单克隆抗体制备简要流程

制备单克隆抗体是复杂而费时的工作，整个技术流程如图：

单克隆抗体制备（免疫2-3月，总周期4-6月）

准备抗原

动物免疫选择免疫动物

Elisa测抗血清

细胞融合（融合剂:PEJ）

HAT培养基筛选杂交瘤细胞

筛选阳性细胞

（三天内做完流式）

阳性克隆并扩大培养细胞冻存

扩大培养收集上清

单克隆抗体纯化保存

1、抗原提纯与动物免疫：

选择BALB/c健康小鼠。如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫；可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。免疫3～4只小鼠，间隔一般2～3周，末次免疫后3～4天，分离脾细胞。2、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备

选择Sp2/0细胞株，将昆明鼠的腹腔细胞作为饲养细胞

3、细胞融合

将两种细胞混合后加入PEG（融合剂）使细胞彼此融合。其后用培养液稀释PEG，消除PEG的作用。注意：细胞比例、培养液成分、反应时间

4、有限稀释法筛选阳性株

筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株（一般稀释至0.8个细胞/孔）细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA 测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。

5、单克隆抗体的制备与保存

筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠，先用液体石蜡进行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，冻存。

6、单克隆抗体的纯化

硫酸铵沉淀法