单引物耐热链替代扩增HBVX区方法的初步探讨_韩延平

单引物耐热链替代扩增HBV X区方法的初步探讨

韩延平,宋亚军,张敏丽,王　津,郭兆彪,杨瑞馥＊

(军事医学科学院微生物流行病研究所,北京　100071)

[摘要]　目的:以HBV X区为模型,对单引物耐热链替代扩增(SDA)反应的影响因素进行初步探讨。SDA是一种等温的体外核酸扩增技术,其主要依据限制性内切酶识别并切割半硫酸磷酸化DNA未修饰链(即打缺口)以及5′※3′外切酶缺陷的DNA聚合酶在切口处聚合延伸并替代下游链的特性,这种“打缺口—聚合替代”不断循环往复,达到靶序列的扩增。方法:以HBV为模型,设计一条典型的SDA引物(含5′悬端、Bso BⅠ酶切位点及3′端靶序列互补区),采用耐热Bs o BⅠ Bst DNA聚合酶53℃恒温反应体系,微孔板杂交检测最终产物。结果与结论:对SDA反应的重要的影响因素进行了初步探讨,并实现了SDA对模板的线性扩增。

[关键词]　链替代扩增;体外核酸扩增技术;乙型肝炎病毒;微孔板杂交

[中图分类号]　Q78 [文献标识码]A

[文章编号]　1000_5501(2002)03_0194_03

Amplification of HBV X region by thermophilic strand displacement amplification(SDA) with a typical SDA primer

Han Yan_Ping,Song Ya_Jun,Zhang Min_Li,Wang J in,G uo Zhao_Biao,Yang Rui_Fu

(Institute of Microbiology and Epidemiology,Academy of Military M edical Sciences,Beijing100071,China)

[Abstract]　Objective:To discuss the main factors influencing thermophilic strand displacement amplification(SDA)with a typi-cal primer.SDA is a techniq ue of isothermal in vitro amplification of DNA,based on the ability of restriction enzyme to nick the un modified strand of a hemiphosphorothioate DNA recognition sites,and the ability of a5′※3′exonuclease_deficient DNA poly-merase to extend the3′end at the nick and displace the downstream strand.Target amplification is achieved by n icking and poly-merization displacement cycles.Methods:A typical SDA primer was designed on HB V X region DNA sequence.A reaction was conducted with thermophilic Bso BⅠ Bs t DNA polymerase isothermally and its products were detected b y microplate_based hybrid-ization method.Results and Conclusion:The linear amplification of X region of HBV with the thermophilic SDA was achieved.The important factors influencin g thermolphilic SDA were demonstrated.

[Key words]　thermophilic strand displacement amplification;isothermal DNA amplification;hepatitis B virus;microwell plate hybridization

目前有多种体外核酸扩增技术用于实验室和临床微生物的诊断。大体上说,核酸扩增方法分为两种:一种是需要温度循环的,如PCR、连接酶链反应、基于逆转录的扩增反应;另一种是等温扩增体系,如自主序列复制(3SR)、Qβ复制酶体系及链替代扩增(strand displacement amplification,SDA)反应。SDA反应是一种等温、酶控的体外核酸扩增技术,其主要依据限制性内切酶识别并切割半硫酸磷酸化DNA未修饰链(即打缺口)以及5′※3′外切酶缺陷的DNA聚合酶在切口处聚合延伸并替代下游链的特性。这种“打缺口—聚合替代”不断循环往复达到靶序列的扩增,具有操作简便、不需特殊仪器,扩增效率高等优点[1]。有研究表明,采用双引物扩增双链靶分子,Hin cⅡ exo_Klenow DNA聚合酶体系,SDA可达108扩增;而耐热的Bs o BⅠ Bca DNA聚合酶体系扩增效率可达1010[2]。

到目前为止,SDA主要用在分枝杆菌DNA序列方面的检测,采用分枝杆菌属特异性16S rRNA基因、种特异性插入序列(IS6110)作为靶分子[3]。目前除上述应用外,在体外进化模型的建立、病毒载量监测方面也有应用;另外,Nanongen 公司还将其用于DNA芯片杂交[4,5]。

本研究旨在以乙型肝炎病毒X区为模型,采用一条典型SDA引物、Bs o BⅠ Bs t DNA聚合酶体系对耐热SDA体系进行初步的探讨。

1　材料与方法

1.1　试剂

限制性内切酶Bs o BⅠ、exo_Bst DNA聚合酶购自New England Biolabs公司;α_硫酸化脱氧胸腺嘧啶(dCTP[αS])购自

[收稿日期]　2001-11-01

[作者简介]　韩延平(1976-),女,内蒙古自治区赤峰市人,在

读硕士生。

＊　通讯联系人

194军事医学科学院院刊　2002年9月第26卷第3期Bull Acad Mil Med Sci,Sep2002;　Vol26　No3　

Pharmacia公司;高保真Pfu DNA聚合酶、所有引物及其生物素标记均由上海生工生物工程公司提供;微孔板购自丹麦NUNc公司。批号469914;Hyperion公司生产自动微孔板酶标仪。

1.2　引物和靶序列的设计

DDBJ核酸库中调取HB V全基因组序列(X51970、AB010289、AB014362、A08967、AB032431、AB036905、AB036905等包括A_G和未定型1、2共77条序列),运用ClustalX软件进行序列对比,在其X区找到一段相对保守区,分别在两端设计上游引物X2和下游引物X3,扩增产物作为克隆探针,其预计长度为364bp;5′端生物素标记引物T7、SP6扩增克隆子作为探针用。在其上游14bp处设计另一上游引物X1,与X3合用扩增SDA的靶序列。典型SDA引物S由5′※3′依次为:18bp保护碱基、Bso BⅠ酶切位点识别序列CTCGAG及靶分子互补区(11bp)。序列见表1。

表1　本文所用引物及其序列

引物序列

X15′_GCATGGA GACCACCGTGAA C_3′

X25′_CCGTG AACGCCCATCAG_3′

X35′_GACGGAA GGAAAGA AGTCA GAAG_3′

S 5′_CGATTCCGCTCCAGACTT CTC GA G GTA CCGCA TG-GA GACC_3′

T75′_Bio_TAATACGACTCACTATAGGG_3′

SP65′_Bio_ATTTAGGTGACACTATAGAA_3′

划线部分为Bs o BⅠ识别序列;Bio指生物素标记

1.3　方法

1.3.1　靶分子、探针的制备

1.3.1.1　靶序列的制备　50μl PCR反应体系包括引物X1、

X3各100nmol,10mmol L KCl,16mmol L(NH

4)

2

SO

4

,2mmol L

MgSO

4

,20mmol L Tris_HCl(p H8.8),0.1%Triton X_100,0.1mg ml BSA,1.5U pfu DNA聚合酶,一定量HB V全基因组质粒(由本所分子生物学实验室提供)。该体系94℃4min预变性, 94℃30s,58℃30s,72℃30s,共30个循环,反应产物合并后

用Promega公司核酸纯化试剂盒进行纯化。

1.3.1.2　探针制备　采用引物X2、X3,Taq DNA聚合酶PCR 扩增特异片段,产物纯化后,连接至T_载体(Promega公司),并转化至大肠杆菌J M109。提取转化后质粒,并用生物素标记的引物SP6、T7扩增,得到带有标记的特异性探针。上述扩增纯化产物均用紫外分光光度计测核酸含量。

1.3.2　SDA反应50μl SDA反应体系[6,7]　限制性内切酶Bso BⅠ20U,Bst DNA聚合酶8U,1mmol L d GTP、dATP、dTTP、dCTP[αS],50mmol L NaCl,10mmol L Tris_HCl(p H7.9),

10mmol L MgCl

2

,不同浓度的KCl(20,40,60,80和100mmol L),1mmol L DTT,500nmol L引物S,加入不同量模板(0～100n g)。该反应体系在加入Bs o BⅠ Bs t DNA聚合酶之前,94℃反应5min,然后53℃温育2min,此时加入两种酶混合物,继续温育2h,94℃3min终止反应。反应产物等体积氯仿抽提,2倍体积无水乙醇沉淀2h,4℃12000r min离心30

min后,弃上清,用70%乙醇漂洗、干燥,溶解于无菌水中。1.3.3　SDA反应产物微孔板杂交检测[8]

1.3.3.1　SDA产物微孔板包被和预杂交　将上述沉淀的SDA产物加入包被液中,4℃包被过夜。漂洗后,加入预杂交液(5×SSC,5×Denhardt溶液,50mmol L PBS,0.2%SDS,

0.5mg ml变性鲑鱼精DNA,40%甲酰胺),55℃预杂交1h。

1.3.3.2　微孔板杂交　上述包被好的微孔板中加入预冷杂交液(5×SSC,5×Denhardt溶液,20mmol L PBS,10%硫酸葡聚糖,0.1mg ml变性鲑鱼精DNA,40%甲酰胺),加入生物素标记探针225ng孔,45℃杂交1h。

1.3.3.3　酶联吸附、底物显色　加入亲和素标记的辣根过氧化物酶,37℃作用10min,采用TM B显色系统37℃显色10min,2mol L H

2

SO

4

终止反应,自动微孔板酶标仪Micro-

Reader4Plus软件450nm读取吸光度值(D

450

)。

1.3.3.4　结果判读　用空白孔校零,读取各孔吸光度值。阴性对照D450应小于0.1,样品D450值阴性对照平均D450值大于

2.5判为阳性;否则判为阴性。

2　结果

2.1　钾离子浓度对SDA反应的影响

SDA反应体系中,加入不同浓度KCl(p H7.5)进行微孔板杂交,模板量为20ng,结果如图1。

图1　钾离子浓度对D450的影响

2.2　模板量对SDA产量的影响

见图2。

图2　不同模板量对D

450

的影响

2.3　不同对照组与样品组D

450

比较

SDA反应体系中,采用40mmol l KCl、模板量20ng,设立

不同对照组,其杂交信号D

450

的比较如表2。

195

第3期 韩延平,等.单引物耐热链替代扩增HBV X区方法的初步探讨

表2　不同对照组与样品组D

450

平均值比较

组 别D450平均值

空白对照组0.081

模板(+)酶(_)0.113

模板(_)酶(+)0.085

Bs o BⅠ(+)Bst(_)0.091

Bs o BⅠ(_)Bs t(+)0.198

样品组0.355

3　讨论

1992年由Walker等[1]第一次提出链替代扩增方法,根据限制酶Hin cⅡ在DNA的半磷酸硫酸化识别位点的未修饰链上打开缺口能力和5′※3′外切核酸酶缺陷的聚合酶能在缺口处延伸并替代下游链而设计的。SDA与PCR技术相比优势在于采用等温扩增,无需DNA热循环仪,同时操作简便,仅包括以下步骤:①靶DNA变性;②酶的添加;③水浴恒温反应。本研究旨在初步建立耐热SDA方法及探讨其扩增效率的影响因素。

引物设计是SDA扩增的基础。由于本文采用一条典型的SDA引物,仅能实现产物的线性扩增。引物的3′端为靶结合区,长度一般为11～14个核苷酸,在靶结合序列的5′端附加一个打开缺口的限制性内切酶识别位点;另外在5′端还附加有20个左右核苷酸保护碱基,除能确保限制酶打缺口效率,还能为聚合酶提供稳定的引发位点[9]。

SDA反应中对于限制性内切酶DNA聚合酶有一定的要求。DNA聚合酶需无外切酶活性。3′※5′外切酶活性使引物单链在引物中降解;5′※3′外切酶活性会使引物_靶序列杂交体的5′悬端水解。仅有少量限制性内切酶能用于SDA反应,如H in cⅡ、Hin dⅡ、A vaⅠ、NciⅠ、Fnu4HⅠ。本文采用的Bso BⅠ Bs t DNA聚合酶体系,Bs o BⅠ是AvaⅠ的同工酶,Bst DNA聚合酶去除了5′※3′外切酶活性。两种酶均由嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus s tearo ther mophilus)中提取,能在56～60℃表现较好的活性;与H in cⅡ exo_Klenow DNA聚合酶体系反应温度37～40℃相比能减少非特异性扩增反应。除此以外,该体系优于H in cⅡ exo_Klenow DNA聚合酶体系还在于:SDA 反应的限速步骤是限制性内切酶酶切后从切口处解离的速度。研究表明,H in cⅡ从缺口处解离速度为3.5min,而Bso B Ⅰ仅需26s。另外,反应体系还需优化限制性内切酶DNA聚合酶的浓度比[6,7]。

缓冲液的离子浓度对于SDA的反应效率关系密切。从本文结果看,K+是该反应必需的离子,可能为DNA聚合酶引发聚合反应所必需。当体系无K+存在时,杂交信号较低, D450<0.2。[K+]为20mmol L、40m mol L时,SDA均有较好的扩增效率;但浓度太高(>80mmol L)也不利于反应的进行。

模板拷贝数也是影响SDA反应效率的又一重要因素。随着靶分子拷贝数的增加,SDA产量也呈线性增加。本文对于单链DNA产物未经过变性包被于微孔板,采用亲和素_生物素系统对杂交结果进行检测,结果证实了典型单引物SDA 反应实现了对靶分子的扩增。

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(本文编辑　杨兆弘)

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(本文编辑　杨兆弘)

196军事医学科学院院刊　2002年9月第26卷第3期