CATCTTTATC 9841 TCTAGCTGAG TCATCAATTA CATATCCATA ACTTTCTTCA TAAGCAAAAA CAAAATTTAA 9901 TCCGTTATCT TCTTCTTTAG CAATTTCTCT ACCCATTCAT TTAAATCCAG TTAAAGTTTT 9961 TACAATATTA ACTCCATATT TTTCATGAGC GATTCTATCA CCCAAATCAC TTGTTACAAA 10021 ACTTGAATAT AGAGCCGGAT TTTTTGGAAT GCTATTTAAG CGTTTTAGAT TTGATAATTT 10081 TCAATCAATT AAAATTGGTC CTGTTTGATT TCCATCTAAT CTTACAAAAT GACCATCATG 10141 TTTTATTGCC ATTCCAAATC TGTCAGCATC TGGGTCATTC ATAATAATAA TATCTGCATC 10201 ATGTTTAATA CCATATTCAA GCGGTATTTT TCATGCAGGA TCAAATTCTG GATTTGGATT 10261 TACAACATTT TTAAATGTTT CATCTTCAAA TGCATGCTCT TCAACCTCAA TAACGTTATA 10321 TCCTGATTCA CGTAATATTT TTGGGGTAAA TTTAGTTCCT GTTCCATTAA CTGCGCTAAA 10381 AATAATTTTT AAATCTTTTT TAGCTTCTTG CTCTTTTTTG TAGAATTCTC GACCTCGAGA
10441 CAAATGGCAG TATTCATCCA CAATTTTAAA AGAAAAGGGG GGATTGGGGG GTACAGTGCA
10501 GGGGAAAGAA TAGTAGACAT AATAGCAACA GACATACAAA CTAAAGAATT ACAAAAACAA
10561 ATTACAAAAA TTCAAAATTT TCGGGTTTAT TACAGGGACA GCAGAGATCC ACTTTGGCCG
10621 CGGCTCGAGG GGG
//
Tet-pLKO-puro其他相关慢病毒载体：
Tet-pLKO-neo Tet-pLKO-puro pPACKH1-GAG
pMD2.G pCMV-dR8.2-dvpr pLKO.1-GFP-shRNA pLKO.1-TRC control pLKO.1-hygro pLKO.1-TRC
pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro FUW-tetO-hOKMS
FUW-tetO-hOCT4 FUW-tetO-hSOX2 FUW-tetO-hKLF4
FUW pLVX-AcGFP1-N1 pLVX-AcGFP1-C1
pLVX-AmCyan1-N1 pLVX-DsRed-Express2-C1 pLVX-DsRed-Express2-N1 pLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-PAmCherry-C1 pLVX-PAmCherry-N1
pLVX-ZsGreen1-N1 pLVX-IRES-ZsGreen1 pLVX-IRES-mCherry
pLVX-mCherry-C1 pLVX-mCherry-N1 pLVX-tdTomato-C1 pLKO.1-puro pLentilox 3.7 pLVX-Tet-On-Advanced pLVX-IRES-Puro pLVX-IRES-Neo pLVX-IRES-Hyg
pLVX-EF1α-DsRed-Monomer-C1 pLVX-EF1α-AcGFP1-N1 pLVX-EF1α-AcGFP1-C1 pLVX-EF1α-mCherry-C1 pLVX-EF1α-IRES-mCherry pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1 pLVX-MetLuc Control pLVX-MetLuc pLVX-Hom-Mem1
pLVX-Het-2 pLVX-DD-AcGFP1-Actin pPRIME-TET-GFP-FF3
pSIH1-H1-CopGFP pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pLOX-CWBmi1 pLOX-CW-CRE
pRSV-rev pMDLg-pRRE pLL3.7
pLVX-DD-AmCyan1 Control pLVX-DD-AmCyan1 Reporter pLVX-DD-tdTomato Reporter pLVX-DD-tdTomato Control pLVX-PTuner-Green pLVX-CherryPicker2
pLVX-TetOne-Puro-Luc pLVX-TetOne pLVX-TetOne-Puro
pLVX-TetOne-Luc pLVX-rHom-Nuc1 pLVX-rHom-Sec1
pLVX-rHom-1 pLVX-Hom-Nuc1 pLVX-Het-Nuc1
pLVX-PTuner pLVX-PTuner2 pLVX-DD-ZsGreen1 Reporter pLVX-Het-1 pLVX-CherryPicker Control pLVX-Tet3G
pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Hygro pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo pCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV pCDH1-MCS2-EF1-copGFP pCDF1-MCS2-EF1-Puro pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP pWPXL pLVX-TRE3G-ZsGreen1 pLVX-TRE3G-mCherry pLenti6.3-EmGFP-BveI miR pLenti6/V5-GW/lacZ
pLenti6.3/V5-GW/EmGFP pLenti6.3-MCS pLenti6.3-DsRed2-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP pLVX-shRNA2 psPAX2
VSV-G pSico PGK Puro pcDNA6.2-DsRed2-MCS1 miR pcDNA6.3-EmGFP-NC- II pcDNA6.2-EmGFP-NC- I pcDNA6.2-EmGFP-BsaI miR pLenti6.3-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-DsRed2 pLEX-MCS
pGIPZ pLP2 pLP1
FUGW pFUGW pLOX-Ttag-iresTK
pMDLg/pRRE pLentG-KOSM pCMV-dR8.91
pLVX-TRE3G-Luc Control pLVX-TRE3G-IRES pCgpv
pSico pSicoR pLVTHM
pGensil-1 pLVX-EF1α-IRES-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pPACKH1-REV pLVX-Het-Mem1 pLVX-shRNA1
pLKO.1-puro-GFP-siRNA pPRIME-TREX-GFP-FF3 pcDNA6.2-DsRed2-BsmBI miR pCDH-MSCV-MCS-EF1-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP pLVX-TRE3G
FUW-tetO-hMYC pLOX-TERT-iresTK pLP/VSVG
FUW-M2rtTA pCDH-EF1-MCS-(PGK-Puro) pcDNA6.2-EmGFP-MCS1 miR pLVX-AmCyan1-C1 pLVX-Hom-1 pcDNA6.2-BsaI miR
pLVX-DsRed-Monomer-C1 pLVX-mCherry-Actin pTRIPZ
pLVX-ZsGreen1-C1 pLVX-CherryPicker1 LeGO-iC2
pLVX-IRES-tdTomato pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro pLKO.3G
pLVX-tdTomato-N1 pLVX-PTuner2-C pLVX-Puro
pLVX-Tight-Puro pLVX-DD-ZsGreen1 Control pSicoR PGK Puro
pLVX-EF1α-DsRed-Monomer-N1 pCDH-UbC-MCS-EF1-Hygro pLVTH
pLVX-EF1α-mCherry-N1 pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP
慢病毒载体使用手册
LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus. lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro. Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319). Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit https://www.wendangku.net/doc/f89126989.html, to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: https://www.wendangku.net/doc/f89126989.html,/gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material. Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005
过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1
过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月
目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)
简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。
慢病毒转染手册
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、包装细胞293T 细胞的培养 一、293T 细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's 液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25% 的胰酶，消化10-20s 后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7. 将细胞离心，1000rpm ，2min 。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基+20%FBS+10% DMSO ）重悬细胞，密度为3X 10 6个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T 细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为 3 X10 5个/ml。 4. 分到10cm 培养皿中，10ml/ 皿。 三、293T 细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40 C。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml 细胞溶液加入9 ml 完全培养基中并混匀后转入10cm 培养皿。 5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE 特异引物，序列如下 只供学习与交流
慢病毒载体包装构建过程
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活
pLVX-TetOne-Puro慢病毒载体使用说明
pLVX-TetOne-Puro pLVX-TetOne-Puro 载体基本信息： 载体名称: pLVX-TetOne-Puro 质粒类型: 慢病毒载体；四环素调控载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: TRE3GS 载体大小: 9227 bp 5' 测序引物及序列: -- 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: 无 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 嘌呤霉素（Puromycin ） 克隆菌株: Stbl3 宿主细胞（系）: 常规细胞系（293、CV-1、CHO 等） 备注: 慢病毒载体pLVX-TetOne-Puro 是集调控与应答功能于一体的四环素诱导载体。 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 诱导型 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-TetOne-Puro 载体质粒图谱和多克隆位点信息：
pLVX-TetOne-Puro载体序列： ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA 181 ATAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGGATG GATGACCCGG 241 AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC GTGGCCCGAG 301 AGCTGCATCC GGAGTACTTC AAGAACTGCT GATATCGAGC TTGCTACAAG GGACTTTCCG 361 CTGGGGACTT TCCAGGGAGG CGTGGCCTGG GCGGGACTGG GGAGTGGCGA GCCCTCAGAT 421 CCTGCATATA AGCAGCTGCT TTTTGCCTGT ACTGGGTCTC TCTGGTTAGA CCAGATCTGA 481 GCCTGGGAGC TCTCTGGCTA ACTAGGGAAC CCACTGCTTA AGCCTCAATA AAGCTTGCCT 541 TGAGTGCTTC AAGTAGTGTG TGCCCGTCTG TTGTGTGACT CTGGTAACTA GAGATCCCTC 601 AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT AGCAGTGGCG CCCGAACAGG GACTTGAAAG 661 CGAAAGGGAA ACCAGAGGAG CTCTCTCGAC GCAGGACTCG GCTTGCTGAA GCGCGCACGG 721 CAAGAGGCGA GGGGCGGCGA CTGGTGAGTA CGCCAAAAAT TTTGACTAGC GGAGGCTAGA 781 AGGAGAGAGA TGGGTGCGAG AGCGTCAGTA TTAAGCGGGG GAGAATTAGA TCGCGATGGG 841 AAAAAATTCG GTTAAGGCCA GGGGGAAAGA AAAAATATAA ATTAAAACAT ATAGTATGGG 901 CAAGCAGGGA GCTAGAACGA TTCGCAGTTA ATCCTGGCCT GTTAGAAACA TCAGAAGGCT
慢病毒包装体系使用说明
慢病毒包装体系使用说明 本说明书适用于以下产品： 名称货号 慢病毒包装体系KLV3501 慢病毒包装体系（含293V细胞）KLV3502 慢病毒包装体系（含转染试剂）KLV3503 慢病毒包装体系（含293V细胞、转染试剂）KLV3504 北京英茂盛业生物科技有限公司 Web site：https://www.wendangku.net/doc/f89126989.html,
1 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.wendangku.net/doc/f89126989.html,/ 产品内容 KLV3501 KLV3502 KLV3503 KLV3504 慢病毒载体（过表达或RNA 干扰载体任选一种） 3 3 3 3 辅助载体pH1 3 3 3 3 辅助载体pH2 3 3 3 3 HEK293V 细胞 3 3 Polyfect-V 转染试剂 3 3 载体采用质粒形式发货，请在收到质粒后放-20℃冻存，也可以直接转化大肠杆菌感受态进行质粒扩增。 HEK293V 细胞采用干冰或培养瓶发货。请在收到细胞后根据附带说明书进行复苏或传代。 慢病毒载体 慢病毒载体中含有病毒整合和表达所需原件及表达外源目的基因的元件。外源基因通过载体中的多克隆位点插入慢病毒载体中进行表达。 pLV-EGFP-C 的载体图谱见下，本公司的其它慢病毒载体结构与之基本相似。其它载体信息见本公司网站https://www.wendangku.net/doc/f89126989.html, 或本说明书后面的附表。
慢病毒包装载体 慢病毒包装载体包括pH1和pH2，表达生产病毒颗粒所需的病毒蛋白。载体图谱见下：
HEK293V细胞 包装细胞的状态对病毒包装效果有直接影响。我公司保存的293V细胞为低次代293V细胞，细胞性状稳定。在高密度下生长3天仍可保持贴壁状态，持续产生病毒颗粒，因此可多次收获病毒，降低病毒包装实验成本。 Polyfect‐V转染试剂 Polyfect-V转染试剂专为293V细胞转染及慢病毒包装研制,可以在细胞铺板同时进行转染，缩短病毒包装时间；无需要求细胞处于生长对数期，细胞转染时密度可以很高；细胞毒性极低；质粒和转染试剂用量是普通转染试剂的1/3到1/2等显著优点；包装病毒时转染效率接近100%，能提高病毒产量3-5倍。 3 北京英茂盛业生物科技有限公司 https://www.wendangku.net/doc/f89126989.html,/
慢病毒包装原理及应用
慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（Lentivirus ）载体是以HIV-1 （人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA 表达载体中，是由RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA 合成的，这是因为RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA 不会带poly A 尾。当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续4 个或5 个T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4 个U 。U6 和H1 RNA 启动子是两种RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA 和～50ntRNA 茎环结构（stem loop ）。在siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和4 ～5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA 。构建载体前通常要通过合成siRNA 的方法，寻找高效的siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA 表达载体。 慢病毒载体（Lentiviral vector ）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选； 3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液； 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
慢病毒包装实验步骤
慢病毒包装实验的要点： 1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代； 2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多； 3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多； 实验前要准备的试剂、耗材和仪器； 试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。 耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。 第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）； 实验前准备： 安全柜开紫外灯照30分钟； 把培养基和试剂放置常温； 消化细胞： 从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS 吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。 细胞铺板： 在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。放置培养箱中培养48h。 插入铺板后图片
慢病毒载体,稳定表达
慢病毒载体，稳定表达 一、慢病毒 逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。 慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。 最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。 慢病毒结构： 2个调节基因： （1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。 （2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。 4个辅助蛋白（附属）基因： （1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生； （2）vpr和nef参与疾病的表现。 慢病毒的优势： 1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因； 2.可感染分裂和非分裂细胞； 3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验； 4.可以更换特异性启动子； 5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；
二、慢病毒载体 慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。 慢病毒包装过程： 慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。 慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物） 三、慢病毒的使用和优势 慢病毒的使用量的取决因素：滴度，感染体积，MOI ，细胞密度 滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位） 检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。 实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。 图3 MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。 最后，818 一些有关慢病毒方面的产品： 1.关于慢病毒载体构建方面： ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】 shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，shRNA慢病毒】 miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，miRNA/inhibitor慢病毒】
慢病毒载体构建步骤研究
一、简介 慢病毒( Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶川启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶川有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA 聚合酶川遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3'端形成1~4个U。 U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶川依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达?21ntRNA 和?50ntRNA 茎环结构(stem loop )。在 siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA (small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶川启动子和4?5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可 折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前 通常要通过合成siRNA 的方法，寻找高效的siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA 表达载体(筛选)。 二、实验流程(大致的简单过程) 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的
pLVX-Puro慢病毒载体使用说明
pLVX-Puro pLVX-Puro载体基本信息： 载体名称: pLVX-Puro , pLVXpuro 质粒类型: 哺乳动物细胞慢病毒表达载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: CMV 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 8102 bp 5' 测序引物及序列 : CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: -- 载体抗性: 氨苄 筛选标记: 嘌呤霉素 备注: 含有组成型CMV启动子的慢病毒载体稳定性: / 组成型: -- 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-Puro载体质粒图谱和多克隆位点信息：
pLVX-Puro载体简介： Description pLVX-Puro is an HIV-1-based, lentiviral expression vector. Lentiviral particles derived from the vector allow you to express your gene of interest in virtually any cell type, even primary cells. Expression of your gene is driven by the constitutively active human cytomegalovirus immediate early promoter (PCMV IE), located just upstream of the multiple cloning site (MCS), allowing constitutive, high level expression of your protein of interest. pLVX-Puro contains all of the viral processing elements necessary for the production of replication-incompetent lentivirus, as well as elements to improve viral titer, transgene expression, and overall vector function. The woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) promotes RNA processing events and enhances nuclear export of viral and transgene RNA (1), leading to increased viral titers from packaging cells, and enhanced expression of your gene of interest in target cells. In addition, the vector includes a Rev-response element (RRE), which further increases viral titers by enhancing the transport of unspliced viral RNA out of the nucleus (2). Finally, pLVX-Puro also contains a central polypurine tract (cPPT) element that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection, resulting in improved vector integration and more effi cient transduction (3). In addition to lentiviral elements, pLVX-Puro contains a puromycin resistance gene (Puror) under the control of the murine phosphoglycerate kinase (PGK) promoter (PPGK) for the selection of stable transductants. The vector also contains a pUC origin of replication and an E. coli ampicillin resistance gene (Ampr) for propagation and selection in bacteria. Use pLVX-Puro constitutively expresses your gene of interest from PCMV IE when transduced into target cells. Before the vector can be transduced into cells, however, it must be transfected into 293T packaging cells with our Lenti-X? HT Packaging System (Cat. Nos. 632160 and 632161). This packaging system allows you to safely produce high titer, infectious, replication-incompetent, VSV-G pseudotyped lentiviral particles that can infect a wide range of cell types, including non-dividing and primary cells (4). pLVX-Puro载体序列： ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA