中性粒细胞分离实验步骤

一、中性粒细胞初步分选

试剂与耗材：人淋巴细胞分离液、RP1640、15ml离心管4支，棉球，止血带、碘伏、采血针，5mlEDTA抗凝采血管2支。1ml枪及枪头。

分离步骤：

1.所有试剂恢复至室温；

2.EDTA抗凝采血管收集人外周血10ml;

3.分别将5ml外周血加入5ml人淋巴细胞分离液中（15ml离心管中进行）；注

意动作轻柔缓缓加入；

4.500g离心，30-35分钟，室温；

5.离心后收集低带中性粒细胞，分两层，第一层为单核细胞，第二层为中性粒

细胞；（若离心后分层不明显则多离心5-10分钟）

6.将RP1640用纯水稀释为50%RP1640用于重悬中性粒细胞，恢复细胞活性。

（5-10分钟）

7.400g离心10分钟，去上清，收集中性粒细胞，重悬于RP1640中，细胞计

数。

二、中性粒细胞磁珠分选

试剂耗材及设备：磁力分选器，磁柱，CD15磁珠试剂盒，磁珠分选缓冲液50ml，RP1640，1ml枪及枪头，20微升枪与枪头，15ml离心管4支，细胞计数板。步骤：

1.制冰，保证磁力分选器可以放入冰盒内操作，在4-8℃内进行分选；

2.配液磁珠分选缓冲液（50ml PBS液中含2mmol/L EDTA，0.5%BSA，

PH=7.2）；

3.将上步初步分选的中性粒细胞悬液300g离心10分钟，去上清；

4.细胞重悬于磁珠分选缓冲液中，107细胞重悬于80微升缓冲液中；（如细胞

数多按倍数增加）

5.107细胞中加入20微升CD15磁珠；充分混匀放入2-8℃避光孵育15分钟；

6.用1-2ml缓冲液洗涤细胞/107细胞，300g离心10分钟，去上清；

7.重悬细胞于缓冲液中，108细胞重悬于500微升缓冲液中；

8.将磁力分选器置于冰盒中，用3ml缓冲液冲洗磁柱；

9.将含有中性粒细胞的缓冲液加入磁柱中；

10.用缓冲液冲洗磁柱，每次3ml，冲洗3次；

11.除去磁场，把磁柱放置于15ml离心管上，用5ml缓冲液加压快速冲洗磁柱；

12.离心管中收集的便是中性粒细胞；

13.300g离心去上清，重悬细胞于10ml细胞培养液中，细胞计数。

三、细胞活力检测

步骤：

1、4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。

2、胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。

3、染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。（终浓度0.04%）

4、计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。

5、镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。

6、统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%

四、细胞分组铺板给药

试剂耗材及设备：六孔板2个，1ml枪及枪头，20微升枪与枪头，15ml离心管4支，细胞计数板。

1. 10ml外周血大概可分出1×107个细胞；

2. 分为10组：

①空白组②单PI组③单A V组

④PI、A V双染组⑤PI、A V、CD15三染组

⑥LPS1μg/ml组⑦LPS+Nec-1 50μg/ml组⑧LPS+Nec-1 5μg/ml组

⑨Nec-1 50μg/ml组⑩Nec-1 5μg/ml组。

3.铺板，每孔1ml细胞悬液，给药，空白组给予DMSO。（LPS浓度选择1μg/ml，因为此浓度刺激中性粒细胞后出现凋亡率较低，坏死率较高。Nec-1浓度作用于神经细胞为7μg/ml-50μg/ml）

五、细胞凋亡率检测

耗材试剂：1ml枪及枪头，20微升枪与枪头，1.5ml离心管15个，凋亡检测试剂盒，CD15抗体。

1．细胞培养一段时间后（3、6、12、24、36小时），离心（2000rpm 离心5min）收集细胞；

2．用PBS 洗涤细胞二次（2000rpm 离心5min）收集1~5×105细胞；

3．加入500μL 的Binding Buffer 悬浮细胞；

4．加入5μL A V 混匀后，加入5 μL PI，混匀；

5．室温、避光、反应5～15min；

6．上机检测，分析结果。

PI染色检测细胞周期

1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。 2、加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。 3、细胞染色 离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30分钟（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响）。 4、流式分析 以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。 分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞，具体如下图。 细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。 结果解读 G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76 G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43 S期占25.73 G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2） 峰的变异系数为4.54%（好） 细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。 总的细胞数（仪器检测到的）为17525个， 在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）

质壁分离实验报告范文

质壁分离实验报告范文 一、实验原理 当外界溶液浓度大于细胞液浓度时，根据扩散作用原理，水分子会由细胞液中渗出到外界溶液中，通过渗透作用失水;由于细胞壁和原生质层的伸缩性不同，细胞壁伸缩性较小，而原生质层伸缩性较大，从而使二者分开;反之，外界溶液浓度小于细胞液浓度，则细胞通过渗透作用吸水，分离后的质和壁又复原。 二、目的要求 1.初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法; 2.理解植物细胞发生质壁分离和复原的原理。 三、重点难点（实验报告不写这一点，可适当调整添加在“注意”这一部分） 1.初步掌握植物细胞质壁分离和复原的实验方法; 2.临时装片的制作; 3.低倍显微镜的使用。实验器材：紫色洋葱的鳞片叶、刀子、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、吸水纸（滤纸代替，滤纸可分为剪开几条）、显微镜;质量浓度为0.3g/mL的蔗糖溶液或质量分数为30%的蔗糖溶液、清水。 四、方法步骤 临时装片制作： 1选材：选用紫色特别深的洋葱外表皮;说明：在实验之前，最好将洋葱放在水中浸泡一下，可以使洋葱吸水多一些，而且代谢也比较旺盛，实验效果明显。

2：将洋葱的外层剥去两层（因为处于最外的可能已经死亡）。取表皮：在洋葱的外表皮上，用刀片划“井”字，用镊子轻轻撕取一小块;（关键：最好撕取单层细胞，如果撕的太厚，则会使细胞重叠，严重影响实验效果;）3制片：在载玻片中央滴上一滴清水，然后将取下的洋葱表皮放在水中，平展开来;加上盖玻片。（注意：1：洋葱表皮不能卷曲起来;2：不能带有气泡;3加盖玻片时，要从一侧大约45°角放下，在载玻片和盖玻片之间充满了清水，以便挤出空气。） 4盖玻片一端滴入糖水，于另一端用吸收纸重复几次吸引（可重复几次滴糖水和吸引的过程）。 质壁分离实验后可接着进行质壁复原 质壁复原实验 处理 取下临时装片，在一侧滴入清水，另一侧再用吸水纸重复几次吸引，以确保洋葱表皮细胞完全浸在几乎是清水中;（注：无吸水纸可先用滤纸代替） 观察 先在低倍镜找到一个质壁分离现象比较明显的细胞，然后观察，可见和刚才相反的现象，中央液泡渐渐变大，颜色变浅，最后原生质层又和细胞壁紧紧地贴在一起;若质壁分离没有复原，则证明外界溶液浓度过高，导致细胞死亡。三总结：细胞液浓度小于外界溶液浓度时，细胞通过渗透作用失水，发生质壁分离现象;细胞液浓度大于外界溶液浓度时，

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol : PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处 理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有 0.5-2 X 10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS （根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的 PBS J ;然后胰酶消化 （注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心（1000r/300g 5mi n）收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇（乙醇终浓度70%），吹打混匀以免细胞团聚，4C固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g 5min ）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心（第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎）再次获取细胞沉淀后加入1 00卩IRNaseA 于37 C水浴30min，最后加入400卩lPI避光染色30 min （常温或4C 均可） 【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS 临时配好总量，其中 PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Trit on X-100 0.2% ） 4 C避光染色30分钟】 5、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结

果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-W和FL2-A显示，去除联体细胞。

《观察植物细胞的质壁分离与复原》实验归纳及其拓展(可编辑修改word版)

质壁分离复原实验 高倍显微镜观察 高倍显微镜观察 高倍镜观察 质壁分离实验 《观察植物细胞的质壁分离与复原》实验归纳及其拓展 武汉六中 肖家元 实验原理——内外因法 内部原因：构成植物细胞的细胞壁和原生质层都具有一定程度的伸缩性，但细胞壁的伸 缩性较小，而原生质层的伸缩性较大，这样细胞壁和原生质层之间才能发生分离和复原现象。 外部原因：与外界溶液有关。外界溶液的浓度＞细胞液的浓度 细胞失水质壁分离 外界溶液的浓度＜细胞液的浓度 细胞吸水 质壁分离复原 实验步骤——自身对照 选择活的紫色洋葱鳞片叶外表皮 观察到紫色的中央大液泡，原生质层紧贴细胞壁 一侧滴入蔗糖溶液，另一侧用吸水纸吸引，重复几次。 中央大液泡逐渐变小且颜色加深，原生质与细胞壁逐渐分离 一侧滴入清水，另一侧吸水纸吸引，重复几次 中央大液泡逐渐胀大，原生质逐渐贴近细胞壁 注意问题——三个“并不是” （1） 并不是只有洋葱鳞片叶外表皮细胞才能发生质壁分离和复原。其他植物细胞也可 以发生。 选择活的紫色洋葱鳞片叶表皮细胞的主要原因：它的外表皮细胞的液泡较大，细胞液中有紫色的花青素，在显微镜下，紫色大液泡十分明显，能方便地观察到质壁分裂及其复原的过程。如无紫色洋葱，可用葫芦藓或其他藓类植物的叶片代替。选择材料必须都是活细胞，因为只有活细胞的原生质才具有选择透过性，否则将不会出现质壁分离及其复原现象。 （2） 并不是质壁分离后一定会发生复原。本试验选用的蔗糖溶液如果浓度过高可能导 致细胞失水过多而死亡，无法发生复原。 （3） 并不是只有清水才可以使分离细胞发生复原。只要外界溶液低于细胞液浓度就可以使其复原。如果观察分离时所使用的试剂是一定浓度的 KNO 3 溶液，可观察到细胞发生质壁分离，还可以观察到自动复原，原因是细胞主动吸收了 K +和 NO 3-。 实验应用——六个“拓展” 1. 判断细胞的死活 待测细胞+蔗糖溶液 制作临时装片

实验四 线粒体的分离与观察

实验八线粒体的分离与观察 实验目的 用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。 实验原理 线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 I．鸡肝线粒体的分离 实验用品 一、材料 鸡肝脏 二、试剂 1. 生理盐水 2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 3. 0. 25 mol／L蔗糖+0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph7.4）：

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol：PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS（根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；然后胰酶消化（注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g5min）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入1 00μlRNaseA于37℃水浴30min，最后加入400μlPI避光染色30 min（常温或4℃均可） 【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS临时配好总量，其中PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Triton X-100 0.2%）4℃避光染色30分钟】 5、流式分析

以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。

实验观察洋葱表皮质壁分离及复原

《实验:观察洋葱外表皮的质壁分离与复原》教案一、教材分析 本实验为人教版高中生物必修1第四章《细胞的物质输入和输出》第1节《物质跨膜运输的实例》的内容。本实验是在学习了细胞膜的结构和功能的基础上，利用植物细胞质壁分离及质壁分离复原实验强化渗透作用原理，同时也是对物质出入细胞方式这一部分内容的铺垫。目的在于帮助学生理解生物膜选择透过性这一重要的特点。学生通过本实验了解水分子透过细胞膜的渗透原理，并通过显微镜观察蔗糖溶液造成植物细胞质壁分离以及清水复原现象，在实践中发现和总结细胞失水和吸水的原因，尝试解释生活与生产中的有关现象；掌握实验的一般方法与步骤，体会合作学习的乐趣。 结合《学科教学指导意见》：在进行“活动：观察洋葱表皮细胞质壁分离及质壁分离复原”时，尝试排除观察中各种无关因素的干扰，善于发现问题并积极参与讨论，探求新知。尝试从不同角度思考、分析和解释观察的现象，树立实事求是的科学态度；解释植物细胞质壁分离及质壁分离复原的现象。 二、学情分析 学生除拥有初中自然科学相关水分吸收内容基础知识外，在学习了细胞膜功能和渗透原理后，对植物细胞在什么情况下吸水和失水等内容已经有所了解，并在日常生活经验中也有类似植物细胞吸水失水的实例，例如萝卜咸菜腌制等。但并没有系统学习植物细胞吸水和失水的基本原理及条件，缺乏感性认识。 与平时理论课相比，对于首次接触微观世界的学生，实验课有更高的吸引力，学习的积极性也更高。在实验设计及方法上，需要教师对实验的思路给予清晰地讲解，并引导学生对实验数据进行合理的处理和分析，得出正确的实验结论。 三、教学目标 1、知识目标： （1）阐明植物细胞渗透吸水和失水的原理； （2）解释质壁分离与复原的实质； （3）说明质壁分离复原的条件。 2、能力目标： （1）完成植物细胞质壁分离和复原的观察； （2）完成洋葱外表皮临时装片的制作； （3）尝试对实验结果进行分析和解释并得出相应的结论； （4）联系质壁分离与复原知识，解决实际问题；

流式细胞分离细胞

流式细胞仪分离原理和步骤 流式细胞术（flow cytometer,FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点，已成为当代最先进的细胞定量分析技术。本实验以间接免疫荧光标记法为例。 实验原理 因淋巴细胞表面有特征性的抗原或受体表达，故先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，经流式细胞仪测定荧光强度和阳性百分率，即可知相应抗原的密度和分布。细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 材料和仪器 1 特异性鼠抗人单克隆抗体（McAb）（如抗CD3、抗CD4等）、荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体、灭活正常兔血清，含10％FBS的FBS的RPMI-1640溶液、DPBS、洗涤液、固定液等。 2 玻璃管、塑料离心管、离心机、流式细胞仪、倒置显微镜。 实验方法 1 制备活性高的外周血单个核细胞悬液，用含有10％FCS的RPMI-1640溶液调整细胞浓度为5×106~1×107/mL。 2 取40μL细胞悬液加入预先有特异性鼠抗人McAb 5~50μL的小玻璃管或塑料离心管中，再加50μL 1：2（用DPBS稀释）灭活正常兔血清，4℃，30min。 3 用洗涤液洗涤2次，每次加液2mL左右，1000r/min，离心5min，弃去上清液。 4 加入50μL工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记二抗，充分振荡，4℃，30min。 5 用洗涤液洗涤2次，每次加液2mL左右，1000r/min，离心5min。 6加1mL固定液，混匀，上流式细胞仪分选细胞。标本在试管中可保存5~7天。

流式检测细胞周期要点

1.收集细胞； ～5000rpm离心5min，收集沉淀，重悬于200ul的PBS中，再次离心收集沉淀； ％冰冻乙醇（-20度保存）4度固定过夜or-20度固定1h； 4.离心收集沉淀，PBS洗一次（视沉淀量可忽略）； 5.沉淀重悬于200～500ul的PBS，加入Rnase A 37度水浴1h； 目纱布过滤至流式管，加入PI染色，4度避光30min-1h，上机器。 1、Q：要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？ A：我做过乳腺细胞的DNA含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%. 2、实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题： Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？ A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。 Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？ A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。 Q：（3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x－100固定了？ A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。 Q：（4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？

植物质壁分离实验教案

观察植物细胞的质壁分离和复原 一、实验目的： 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法；2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。二．实验原理： 1．质壁分离的原理：当细胞液的浓度外界溶液的浓度时，细胞就会通过而失水，细胞液中的水分就透过原生质层进入到溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性（大还是小），当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁分离。 2．质壁分离复原的原理：当细胞液的浓度外界溶液的浓度时，细胞就会通过而吸水，外界溶液中的水分就通过进入到细胞液中，整个原生质层就会慢慢地恢复成原来的状态，紧贴细胞壁，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。 3．相对细胞膜，细胞壁具有什么特性？ 二、实验材料、用具： 紫色洋葱鳞片叶的外表皮，0.3g/ml的蔗糖溶液，显微镜等。 4．为什么选用紫色洋葱鳞片叶的外表皮作实验材料？用紫色洋葱鳞片叶的内表皮是否可以？为什么？ 5．蔗糖溶液浓度用0.5g/ml可以吗？为什么？ 三、实验步骤： 1．制作洋葱表皮的临时装片：在载玻片上滴一滴水，撕取洋葱鳞片叶外表皮放在水滴中展平，盖上盖玻片。 2．观察洋葱鳞片叶外表皮细胞：观察细胞中央液泡的大小，以及原生质层的位置。 3．观察质壁分离现象：从盖玻片的一侧滴入0．3g/ml的蔗糖溶液，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次。镜检。 思考:为什么要重复几次滴入0．3g/ml的蔗糖溶液，用吸水纸吸引？ 思考:原生质层与细胞壁之间的液体是什么？为什么？ 4．观察细胞质壁分离的复原现象：从盖玻片的一侧滴入清水，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次；镜检。 四、实验结论： 思考:通过上述实验，你能得出什么结论？ 思考:当红细胞细胞膜两侧的溶液具有浓度差时，红细胞会不会发生质壁分离？为什么？ 五、课堂练习： 1、下列关于实验的描述，正确的是 A．将在蔗糖溶液中已发生质壁分离的洋葱表皮细胞转到更高浓度的蔗糖溶液中，则发生质壁分离复原( ) B．将斐林试剂加入到蔗糖溶液中，加热后出现砖红色沉淀 C．将肝脏研磨液煮沸冷却后，加入到过氧化氢溶液中立即出现大量气泡 D．将双缩脲试剂加入到蛋清稀释液中，溶液变成紫色

细胞周期同步化

细胞周期同步化 在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。细胞周期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。 DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制DNA 合成，而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。其原理是: Td Ｒ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。它将细胞同步于G1 /S期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大。TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。 中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。过去研究中也发现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。 经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。将细胞用PI（碘化丙啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成

生物实验报告《观察植物细胞的质壁分离与复原》(完整版)

报告编号：YT-FS-8701-57 生物实验报告《观察植物细胞的质壁分离与复原》 (完整版) After Completing The T ask According To The Original Plan, A Report Will Be Formed T o Reflect The Basic Situation Encountered, Reveal The Existing Problems And Put Forward Future Ideas. 互惠互利共同繁荣 Mutual Benefit And Common Prosperity

生物实验报告《观察植物细胞的质壁分离与复原》(完整版) 备注：该报告书文本主要按照原定计划完成任务后形成报告，并反映遇到的基本情况、实际取得的成功和过程中取得的经验教训、揭露存在的问题以及提出今后设想。文档可根据实际情况进行修改和使用。 一、实验目的 1. 初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法。 2. 理解植物细胞发生渗透作用的原理。 二、实验原理 当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞液中的水分就透过原生质层进入外界溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁逐渐分离开，也就是分升了质壁分离当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，外界溶液中的水分就透过原生质层进入细胞液中，整个原生质层就会慢慢

地恢复成原来的状态，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。 三、材料用具 紫色洋葱鳞片叶、显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、镊子、刀片、吸水纸、清水、0.3g/ml蔗糖溶液 四、实验过程（见书Ｐ60） 物理实验报告·化学实验报告·生物实验报告·实验报告格式·实验报告模板 五、讨论 1．如果将洋葱表皮细胞浸润在与细胞液浓度相同的蔗糖溶液中，这些表皮细胞会出现什么现象？ 2．当红细胞细胞膜两侧的溶液具有浓度差时，红细胞会不会发生质壁分离现象？为什么？ 3．画一个细胞在正常状态下到经过0.3g/ml蔗糖溶液处理，再经过清水处理的细胞变化的一系列模式图。 这里填写您企业或者单位的信息 Fill In The Information Of Your Enterprise Or Unit Here

细胞增殖细胞周期的测定方法

苑中2011 届高三生物二轮专题复习学案 1 “细胞增殖”相关知识的建构（2 课时）一、减数分裂与基因的分离、自由 组合定律请画出能体现基因自由组合现象的细胞分裂图像 例1、（08 江苏）某种昆虫长翅（A）对残翅（a）为显性，直翅（B）对弯翅（b）为显性，有刺刚毛（D）对无刺刚毛（d）为显性，控制这3 对性状的基因均位于常染色体上。现有这种昆虫一个体基因型如下图所示，请回答下列问题。（1）长翅与残翅、直翅与弯翅两对相对性状的遗传是否遵 循基因自由组合定律，并说明理由。。（2）该昆虫一个初级精母细胞产生的精细胞的基因型为____________。（3）该昆虫细胞有丝分裂后期，移向细胞同一极的基因有。（4）该昆虫细胞分裂中复制形成的两个D 基因发生分离的时期 有______ 。（5）为验证基因自由组合定律，可用来与该昆虫进行交配的异性个体的基因型分别是 _______________________________________________ ____________________________ 。二、细胞分裂与可遗传变异请画出可遗传变异种类的概念图苑中2011 届高三生物二轮专题复习学案 2 1、基因重组（非同源染色体的自由组合、交叉互换）例2、（07 广东）在减数分裂中每对同源染色体配对形成四分体，四分体中的非姐妹染色单体 之间经常发生交换。实验表明，交换也可以发生在某些生物体的有丝分裂中，这种现

象称为有丝分裂交换。图39—1 是某高等动物一个表皮细胞发生有丝分裂交换的示意图，其中D 和d，E 和e，F 和 f 表示某对同源染色体上的三对等位基因。图39—1 交换 过程示意图（左：交换前的染色体；右：交换后的染色体）（1）请问该细胞在发生有丝分裂交换后，产生几种基因型 的子代表皮细胞？并分别写出基因型 _______________________________________________ __________________。（2）如果不考虑该生物产生配子时发生的交换，那么该生物产生的配子有几种基因型？并 写出基因型 _______________________________________________ _____________。（3）如果图39—1 是该生物的精原细胞在产生精细胞时发生减数分裂交换后的结果，请问由它产 生的配子类型有几种？并写出基因型 ______________________________。（4）如果细胞在减数分裂和有丝分裂中都发生交换，你认为哪一种分裂方式对于遗传多样性的贡献更大？为什么？ _______________________________________________。 2、染色体变异（染色体结构变异、染色体数目变异）例 3、（10 苏州高二期末）右下图表示某生物体的细胞进行减数 分裂过程中，其中联会的两对染色体之间出现异常的

流式检测细胞周期和凋亡实验步骤

流式细胞技术检测细胞周期分布 1) 已转染miRNA mimics的细胞培养达到85％融合时，用胰酶消化细胞。1000 rpm，离心5min，收集细胞沉淀； 2) 已消毒的PBS重悬细胞，1000 rpm/min，离心5 min，收集细胞。重复此步骤2次，以除去胰酶； 3) 加入预冷的70%乙醇固定细胞过夜； 4) 第二天1000rpm，离心5 min，收集细胞沉淀，PBS重悬两次，以除去乙醇； 5) 离心后加入500ul PBS重悬细胞，加入碘化丙锭(PI)染色液(含50mg/L PI，1g/L Triton X-100，100g/L RNase)混匀，4℃避光孵育30min。 6）流式细胞仪FACStar (美国BD公司) 检测。接收的信号经Cellquest软件处理，对检测细胞的荧光强度进行分析。实验重复3次。 2.11流式细胞技术检测细胞凋亡水平 1) 已转染BART6-3p mimics的细胞培养达到85％融合时，将上清培养液收集至离心管内；常常 2）PBS清洗贴壁细胞3次，用胰酶消化细胞（注意：消化时不可过度），收集于第一步的离心管内； 3) 1000 rpm离心5min，弃上清收集细胞，PBS轻轻重悬后，加入195 ulAnnexin V-FITC结合液，吹打混匀，重悬细胞，加入5ul Annexin V，轻轻混匀。避光室温孵育15min； 4) 加入10 ul PI染色液，轻轻混匀，避光孵育； 空白：Annexin V—FITC结合液200ul 双染：185ul结合液+5 ulAnnexin V—FITC+10ul PI 单染：195ul结合液+5ul Annexin V—FITC 190ul结合液+10PI 5) 进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

植物细胞质壁分离与复原详细实验步骤

植物细胞质壁分离与复原详细实验步骤 （一）制作临时装片并观察 1、制片 ①、用拇指和食指夹住载玻片，然后取三层纱布沿一个方向擦拭载破片，直到对光看到载玻片光亮无污物为止。 ②、在载玻片上滴一滴水。（注意胶头滴管的正确使用方法：①握持方法是用中指和无名指夹住玻璃管部分以保持稳定，用拇指和食指挤压胶头以控制试剂的吸入或滴加量。 ②不能倒置，也不能平放于桌面上。③胶头滴管加液时，不能伸入容器） ③、 A 、洋葱：选用紫色特别深的洋葱外表皮，用刀片划“井”字，用镊子轻轻撕取中间的小正方形。（注意在洋葱未经过处理时一定要取外表皮）由于每种材料主要只在取材上有区别，其它步骤基本类似。下面老师演示一种洋葱鳞片叶外表皮装片。 ④、将撕取的洋葱鳞片叶外表皮借助解剖针放在水滴中展平，主要是为了细胞尽量无重叠。 ⑤、用镊子夹住盖玻片盖在载玻片上（同学们注意：盖盖玻片应让盖玻片的一侧以大约 45 ?先触及载玻片，然后轻轻放平，防止装片产生气泡）如果四周水过多可以用滤纸吸一下。 2、观察洋葱细胞 显微镜使用顺序：取镜—安放—对光（无载破片）打开光源—低倍镜对准通光孔—聚光器调到最高—调节反光镜—把宏光光圈打开（如果还不够亮可以稍微动一下粗准焦螺旋）—放装片—先用低倍镜调粗准焦螺旋至物像清晰，并调至中央，后扭转物镜转换器用高倍镜观察 可以看到洋葱鳞片叶表皮细胞中紫色的中央液泡，还可以看到原生质层紧贴着细胞壁。 （二）、观察质壁分离及复原 1、观察质壁分离现象 ①取下载玻片（如果不取下，在载物台上滴加蔗糖会一不小心滴漏在显微镜上，会损坏显微镜） ②从显微镜上取下装片，放在实验桌上。从盖玻片的一侧滴入0.3g /mL的蔗糖 溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引，重复几次，为什么要重复呢？让盖玻片下面的洋葱鳞片叶完全侵润在蔗糖溶液中。 ③高倍镜观察表皮细胞发生的变化。中央液泡变小，原生质层脱离细胞壁 2、观察细胞质壁分离的复原现象 ①取下载玻片（如果不取下，在载物台上滴加清水会一不小心滴漏在显微镜上, 会损坏显微镜） ②从显微镜上取下装片，放在实验桌上。从盖玻片的一侧滴入清水，在盖玻片另一侧用吸水纸吸引，这样重复几次。洋葱鳞片叶表皮浸润在清水中。 ③用高倍显微镜观察，可以看到中央液泡逐渐胀大，原生质层又逐渐贴向细胞壁。实验

造血干细胞分离培养方法

一造血干细胞分离 （一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min 得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨 , 在两头关节处切开骨骼 , 反复用培养基冲洗骨髓腔 , 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上 , 2 000 r / min 离心 20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法 方法一在15ml分离管中加比重为的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。 方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM洗涤细胞两次，每次以1000r/min 离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。 取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼 , 反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。 （二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。 去除 Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞 ; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞 , 包括 T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞 ; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞 , 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。 （三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液 , 加入μL CD45- FITC和10μL CD34- PE 充分混合 , 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定 , 上机检测。 磁性标记 CD34+细胞：在细胞悬液中加入100μL Fc - R阻滞剂 , 再加入100μLCD34 磁珠标记细胞 , 于4℃冰箱中充分混合孵育 30 min。用PBS 缓冲液洗涤细胞，离心10 min , 去上清液后再以500μL PBS缓冲液重新悬浮细胞。 MiniMACS磁性分离、纯化CD34+细胞：将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500μL PBS 缓冲液漂洗。以孔径30μm的尼龙网或过滤器去除细胞悬液凝块 , 细胞通过分离柱 , 以500μL PBS

细胞培养的基本方法-细胞分离技术

细胞培养的基本方法-细胞分离技术 细胞分离技术 一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机 械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。 从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。 1. 胰蛋白酶（Trypsin） ?在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片，通过悬 浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。 ?将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐 溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。 ?在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。 ?移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。 ?在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要 加入大豆胰蛋白酶抑制剂。 ?通过无菌不锈钢丝网（100?200mm过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。 2. 胶原酶（Collagenase） ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片 几次。 ?加入胶原酶（50?200单位/ml，溶解在HBSS中）。 ?在37C孵育4到18小时。加入3mM CaCI2增加解离效率。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。 如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。 ?通过离心在HBSS中清洗悬液几次。 ?再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。 3. Dis pase ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片 几次。 ?加入Dispase （0.6?2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液） ?在37C孵育20分钟到几个小时。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的

细胞周期测定实验

细胞周期测定实验 细胞计数法： 实验方法原理体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。 分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。 实验材料细胞 试剂、试剂盒胰酶甲醇培养液冰醋酸Giemsa染液 仪器、耗材CO2培养箱普通显微镜培养皿盖玻片吸管 实验步骤一、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。 二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。 三、取出盖片，按下列顺序操作： PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。 四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。 五、计算 分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100% 展开 注意事项1. 操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。 其他一、Giemsa染液配制 称Giemsa粉末0.5 g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33 ml）。56℃中保温90-120分钟。加入33 ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。使用时按

要求用PBS稀释。一般稀释10倍。 BrdU参入法 实验方法原理细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。 单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。 BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。 实验材料细胞 试剂、试剂盒BrdU 甲醇冰醋酸Giemsa染液秋水仙素SSC 柠檬酸三钠NaCl 仪器、耗材冰箱玻片水浴锅锅盖紫外灯光学显微镜 实验步骤一、试剂配制 1. BrdU配制 BrdU 10 mg加双蒸水10 ml ，4℃下避光保存。 2. 2×SSC配制 NaCl 1.75 g，柠檬酸三钠0.88 g，加水至100 ml，4℃保存。 二、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10 μg/ml。 三、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1 μg。 四、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

探究植物细胞质壁分离的创新实验说课稿

探究植物细胞质壁分离的创新说课稿 武陟一中梁西周 一、理论背景及实验创新理念 目前高中生物教学中尽管改革不断深化，课堂的人文性有所加强，但生物课堂教学效率低下，低效教学甚至无效教学在传统的教学中仍然大量存在。因此当前亟待解决的问题就是如何实现有效教学，以尽可能少的时间、精力和物力投入，取得尽可能多的教学效果。对实验的创新是必要的，在改进中的和创新中使学生对实验的原理、现象、结论及其运用有更好的理解和掌握，相对传统的实验，创新实验的效果更明显，更易于激发学生的学习和探究热情，培养学生的发散思维和逆向思维，在教学过程中做到有效果、有效率、有效益。 二、教学内容分析 本案例出自必修1《分子与细胞》新课标内容的第四章第一节：物质跨膜运输的实例。本实验是在学习扩散和渗透、被动转运、主动转运知识的基础上，利用植物细胞质壁分离及质壁分离复原实验强化渗透作用原理，同时也是对物质出入细胞方式这块内容的升华。本实验也是在初中《科学》“根对水分的吸收”的基础上进一步学习植物的水分代谢过程。同时也与后面学习的细胞呼吸作用和光合作用存在一定程度的联系，是植物体新陈代谢的基础。 三、学情分析 学生除拥有初中自然科学相关水分吸收内容基础知识外，在学习物质出入细胞的方式内容后，他们对植物细胞在什么情况下吸水和失水等内容已经有所了解，并在日常生活经验中也有类似植物细胞吸水失水的实例，例如萝卜咸菜腌制等。但并没有系统学习植物细胞吸水和失水的基本原理及条件，缺乏感性认识。与平时理论课相比，学生对实验课有更高的积极性，对课本中没有的创新实验有更强的探究欲望。 四、教学目标 高中生物课程标准的基本理念中明确指出倡导探究性学习和注重与现实生活的联系。尝试从不同角度思考、分析和解释观察的现象，树立实事求是的科学态度；解释植物细胞质壁分离及质壁分离复原的现象。 1．知识目标：解释植物细胞渗透吸水的原理和过程；解释质壁分离与复原的实质；说明质壁分离能否自动复原的条件。 2．能力目标：初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法；尝试对实验结果进行分析和解释并得出相应的结论；运用质壁分离与复原知识解决实际问题；复习并熟练光学显微镜的操作步骤。 3．情感目标：参与小组合作与交流，体验团队协作学习过程；通过实验结果和现象观察，养成实事求是的科学态度；培养不断探求新知的精神和合作精神。 五、教学重点与难点

DC细胞的分离及培养

DC细胞的分离及培养 一、单个核细胞的分离 1. 取新鲜脐带血按等体积加血液稀释液或PBS，混合均匀。 2. 将Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare）瓶来回倒置几次，以确保其混合均匀。使用带注射针头的注射器刺穿隔片，倒置Ficoll-Paque PLUS 瓶并抽取需要量的Ficoll-Paque PLUS。 3. 将Ficoll-Paque PLUS 取3 ml 缓缓加入15 ml离心管中。 4. 轻轻加入稀释血液样品4 ml，使其置于Ficoll-Paque PREMIUM层上。加入稀释血液时，尽量使样品与Ficoll-Paque PREMIUM分层，二者不得混合。 5. 在18-20 °C 下，离心400 g 30-40 分钟。 6. 使用无菌的吸管或移液器抽出上层液体，使淋巴细胞层在界面处保持原状。 7. 采用一无菌的吸管或移液器将淋巴细胞层移入一清洁的离心管中。在最小量的情况下移出界面处所有的物质至关重要。移去多余的Ficoll-Paque PLUS会导致粒细胞污染；而移去多余的上清液则会引起血小板污染。 8. 向装有淋巴细胞的试管中加入至少3倍体积的PBS溶液。 9. 用吸管轻轻地将细胞吹吸，使其悬浮。在18-20 °C 下，以60-100 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液。 10. 重复步骤8-9，至此，淋巴细胞应悬浮于适合CD34阳性细胞分选液中。 二、CD34阳性细胞分选 1. 使用含0.5% BSA的PBS（分选buffer）重悬制备好的单个核细胞，加入50~100 μl CD34+ microbeads（Miltenyi公司），4 °C混合半个小时。 2. 选择合适的分选柱，MS柱适合50 ml血量，更多则使用LS柱。 3. 用分选buffer平衡分选柱3个柱体积后，将分选柱至于磁极上。 4. 将步骤1的悬浊液混合物以300 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液，并使用2-3 ml的分选buffer重悬。 5. 把重悬后的细胞和磁珠缓缓加到分选柱上，使其缓慢流下。 6. 用分选buffer清洗分选柱3个柱体积。 7. 将分选柱自磁极上取下，加入一个柱体积的分选buffer，快速将之打入离心管中。为提高回收效率，可重复一次。 8. 将洗下的细胞以300 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液，并用PBS重悬。 9. 重复步骤8并用合适的培养基重悬以适应下面的细胞培养。 三、CD34阳性细胞培养 1. 培养基配置：IMDM培养基+10% FBS，细胞因子SCF 50 ng/ml、IL-3 5 ng/ml、IL-6 20 ng/ml、FL-3t 50 ng/ml、TPO 20 ng/ml，加双抗。 2. 将分离好的CD34阳性细胞置于六孔版的一孔或分于两孔中（视血量和细胞