GravityPLUS 3D细胞悬滴培养板操作手册
Product Manual
GravityPLUS? Kit
Product Manual PM001
Introduction
The G ravityPLUS? Kit 1 represents the most reliable, versatile and complete platform for the generation, long-term cultivation, obser-vation and testing of 3D microtissue spher-oids in 96 well format. The kit comprises the patented G ravityPLUS? Hanging-Drop Plate and the G ravityTRAP? Tissue Receiver and
Assay Plate, allowing convenient longer term cultivation, observation and assays
(≥28 days).
InSphero uses this platform for routine large-scale production of off-the-shelf assay-ready microtissues. For a list of available 3D microtissue models for efficacy and toxicology studies, please refer to our web site at https://www.wendangku.net/doc/ff14193383.html,/3DMicrotissues.
Advantages of the GravityPLUS? Kit:
1. Robust hanging-drop spheroid formation using GravityPLUS? Plate
2. Straightforward spheroid transfer to GravityTRAP? Plate
3. Easy long-term growth, assay and observation in the GravityTRAP? Plate
4. Protocols available for assays and analysis in GravityTRAP? Plate
1 The G
WO2007/098933A1, WO2010/031194A1 and US61/367,993.
Contents
Introduction 3GravityPLUS? Kit Components 5 GravityPLUS? Hanging Drop Plate 5 The GravityTRAP? Plate 6Generating 3D microtissues 8 Additional materials required 8 Preparation 9 Hanging-drop formation 9Transferring microtissues 12 Pre-wetting 12 Microtissue transfer 13Medium exchange in the GravityTRAP? Plate 15Analysis and assays in the GravityTRAP? Plate 16
Annex 1: Microscopy of microtissues 17Annex 2: Preventing evaporation 18Annex 3: Dosing and medium exchange in hanging drops
20Annex 4: Microtissue harvest 22Annex 5: Trouble-shooting guide
23Annex 6: Step-by-step protocol for NIH/3T3 microtissues
24
Version 2.0, Feb. 2013
Figure 1: Microtissue formation in the GravityPLUS? Plate and subsequent transfer to the corresponding non-adhesively coated wells of the GravityTRAP? Plate for further cultiva-tion and downstream applications.
GravityPLUS? Kit Components
GravityPLUS? Hanging Drop Plate
The complete GravityPLUS? hanging drop plate assembly consists of the following components :
1. Bottom plate (A) with reservoir (E)
2. GravityPLUS? Plate (raster plate) with 12x8-well strips (B)
3. Lid (C)
4. Channel – for evaporation-control liquid (D)
5. SureDrop? hanging drop 8-well strips (inserts, F)
6. Humidifier pads (delivered in bags with 5 pcs. each plus additional tweezers)
Figure 2
Microtissue production with the GravityPLUS? Plate is very simple. A cell suspen-sion is delivered from the top through the inlet funnels of the individual wells of the Gravity P LUS? Plate using a pipette or robotic liquid handler. At the outlets under the plate, hanging drops will form and the cells will form microtissues by gravity-enforced assembly within 2-4 days.
After formation, microtissues are transferred into the G ravityTRAP? Tissue Re-ceiver and Assay Plate. This format facilitates long-term maintenance, optical visu-alization, compound dosing and biochemical assays. If required, assays can also be performed directly in the GravityPLUS? Plate - see Annex 3.
The GravityTRAP? Plate
The G ravityTRAP? Plate (Tissue Receiver and Assay Plate) is a special non- adhesively coated 96-well microtiter plate. It is designed to receive and accomo-date microtissues for convenient long-term cultivation and analysis. Microtissues are positioned in an observation chamber at the bottom of each well, which pre-vents inadvertent aspiration and loss during medium exchange.
Biochemical assays as well as optical analytical methods such as bright field and fluorescence microscopy can be performed. The GravityTRAP? ensures that micro-tissues are centered in the optical viewing field which enables automated imaging
processes.
Figure 3: GravityTRAP? Tissue Receiver and Assay Plate – arrows indicating positioning pins for precise transfer of microtissues from the GravityPLUS? hanging drop plate.
Figure 4: HCT-116 coloncarcinoma microtissue cultured in GravityTRAP?. Picture acquisition with a Z eiss Axiovert25
microscope, 5× objective.
Preparation
1. Wipe the GravityPLUS? bag with 70% EtOH before opening
2. Carefully open the bag under sterile working conditions and take out the
Gravity P LUS? Plate assembly 3. Remove humidifier pad from bag using tweezers and place it in the reservoir (Fig. 2 - E). Soak the pad evenly with 15 ml of 0.5× PBS . Place the Gravity-PLUS? plate on the bottom plate (Fig. 2 - A)4. Trypsinize cells expanded in cell-culture flasks according to your standard pro-tocol 5. Count the cells
Prepare a cell suspension. Recommended cell concentration: For long-term growth profiling start with low cell numbers (250–500 cells per drop). If non-proliferating cells or rapid production of larger microtissues is required then start with 2500–25000 cells/40 μl.
Hanging-drop formation
6. Gently deliver 40 μl of cell suspension into each well of the GravityPLUS? plate.
It is easy to ensure tight contact between the pipette tip and the well inlet by applying a slight pressure to form the SureDrop? seal (Fig. 5). 7. Optional: Fill 2 ml sterile H 2raster plate (B) (see Fig. 2) for additional evaporation control.
Generating 3D microtissues
Generating 3D microtissues is a straightforward process that works with the vast majority of cell types capable of forming tissues in-vivo. In addition to the process overview in this chapter, Annex 6 illustrates the formation of NIH/3T3 mouse fibro-blast microtissues in detail as an example for your own process.
Additional materials required
1. Mammalian cells, either cell lines or primary cells
2. 3DInSight? Cell Line Maintenance Medium (InSphero, cat. no. CS-07-101-01)
3. Inverted microscope with a 5× objective or a 10× long distance objective with
a distance ring (see also Appendix 1)4. Cell counter, e.g. Neubauer chamber
5. 8- or 12-channel pipette (e.g. Viaflo, Integra Biosciences)
6. Medium reservoir for multichannel pipettes
7. For microscopic observation of the full G ravityPLUS? Plate, an additional
Gravity P LUS? bottom plate is recommended 8. Microplate centrifuge 9. Humidified CO 2 incubator
8. Place the lid (Fig. 2 - C) on the GravityPLUS? Plate
9. Place the GravityPLUS? Plate assembly in a humidified CO
2
incubator at 37°C 10. Assess microtissue formation regularly. After 4 days in culture most cell types
re-aggregate and form a compact spheroid
Figure 5: Filling GravityPLUS? wells. The pipette (8- or 12-channel) is positioned into the inlet of the well in an upright or slightly tilted orientation. It is important that the pipette tips Microtissue formation can be observed by inverted microscopy through the cut-out section of the humidifier pad in the bottom tray. For detailed instructions about
microscopy with the GravityPLUS? Plate please refer to Annex 1.
Figure 6: Microscopic images of microtissue formation of 500 HCT-116 cells visualized directly in the drop. (a) cells are located at the meniscus of the drop 30 min after seeding,
(b) first cell-to-cell contacts 1 day after seeding, (c) compactly formed microtissue at day
3 after seeding.
Transferring microtissues
For longer term cultivation and assays, transfer of microtissues from GravityPLUS? to the GravityTRAP? Plate is required.
IMPORTANT – Pre-wetting the wells of the GravityTRAP? according to the procedure below is required prior to transferring microtissues to ensure precise positioning in the center of the well
IMPORTANT - Perform all the following steps under sterile conditions
Pre-wetting
1. Prior to transfer, pre-warm the medium required for microtissue culture
2. Wipe the GravityTRAP? bag with 70% EtOH before unwrapping the plate
3. Open the bag under sterile working conditions and take out the GravityTRAP?
Plate 4. Apply 40 μl pre-wetting solution (serum-containing medium or PBS) to each
well by placing the tip far into the wells (avoid touching the well bottom). It is recommended to use a multichannel pipette (8- or 12-channel)5. Remove pre-wetting solution by placing the tip at the ledge of the upper cavity
Figure 7: Medium removal from GravityTRAP?.
Microtissue transfer
1. Place the raster plate of the GravityPLUS? system onto the GravityTRAP? by
positioning the three pins into the corresponding holes on the top surface of the GravityTRAP?. The drops under the GravityPLUS? system will then be per-fectly aligned with the wells of the GravityTRAP? underneath.2. Slowly (≤10 μl/sec) add 70 μl of a physiologic solution (medium or buffer)
through the inlet of the GravityPLUS? wells. The pipette tips should be in di-rect contact with the well inlets by simultaneously applying a subtle pressure with the pipette. The drops will fall into the GravityTRAP? Plate (Figure 8).3.
Figure 8: Microtissue transfer from GravityPLUS? into GravityTRAP?
transfer of the microtissues the GravityTRAP? is placed in a microtiter-plate centrifuge and spun for 2 min at 250× RCF.
4. To assure defined medium volumes in the wells, the solution in the wells may
be replaced by aspiration and addition of 70 μl of fresh medium. See next sec-tion for details on medium exchange.
Medium exchange in the GravityTRAP? Plate
The special GravityTRAP? design allows routine medium exchange for longer-term cultivation without the risk of microtissue loss. The ledge at the inside wall of the well serves as an anchoring point for the pipette tip.
1. Place the pipette tip at the ledge of the well (see Fig. 9, left)
2. Remove the medium at low pipetting speed (<30 μl/sec) by aspirating an ex-cess of volume. A minimal volume of ~5 μl medium will remain in the well
3. Add 70 μl of fresh medium by placing the pipette tip at the ledge (see Fig. 9,
right). Use a dispensing rate <50 μl/sec
Figure 9: Medium exchange in the GravityTRAP? Plate. Left: Medium remov-al with the pipette tip placed at the ledge of the well. Right:
Analysis and assays in GravityTRAP? Plate
The GravityTRAP? format allows for visual inspection of microtissues by an inverted microscope (similar to analysis of standard 2D cultures).
Biochemical Assays
Several validated biochemical assay protocols for microtissues in the G ravity-TRAP? Plate are available. Please see the support section of InSphero’s website: https://www.wendangku.net/doc/ff14193383.html,/support
Histology
Microtissues are amenable to analysis by histology. Please request our protocol TN006.
Fluorescent/luminescent microwell-plate-reader compatibility
Growth changes and profiles in tumor microtissues expressing GFP/RFP can easily be analysed using fluorescent plate readers (e.g., TECAN) since the signal intensity is stronger than with monolayer cultured cells.
Automated imaging
The GravityTRAP? is ideal for use in automated imaging equipment, such as the Annex 1:
Microscopy of microtissues in GravityPLUS? Plates
Microtissue formation, appearance and growth profiles can be assessed using an inverted bright-field microscope. A long-working-distance objective (LWDO), pref-erentially of 10× magnification, is required for proper imaging.
Depending on the minimal gap (D1) between the objective plane and the micro-scope stage, the specifications of the objective should include a working distance of minimally 11.5 mm+D1. As long-working-distance objectives are commonly shorter in height than regular objectives, a distance ring (R) will be required to elevate the long working distance objective plane to the level of other regular ob-jectives installed on the objective revolver.
If microscopic as-
sessment of all 96
wells is desired an
additional empty
bottom plate is re-
quired.
Annex 2:
Preventing evaporation from GravityPLUS? Plates
As previously described, a buffer-soaked fleece (humidifier pad) provided with the GravityPLUS? system is placed in the bottom tray to ensure optimal humidity for minimal evaporation from the hanging drops.
For incubators with poor humidity control, hypotonic buffer solutions (e.g. 0.2× PBS) may be applied to the humidifier pad.
For incubators with good humidity control (>95% of rel. humidity), buffers of high-er ionic strength may be used (e.g. 0.5–0.75× PBS).
For improved humidity control in low humidity incubators, the channel (D) within the raster plate (B) can be filled with 2 ml of sterile water (see Fig. 2).
Procedure to assess evaporation rates of the GravityPLUS? plate
The results described below are obtained following this procedure in an incubator with controlled humidity of >95%.Set up ? 40 μl medium (DMEM/10% FCS) applied to each well
2O applied into the channel
The plate is placed into a CO 2 incubator for 3 days. The evaporation rate is calcu-lated from loss of the drop weight during the incubation period.Results
The average daily evaporation rate per well was 0.35 ± 0.32 μl/well. The wells of the rim were more exposed to evaporation with a rate of 0.52 ± 0.41 μl/day while central wells lost 0.25 ± 0.19 μl per day.Conclusions / recommendations
Due to the nature of hanging drops with a high exposed surface/volume ratio, evaporation is a critical factor for long-term cultures. InSphero recommends trans-fer of microtissues to the GravityTRAP? plate for long-term cultivation, observa-
tion and assays.
Annex 3:
Dosing and medium exchange in hanging drops
Compound addition
This following section describes the procedure of compound treatment in the G ravityPLUS? Hanging-Drop Plate without the recommended transfer into the GravityTRAP? Plate . A two-step dilution of the compound (e.g. 1000× working concentration in DMSO) first in medium (1:250) and then in the drop (1:4) is ex-emplified:
1. Ideally use an 8-channel pipette to aspirate medium to obtain a drop volume
of 30 μl. Medium removal should be done at low pipetting speed. 2. Add 10 μl of a 4× concentrated solution of your compound in medium.
NOTE: Depending on the humidity of the incubator some medium may evaporate from the drops. In case of low incubator humidity, it is recom-mended to study the evaporation rate for your specific incubator (an ex-ample is given in Annex 2).Addition of assay reagents
For reagent addition it is recommended to add 20 μl of the 2× concentrated re-
1. Use an 8-channel pipette to aspirate medium to obtain a drop volume of 20 μl.
Medium removal should be done at low pipetting speed.2. Add 20 μl of your 2× concentrated reagent and mix with moderate pipetting
speed (~20 μl/sec) for reagents that require lysis of the microtissue.3. Transfer the lysed tissue into the analysis plate by complete aspiration. For
non-lytic assays, tissue transfer for further analysis is recommended as de-scribed below. Medium exchange/sampling
Depending on the cell types and initial size of the microtissues the first medium exchange should be performed at 2-6 days after cell seeding. Microtissues are located at the bottom of the drop due to their higher density. This allows for the aspiration of culture medium through the inlet without removing the tissue, facili-tating medium exchange and medium sampling.
1. Ideally an electronic 8-channel pipette is used to aspirate medium at con-trolled, low pipetting speed (<10 μl/sec).
2. Up to 50% of the medium volume can be exchanged (e.g. if 40 μl starting
volume was used up to 20 μl can be removed).3. G ently re-apply fresh medium to each well of the G ravityPLUS? system by
exchange is required.
Annex 4: Annex 5: Trouble-shooting guide
? CO 2 incubator 37°C
? Inverted phase-contrast microscope ? 15 ml Falcon tube
? Sterile multichannel medium reservoir
?
Multichannel pipette (e.g. Integra Viaflo 8-channel pipette, InSphero, cat. no. IS-001-01; if not available, a single-channel pipette can be used as well)
NIH/3T3 expansion
Perform all following steps under aseptic conditions under a laminar flow bench.
1. Ensure that all cell-culture material is in place and labeled
2. Prepare T75 flask by adding 5ml of DMEM+10%FCS
3. Fast thaw one vial NIH/3T3 at 37°C in the water bath
4. Use the 5 ml pipette and aspirate 5 ml medium
5. Use the filled 5 ml pipette and aspirate the thawed cell suspension from the
cryo vial 6. 7. cells into the T75 flask
Annex 6: NIH/3T3 microtissue formation – A step-by-step protocol
The following protocol describes the production of NIH/3T3 (mouse fibroblast cell line) microtissues with the GravityPLUS? Hanging-Drop Platform.
Materials
? Cryopreserved NIH/3T3 mouse fibroblasts, ideally 1×106 cells per vial (ATCC CRL-1658?)
? Expansion medium: DMEM (PAA, cat. no. E15-883) supplemented with10% FCS (PAA, cat. No. A15-151)
? Trypsin EDTA (10×), 0.5%/0.2% in DPBS (PAA, cat. no. L11-003)
? 3D InSight? Cell Line Maintenance Medium (InSphero, cat no. CS-07-101-01)? Cell-culture flasks T75 (Greiner, cat no. 658175)? GravityPlus? kit (InSphero, cat no. CS-06-001)? Sterile phosphate buffered saline (PBS)? Neubauer chamber
11. Centrifuge for 2 min at 200 RCF 12. Control pellet and aspirate supernatant
13. Re-suspend cells in 3D InSight? Cell Line Maintenance Medium
14. Determine cell number with the Neubauer chamber (or alternative method).15. Adjust cell number with 3D InSight? Cell Line Maintenance Medium to a den-sity of 1.25×105 cells/ml corresponding to 5000 cells/drop (40 μl) or resulting microtissue; prepare a sufficient amount of cell suspension (5 ml per Gravity-PLUS? Plate).16. Transfer cell suspension to a medium reservoir 17. Generate hanging drops as described on page 9
18. Incubate for 3 days prior to transfer into the GravityTRAP? Plate as described on
page 12
8. Place the cell-culture flask into the incubator
9. After 24 hours incubation replace the medium and check under the micro-scope if cells have adhered on the plastic surface 10. After reaching 70-80% confluence (approx. 48 h) cells are ready for microtis-sue production
NIH/3T3 microtissue formation
Perform all following steps under aseptic conditions under a laminar flow bench.
1. Prepare the GravityPlus? System as described on page page 9
2. Take the T75 flask with the NIH/3T3 cells out of the incubator
3. Remove medium with the aspiration pipette
4. Add 10 ml PBS
5. Remove PBS
6. Add 2.5 ml Trypsin EDTA (1×)
7. Incubate for 5 min
NIH/3T3 microtissue stability over 21 days in the GravityTRAP? Plate.
GravityPLUS? Kit Manual
InSphero AG
Wagistrasse 27
CH-8952 Schlieren
Switzerland
https://www.wendangku.net/doc/ff14193383.html,
Phone: +41-44-515049-0
e-mail: support@https://www.wendangku.net/doc/ff14193383.html,
? 2013, InSphero AG, Switzerland.
All technical information subject to change.
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or human therapeutic or diagnostic use unless otherwise stated.
人胚胎干细胞研究的临床意义
人胚胎干细胞研究的临床意义 [关键词] 人胚胎干 健康讯: 吕广秀 20XX14上海市解放军第85医院儿科1998年11月，美国James和John Gearhart领导的2个科学小组分别发表论文阐述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞（ES cells）和胚胎生殖细胞系（EG cells）［1，2］。ES细胞最引人关注的2条特征是:ES细胞能在体外条件下生长，在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性，即发育成成体中各种细胞的能力。ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究，如果克隆技术可以从患者自体组织中获得干细胞，则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基因运载系统。总之，其前景十分广泛。 1 胚胎干细胞的一般定义特征考虑到ES或EG细胞的特性，可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的，其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细胞所特有，或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能性干细胞所应具有的特征如下:（1）来源于一个全能性的细胞群体;（2）具有正常的细胞核型;（3）具永生性，在胚胎状态下能无限制的分裂;（4）培养的细胞株在体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonic tissues）和分属所有3种胚层的体细胞。但到目前为止，所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因，来源于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此，如果来源于人的细胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义，我们就认为它属于ES细胞。需要指出的是，要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是十分困难的，因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中，一些组织都是十分罕见的。 2 胚胎干细胞的最新研究James Thomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能
细胞培养实验技术大全
细胞培养实验技术大全 第一章细胞培养的基本原理与技术 现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。 第一节体外培养的概念 一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 二、体内、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。 第二节细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。 二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则
动物细胞培养基本操作
实验一动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。 细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等 为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。 本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。 三、实验材料、用品
干细胞临床试验研究管理办法(试行)
附件1 干细胞临床试验研究管理办法（试行） （征求意见稿） 第一章总则 第一条为保证干细胞临床试验研究过程规范，结果科学可靠，保护受试者的权益并保障其安全，根据《中华人民共和国药品管理法》、《医疗机构管理条例》和《药物临床试验质量管理规范》等相关法律法规，制定本办法。 第二条本办法所指干细胞是一类具有不同分化潜能，并在非分化状态下自我更新的细胞。干细胞临床试验研究，是指在临床前研究基础上，应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后回输（或植入）人体，用于疾病预防和治疗的临床试验研究。这种体外操作包括干细胞在体外的分离、纯化、培养、扩增、修饰、干细胞（系）的建立、诱导分化、冻存及冻存后的复苏等过程。用于干细胞治疗的干细胞主要包括成体干细胞、胚胎干细胞以及诱导的多能性干细胞。成体干细胞包括自体或异体、胎儿或成人不同分化组织，以及发育相伴随的组织（如脐带、羊膜、胎盘等）来源的造血干细胞、间充质干细胞、各种类型的祖细胞或前体细胞等。 第三条干细胞临床试验研究必须具备充分的科学依据，其预防和治疗疾病的预期优于现有的手段，或用于尚无
有效干预措施的疾病，优先考虑威胁生命和严重影响生存质量的重大疾病，以及重大医疗卫生需求。 第四条干细胞临床试验研究必须在干细胞临床研究基地进行，干细胞临床试验研究基地由卫生部和国家食品药品监督管理局组织进行遴选和确定。 第五条干细胞临床试验研究基地（法人单位）是干细胞临床试验研究的责任主体。申报单位对干细胞制剂质量及相关研究活动负责。 第六条干细胞临床试验研究应当按照《药物临床试验质量管理规范》要求，遵守以下原则： （一）符合临床试验研究伦理原则，保护受试者、捐献者生命健康权益； （二）符合技术安全性、有效性原则，即风险最小化； （三）符合干细胞制剂质量要求的原则； （四）认真履行有效知情同意的原则； （五）有益于促进公众健康的原则； （六）干细胞临床试验研究透明化原则； （七）保护个人隐私的原则。 第七条开展干细胞临床试验研究，不得向受试者收取费用，不得市场化运作,不得发布干细胞治疗广告。
人胚胎干细胞的研究发展
人胚胎干细胞的研究发展 摘要：叙述了人胚胎干细胞（hES细胞）的研究现状，并对hES 细胞的研究进展及其应用前景等全面综述。 关键词：人，胚胎干细胞，原始生殖细胞，全能性，多功能性干细胞(Stemcell)是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，即干细胞保持未定向分化状态和具有增殖能力，在合适的条件下或给予合适的信号，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，又称其为“万用细胞”。干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织。根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。1998 年Thomson等第一次从胚胎中分离培养了人体胚胎干细胞(hES C)，并随后发现它能分化为体内几乎所有的细胞后，由此掀起全球范围内的hESC研究热潮。 人胚胎干细胞的生理意义：人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官，因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。 1 人胚胎干细胞的来源 胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团或早期胚胎的原始生殖细胞是一大类未分化的二倍体全能干细胞，具有无限增殖、自我更新
和多向分化的潜能。 2 人胚胎干细胞的生物学特性 (1)具有分化的多潜能性，在体外可诱导分化出属于三个胚层的分化细胞; (2)具有种系传递功能; (3)具有长期的未分化增殖能力，细胞不仅能分化成各种器官组织，而且能增殖生成新的保持同种性状的ES 细胞; (4)易于进行基因改造操作; (5)保留了正常的二倍体的性质且核型正常; (6)胚胎干细胞端粒酶活性呈阳性,具有维持端粒长度,保持干细胞增殖能力的重要作用。 3 人胚胎干细胞的培养 (1) 常规培养液常用的基础培养基有改良伊格尔培养基(MEM)α、达氏修正依氏培养基(DMEM)、组织培养基(TCM)199、F12 等合成培养基，以DMEM应用最为普遍。它的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质。 (2) 无血清培养基血清中含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利与ESC未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液’进行ESC的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，实验表明ESC增殖旺盛，且能保持未分化状态，并认为无血清培养基优于血清培养基。但也有学者认为含血清培养液更利于胚胎干细胞向中胚层细胞分化,是因为血清中富含中胚层诱导因子,
干细胞知识产品手册
干细胞知识小册子 一、干细胞的美好未来 二、干细胞-------神奇的“万能细胞” 三、干细胞衰老与疾病的发生 四、干细胞与疾病的治疗 五、干细胞与抗衰老 六、干细胞--无创逆龄，定格青春 七、Q＆A 一、干细胞的美好未来 2017年8月27日，湖南卫视原创科技栏目《我是未来》邀请干细胞领域大咖、中国科学院广州生物医药与健康研究院院长裴端卿教授等嘉宾，聚焦干细胞技术的发展及应用，为大家带来了一次生动趣味的生命科技知识科普。节目中，裴端卿教授以浅显易懂的语言，向大家着重介绍了什么是干细胞，干细胞的作用以及未来能给人类带来哪些前所未有的变化，让我们见识到了科学技术的发展带给生命的无限可能性。人们未来都可以活到100岁，120岁，150岁，200岁……这些都是干细胞带给我们的未来！ 1、细胞衰弱老化---衰老和死亡的真相 我们的身体是由数十万亿（40-60万亿）亿细胞构成的，随着时间的迁移，我们人体里面的细胞开始老化，这个衰老的过程，会使器官与组织在功能上的衰退，导致机体的死亡。 生命的起始从受精卵的分裂形成开始，胚胎干细胞分化发育成身体的各个组织器官，随着时间的迁移，胚胎干细胞彻底消失，人体内的干细胞种类只有成体干细胞。成体干细胞的最大作用就是在机体受到损伤时进行修复，替代凋亡的组织细胞。随着年龄的增长，成体干细胞的功能慢慢丧失，数量也逐渐减少，到最后完全消失，生命也就走向了终点。 2、干细胞——“长生不老”的秘诀 所谓干细胞，就是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生人体各种组织器官的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。
随着时间的迁移，人体细胞会开始老化，而衰老的过程会造成器官与组织在功能上的衰退，那么延缓细胞的衰老出发点就是干细胞，干细胞是生命的起源细胞。大量科学研究发现，干细胞的分化是一个可逆的过程，如果人体细胞能够逆转到干细胞的水平，那么人类的寿命将得以延长。 3、干细胞——再生医学的源泉 除了延长寿命，干细胞还可以培育和再生器官，这就意味着当人们身体的某一器官出现了问题，都可以用再生器官进行替换。 利用干细胞具有的向机体其他细胞分化转变的潜在能力，再生性和再造性地修复各种变性、坏死性、损伤性、代谢性和退行性病变，恢复病损或退化组织器官结构和功能的一系列临床干细胞移植治疗技术和再生保健技术被称为再生医学。通俗理解，再生医学就是让人类的组织或器官再生。 节目现场，教授们展示了由诱导多能干细胞培育出来的牙齿组织，现场的每一位观众都惊叹不已。教授们表示，目前我们可以通过牙齿的再生来了解细胞如何变成组织、组织又怎样变成器官，将来再发展到诸如肝脏的再生、肾脏的再生等等，可以在临床上得到应用。他们认为当拥有这些技术之后，人们未来都可以活到100岁，120岁，150岁，200岁……这些都是干细胞带给我们的未来。 4、我们没有理由质疑美好的未来 干细胞技术是攻克传统医学所不能及的重大疾病的一种全新医疗技术，是当今和未来再生医学的研究热点和发展方向，已被列入“人类十大科技进展”之首和国家重大科技专项。科学给予人们希望，而这种希望又不断激励着人们追求更美好的生活。随着科学界对于干细胞领域的深入研究，未来干细胞在治疗疾病与健康保障方面将有更大的作为。干细胞领域研究的不断前进将为人类带来更加美好的未来。 二、干细胞-------神奇的“万用细胞” 干细胞具有再生各种组织器官潜在功能，所以，其在医学界又被称为“万用细胞”。也正是因为干细胞这一特点，使其成为了21 世纪再生医学的基础，更是成为当前科技的前沿和热点。理论上来讲，干细胞可用于多种疾病的治疗，如糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭等。也正是干细胞这种潜在的价值，引起了各国学者研究探索的兴趣。
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液
细胞培养实验技术手册
实验记录 24/2/2014 一、细胞培养 一、培养基的配制 a. RPMI 1640 1×（with L-glutamine）类培养基组分：RPMI ，10%FBS（胎牛血清），双抗生素（penicillin，盘尼西林（青霉素），streptomycin，链霉素）； 配制方法：500 ml RPMI(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素 b. DMEM 1×类培养基组分：DEMI，10% FBS，双抗生素； 配制方法：500 ml DMEM(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素 二、培养细胞RNA的提取 1.从培养箱中拿出6孔板（每孔培养2 ml），吸出培养液； 2.PBS清洗；用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中（枪头不要触碰培养板，防止交叉污染），用1 ml枪吹匀清洗（把培养板倾斜，吸溶液指最高处打出）。重复以上操作一次。 3. 每孔中加1 ml Trizol ，吸出放-80℃冰箱冷冻。 三、培养细胞DNA的提取 1.从培养箱中拿出6孔板（每孔培养2 ml），吸出培养液； 2.PBS清洗；用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中（枪头不要触碰培养板，防止交叉污染），用1 ml枪吹匀清洗（把培养板倾斜，吸溶液至最高处打出）。重复以上操作一次。 3. 向培养板中加酶消化（时间较长，放进培养箱，看到有白色悬浮后取出），取出加DMEM类培养基； 4. 吸出至1.5 ml 离心管，3600 rpm，4 min离心； 5. 吸出上清（不要触及沉淀），加PBS 1ml清洗，3600 rpm，4 min离心； 四、常用细胞系（人） 名称细胞类型来源核型培养液 A431 上皮型表皮细胞肿瘤非整倍体（76，XX）DMEM+10%FBS HeLa 上皮样宫颈癌非整倍体（81-83，XX）MEM+NEAA 10%FBS Hep G2 上皮样肝细胞癌非整倍体（55，XY）MEM+NEAA 10%FBS MEM：极限必需培养液（Eagle）；NEAA：非必需氨基酸；DMEM：Dulbecco’s MEM改良培养液；RPMI：Roswell Park Memorial 研究所；BrdU：5-溴脱氧尿苷；APRI：腺苷磷酸核糖转移酶 实验室除snu系列与国产7721用1640培养基，其它用DMEM培养基。 五、原代培养----肝细胞 1.切除乳鼠肝脏组织放进小烧杯中，用PBS或培养液漂洗2-3次，去除血污； 2.加少量培养液，用剪子把组织剪碎，1 平方mm左右，再用吸管吹打； 3.加含10%小牛血清的1640培养液，制成均匀的细胞悬液，移入培养瓶，将组织块放在培养瓶底部，采用薄层营养液培养法，盖上瓶盖。 4.换液，只将旧的培养液吸弃，换上新的培养基。 六、传代培养 1.显微镜观察是否需要传代 细胞生长良好：上清液清亮，无悬浮物，折光性好，均质而透明，胞膜完整，胞内颗粒少，无空泡和脂滴。细胞生长不良：悬浮物多，发差增大，胞膜不完整，胞质中颗粒多，出现空泡和脂滴。
细胞培养试剂及操作流程
实验规范化流程 一、细胞培养所需 1、10%FBS 1640培养液。 2、10%FBS DMEF/12培养液。 3、10%FBS DMEM/High Glucose 培养液。 4、PBS ：商品化的粉末，一袋溶于2L 去离子水中，高压后4℃保存。 5、胰酶 6、冻存液：10%DMSO 、>10%FBS ，其余成分为1640 7、真核抗生素： G418: 50mg/ml MDA-MB-231 800ug/ml MCF-7 800ug/ml SK-BR3 100ug/ml T47D 400ug/ml) 嘌呤霉素（Puromycin ）:10mg/mL 、 MCF-7 4ug/ml T47D 1ug/ml MDA-MB-231 5ug/ml 潮霉素（Hygromycin B ）:50mg/mL T47D 200ug/ml MDA-MB-231 800ug/ml MCF-7 50ug/ml 8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素）（使用浓度：1%原液） 环丙沙星 左氧氟沙星（储存浓度5mg/ml ，使用浓度5ug/ml ） 9、细胞因子：IL-6、EGF （10ug/ml ） 10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度50Mm,使用浓度0.01mM ） 一、细胞培养相关技术 1、细胞复苏 准备：37℃水浴锅、培养液、15ml 离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程： （1）将细胞从-80℃或液氮取出，遵”慢冻速溶“的原则，迅速在37℃下使其液化。 （2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到15ml 离心管内。 （3）将离心管以1000rpm 转速离心5min 。 （4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液6ml ，重选吹匀后转移到细胞培养瓶或培养皿，放入37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。 2、细胞传代
干细胞临床试验研究项目管理办法试行实施细则
干细胞临床研究管理办法（试行） 第一章总则 第一条为规范和促进干细胞临床研究，依照《中华人民共和国药品管理法》、《医疗机构管理条例》等法律法规，制定本办法。 第二条本办法适用于在医疗机构开展的干细胞临床研究。 干细胞临床研究指应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后输入（或植入）人体，用于疾病预防或治疗的临床研究。体外操作包括干细胞在体外的分离、纯化、培养、扩增、诱导分化、冻存及复苏等，不包括基因水平的操作。 第三条干细胞临床研究必须遵循科学、规范、公开、符合伦理、充分保护受试者权益的原则。 第四条开展干细胞临床研究的医疗机构（以下简称机构）是干细胞制剂和临床研究质量管理的责任主体。机构应当对干细胞临床研究项目进行立项审查、登记备案和过程监管，并对干细胞制剂制备和临床研究全过程进行质量管理和风险管控。 第五条国家卫生计生委与国家食品药品监管总局负责干细胞临床研究政策制定和宏观管理，组织制定和发布干
细胞临床研究相关规定、技术指南和规范，协调督导、检查机构干细胞制剂和临床研究管理体制机制建设和风险管控措施，促进干细胞临床研究健康、有序发展;共同组建干细胞临床研究专家委员会和伦理专家委员会，为干细胞临床研究规范管理提供技术支撑和伦理指导。 省级卫生计生行政部门与省级食品药品监管部门负责行政区域内干细胞临床研究的日常监督管理，对机构干细胞制剂和临床研究质量以及风险管控情况进行检查，发现问题和存在风险时及时督促机构采取有效处理措施;根据工作需要共同组建干细胞临床研究专家委员会和伦理专家委员会。 第六条机构不得向受试者收取干细胞临床研究相关费用，不得发布或变相发布干细胞临床研究广告。 第二章机构的条件与职责 第七条干细胞临床研究机构应当具备以下条件： （一）三级甲等医院，具有与所开展干细胞临床研究相应的诊疗科目。 （二）依法获得相关专业的药物临床试验机构资格。 （三）具有较强的医疗、教学和科研综合能力，承担干细胞研究领域重大研究项目，且具有相对稳定、充分的项目研究经费支持。 （四）具备完整的干细胞质量控制条件、全面的干细胞临床研究质量管理体系和独立的干细胞临床研究质量保证
2020年中国的生命科学(干细胞篇)
2020年中国的生命科学（干细胞篇） 【字体：大中小】https://www.wendangku.net/doc/ff14193383.html, 时间：2010年1月18日0 来源：生物通 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 摘要：以10年作为一个周期展望未来正在流行，正值2010年，21世纪的头10年刚过去，这10年中国不仅经济取得巨大的发展，生命科学也精彩无比，然而这只是生命科学精彩序幕的开始，更精彩的演绎且看下个10年。 生物通报道，以10年作为一个周期展望未来正在流行，正值2010年，21世纪的头10年刚过去，这10年中国不仅经济取得巨大的发展，生命科学也精彩无比，然而这只是生命科学精彩序幕的开始，更精彩的演绎且看下个10年。 无论是经济、国防甚至是科技领域，不少来自国外的声音都提出中国将称霸的口号！正如笔者不久前看的一篇警世文章中提及的一般，看GDP不能仅看数量，更应该看质量，我们看到中国这些年在科学领域SCI文章的数量的同时也该看到质量，具体就不赘述（有兴趣请看上一篇文章：2020年中国的生命科学世界）。 本篇文章我们将谈谈2020年中国可能在生命科学哪些领域取得可观的成绩。 干细胞 为什么干细胞要放在第一个谈呢？不可否认地，干细胞是目前基础研究、再生医学研究领域中最热门的话题。就连对生命伦理要求严苛的美国、欧洲各国都忍不住克服重重阻碍，企图在干细胞研究领域取得长足的发展。
从美国解禁胚胎干细胞研究，到NIH批准多株胚胎干细胞系成为合法研究株可窥见一斑，更有甚者，不少科学家认为如果再不解禁，美国可能在干细胞领域失去第一的地位，在科技发展日新月异的年代，再要追赶恐怕望尘莫及。 此外，美国不仅在基础研究方面解禁了胚胎干细胞，在临床上，2009年FDA 批准了2个临床胚胎干细胞试验开展计划。这些都说明，美国在胚胎干细胞领域准备大展拳脚。 除了传统的胚胎干细胞，干细胞领域还包括一种可规避伦理问题的新领域：iPS（诱导多能干细胞）。iPS创始人之一James Thomason就是来自美国威斯康辛大学麦迪逊分校的。这个只用成体细胞就能诱导类胚胎干细胞的技术成为干细胞领域的新星。 中国的2020年 干细胞领域的重要性不言而喻，如果你留意，看看2009年新立项的973及重大研究项目名单就能发现问题。 在2009年973项目中，干细胞领域就是立项最多的一个。“973计划”，意味着国家重点基础研究规划项目。每次期限为5年，从2010年到2020年的这头5年，干细胞就占有举足轻重的地位，不难想象2020年，干细胞一定会取得长足的发展。 基础研究方面 北大的邓宏魁教授，广州生物医学与健康研究院的裴端卿教授，中科院动物所的周琪教授，NIBS的高绍荣教授等等，这些干细胞领域内的前沿科研工作者在2008年、2009年已经取得了不错的科研成绩。
小鼠胚胎干细胞培养体系的建立
第19卷第2期 江西农业大学学报 V o l.19,N o.2 1997年6月 A cta A gricu ltu rae U n iversitatis J iangx ien sis June,1997 α 小鼠胚胎干细胞培养体系的建立 汪河海1 刘红林2 范必勤1 钟 卉3 丁家桐4 (1 江苏农科院牧医所,南京 210014;2 南京农业大学动物科技学院,南京 210059;3 南京铁道医学院,南京 210009;4 扬州大学农学院动物科学系 225009) 摘 要 通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素,建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系,并建成小鼠ES细胞系。 关键词:小鼠;胚胎干细胞;培养体系;ES细胞系 中图分类号:S865.1 胚胎干细胞又称ES细胞(Em b ryon ic Stem Cells)。其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态,并具早期胚胎细胞发育的全能性。哺乳动物的ES细胞系自Evan s和Kaufm an(1981)首次建立以来[1],引起人们高度的重视,并被广泛地用于动物发育遗传学的基础理论研究和转基因动物的生产实践。但ES细胞系要在体外克隆成功,必须有成纤维细胞或STO细胞饲养层的支持[2],为建立有效的哺乳动物ES细胞体外培养体系,本文就影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素做初步探讨,为今后进一步开展研究奠定基础。 1 材料和方法 111 动物准备 选3～4月龄的性成熟的昆明鼠,母鼠自然发情或超排后与公鼠交配,第2天早晨检查阴道栓,见栓查为发情受精。妊娠至一定日龄后取其胚胎或胎儿用于分离囊胚内细胞团细胞或制备胎儿成纤维细胞饲养层。 112 溶液的配制 按日本学者管原七郎的配方配制D PB S液,胰蛋白酶溶液、DM E M液及ES细胞培养液(配方略)。 113 胎儿成纤维细胞饲养层的制备 α
细胞实验操作流程
细胞冻存、复苏及传代操作流程 1. 试剂与仪器： 1.1 试剂 PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 胰蛋白酶-EDTA溶液：Gibco公司，货号15400054 100 mL； 青链霉素：Gibco公司，货号15140-112 100 mL； FBS：Gibco公司，货号10091-148 500 mL； DMEM （4.5g/L glucose）培养基：CORNING公司，货号10-013-CVR 500 mL；RPMI 1640 ：CORNING公司，货号10-040-CVR 500mL； DMSO：SIGMA公司，货号：D8418； PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 1.2 仪器 生物安全柜： 离心机： 37℃恒温水浴箱： -80℃冰箱： 4℃冰箱： 荧光倒置显微镜： 37℃恒温培养箱： 液氮罐： 2、实验方法： 2.1 细胞冻存 配制含10% 体积DMSO的冻存培养液（90% FBS+10% DMSO或70%培养基+20%FBS+10%DMSO），冻存盒室温放置。 将正常生长的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6 cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入消化液体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离
心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬细胞，1mL分装于冻存管中，做好标记。 悬浮细胞收集细胞培养液于15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬，1 mL分装于冻存管中，做好标记。 将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃过夜，第二天转入液氮中长期保存。2.2 细胞复苏 从液氮罐中取出冻存管，快速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，在安全柜中，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到15 mL离心管中（15 mL 离心管中已事先加入4 mL培养基）混匀，800 rpm，离心5 min，弃去上清液，加入含10%血清的培养液重悬细胞，根据离心后的细胞沉淀，将细胞培养在10 cm 皿或6 cm皿的培养皿中（一般选用6 cm皿）37℃培养箱静置培养。次日更换1次培养液，继续培养。 2.3 细胞传代 状态良好的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入胰酶体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入1-2ml培养基重悬细胞，吹打均匀后根据细胞生长速度1瓶传2瓶或1瓶传3瓶，补齐培养基（6cm皿加5ml，10cm皿加10ml）后放入37℃培养箱继续培养。 悬浮细胞在显微镜下观察，健康的细胞干净而透明，核清晰可见，静置培养时常见小细胞团。 ①若细胞状态好，培养基干净而无明显颗粒物沉淀，可直接1:2或1:3分瓶传代培养。 ②若细胞有碎片，培养基中颗粒物多，则需收集细胞培养液于15ml离心管中，600rpm离心5min，去上清，加入适量完全培养基重悬，轻柔吹打混匀后，根据细胞生长速度，1:2或1:3传代培养。 3、注意事项 1）细胞一旦染菌后直接舍弃并检查所有试剂耗材是否污染，如细胞样本非常
胚胎干细胞培养SOP
胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP) 一、细胞 多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡 1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。 2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。 3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。 4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。 5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。 二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。 培养基 ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500ml。 贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST ESGRO 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤
细胞培养知识2
细胞培养基础知识 细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。 5、合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。 细胞培养基种类与基本成分
细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。 1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质： 氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应臵于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。 碳水化合物 碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。 无机盐 培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ～320
哺乳动物细胞培养手册
实用哺乳动物细胞培养手册 细胞培养基本概念 细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。 细胞培养目的与用途 1、科学研究：药物研究开发与基础研究 药物研究与开发 (1) 新药筛选：如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。 (2) 疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 (3) 基因工程药物研究与开发：如干扰素研究与开发，细胞生长因子研究与开发等。 (4) 细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开发，人参皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究与开发。 (5) 单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体，治疗用单克隆抗体。 基础研究 (1) 药物作用机理 (2) 基因功能 (3) 疾病发生机理 2、生物制药 (1) 疫苗生产：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 (2) 基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素、粒细胞生长因子、胸腺肽等 (3) 诊断用和药用单克隆抗体生产 (4) 细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等 细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 2 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度
胚胎干细胞体外培养.
胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
干细胞保健产品手册.doc
肌体抗衰产品说明 一、概述 安徽安龙科技有限公司（以下简称“安龙基因”）是清华大学施一公院士的支持下，由安龙生命科学基金和清华大学医学院共同成立的高科技生物医药企业。依托清华大学医学院强大的技术力量和平台优势，安龙基因已开发完成一系列应用于临床检测、疾病风险评估以及细胞保健等产品。2015年始，先后成立了北京安龙、安徽安龙、银川安龙、重庆安龙、潍坊安龙、安龙临检和安龙智造等分支机构，逐步开启全国化产业链布局。 二、干细胞产品 名称：肌体抗衰产品 人体的衰老，主要是因为组织细胞的老化而导致器官功能的衰退。脐带间充质干细胞具有神奇的定向分化和自我增殖能力，随血液到达全身各器官后，即可分化成相应新的组织细胞并更新衰老的细胞，恢复身体机能从而达到抗衰老的效果。 功效主要表现为抗衰功能，具体如下表所示
三、产品说明 脐带间充质干细胞 （Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs） 1 产品简介 脐带为连接胎儿和胎盘的管状结构，是胎儿和母体的血液间进行CO2和O2交换、代谢废物和营养物质交换的通道，同时一些激素和抗体等也通过脐带从母体传递给胎儿。脐带在羊膜包裹着的脐动脉、脐静脉之间充满着的疏松、凝胶状的黏膜组织，被称为华通氏胶。脐带间充质干细胞可由华通氏胶洗脱、分离出来。 2 产品特性 （1）可塑性：具有多能干性，在特定条件下，能直接参与组织器官的损伤修复和功能恢复。（2）旁分泌作用：能改善损伤处微环境，促进神经细胞的再生及修复，调节细胞免疫生物学活性。 （3）无免疫排斥，移植无需配型。 （4）脐带属于新生儿产后废弃物，没有伦理学问题。 3 脐带间充质干细胞的优点 （1）原始祖性相对更接近于胚胎干细胞，具备较强的增殖分化能力 （2）较易于分离，相对数量较多，纯化度较高 （3）没有潜伏性病毒和病原微生物污染 （4）体外扩增时培养体系能够统一，利于质控，也可制成冷冻种子细胞 4 产品技术优势 （1）运用自主研发的UC-MSCs细胞培养体系，一周内细胞可达5×107以上 （2）体外增殖严格控制在4代以内 四、适应人群 1.亚健康、高压力人群 2.预防衰老，维持机体年轻化的人群 3.免疫能力下降的人群 4.内分泌紊乱及性功能衰退人群 5.心血管系统功能退变人群 6.内脏器官功能退化人群 7.器官功能衰退骨骼运动系统退变人群 五、禁忌人群 1.高度过敏体质或者有严重过敏史者 2.休克或多脏器功能衰竭者 3.恶性肿瘤患者 4.全身感染或局部严重感染者 5.传染病患者 6.染色体或基因缺陷者 7.怀孕期、哺乳期的妇女