3种酵母样真菌鉴定方法的比较

1　进修生

收稿日期:2001-04-103种酵母样真菌鉴定方法的比较农生洲　韦柳宏1　陈松峰

(广西壮族自治区人民医院检验科　南宁　530021)

为综合评价目前我国实验室常规手工发酵鉴定法(常规法)、生物梅里埃A T B Fug us卡鉴定法(仪器法)和近年国内开始应用的科玛嘉(CHRo M ag ar)酵母样真菌显色培养基鉴定法(显色法)等3种酵母样真菌鉴定方法的优劣。我们同时用这3种方法对实验室保存的122株酵母样真菌标准菌株进行了鉴定比较,报道如下。

1　材料与方法

1.1　菌株来源:122株实验菌为实验室历年保存的标准菌株,其中白假丝酵母菌53株,热带假丝酵母菌31株,光滑球假丝酵母菌18株,近平滑假丝酵母菌11株,克柔氏假丝酵母菌3株,季也蒙假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌各2株,粘红假丝酵母菌、酿酒假丝酵母菌各1株。

1.2　试剂:沙氏培养基和各种手工用发酵管均购自杭州天和微生物试剂公司;Fug us卡及其配套仪器A T B Ex pressio n 为法国生物梅里埃公司产品;显色培养基则购自郑州搏赛科技有限责任公司。

1.3　鉴定方法:常规法鉴定按卫生部医政司颁发的《全国临床检验操作规程》进行;Fug us卡法按配套的操作手册取菌制成悬液,加样后置37℃培养24h后上机鉴定;显色法则取F ugus卡法剩余的悬液直接接种于显色培养基制成的平板上,置37℃培养,每隔24h观察一次结果,据菌落颜色进行判定;翠绿色为白假丝酵母菌,兰灰色为热带假丝酵母菌,紫红色边缘模糊有微毛为克柔氏假丝酵母菌菌,整个菌落湿润且紫红色为光滑球假丝酵母菌,白色为其它假丝酵母菌。

2　结　果

2.1　培养鉴定耗时:常规法和仪器法需预先用沙氏培养基培养出真菌,平均耗时大约72h,再加上鉴定耗时又分别平均约需72h和24h,常规法培养鉴定总共平均约需6d,仪器法约需4d;显色法集培养与鉴定于一体,耗时平均约需4 d。

2.2　鉴定结果:122株酵母样真菌的鉴定中,三法对53株白假丝酵母菌鉴定全部正确。其它69株菌中,常规法有11株无法鉴定到种,占总株数9.0%(11/122)。此外有5株热带假丝酵母菌鉴定错误,3株错定为光滑球假丝酵母菌,2株错定为近平滑假丝酵母菌。有3株光滑球假丝酵母菌鉴定错误,1株误定为热带假丝酵母菌,2株误定为近平滑假丝酵母菌。有2株近平滑假丝酵母菌鉴定错误,1株误为热带假丝酵母菌,1株误为光滑球假丝酵母菌。除无法鉴定到种的11株菌后,鉴定错误率仍有9.0%(10/111);显色法对白假丝酵母菌等该法能鉴定的6种酵母样真菌鉴定准确率达100%,其它菌株却无法鉴定到种,占总株数4.1%(5/122);

F ugus卡法全部菌株均可鉴定到种,且准确率达100%。详见表1。

表1　122株酵母菌样真菌3种方法鉴定结果比较(株) 菌名菌株数常规法显色法仪器法

白假丝酵母菌　53　53　53　53

热带假丝酵母菌31273131

光滑球假丝酵母菌18171818

近平滑假丝酵母菌11111111

克柔氏假丝酵母菌3133

粘红假丝酵母菌1111

季也蒙假丝酵母菌2102

葡萄牙假丝酵母菌2002

酿酒假丝酵母菌1001

2.3　成本核算:常规法鉴定每一株菌平均约需10元,仪器法平均约需50元,显色法平均约需15元。

3　讨　论

当前酵母样真菌引起的临床感染正呈逐步增加之势,临床医师急需实验室准确快速地检出病原体以协助诊治[1]。纵观本试验结果,加上预先真菌培养时间常规法鉴定耗时总共需要至少6d左右,且操作繁琐,生化结果判定较困难,即使是标准菌株,结果仍极易出错。而如F ugus卡等仪器测试卡法,虽然鉴定耗时较短,操作也简便,鉴定结果准确率又高且可配套进行体外药敏试验,但因仪器和试卡均为进口产品,价格昂贵,只适合在有大量标本的大型综合性医院应用。从本研究可看出,显色法培养加鉴定耗时平均仅需48h,与应用仪器法耗时基本相等,且培养基制备方便,价格适中,结果判定简便快速准确,虽然有一部分菌株无法鉴定到种,但已能鉴定出目前临床感染95%以上的3～4种酵母样真菌感染[2],故不失为一种替代常规法在中小医院普及开展的酵母样真菌检验方法。

参　考　文　献

1　周贵民,谢　灵.国内酵母菌感染和实验室诊断的现状及建议.中华医学检验杂志,1996,19(5):301-303.

2Pfaller M A,Housto n A,Co ffman S.A pplicatio n of CHR OM ag ar Ca ndida for r apid scr eening o f clinical specimens for Candida A lbicans,Candida tro picalis, Candida K rusei,and Candida(T or ulopsis)glabrata.J Clin M icr o bilo l,1996,34(1):58-61.

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764?广西医科大学学报

JOURNA L OF GU ANGXI M EDICAL UNIVERSIT Y

　2002Oct;19(5)

生物化学实验报告-酵母RNA的提取与鉴定

实验五酵母RNA的提取与鉴定 一、实验目的 1.掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。 2.了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。 二、实验原理 1.酵母核酸中RNA含量较多，DNA含量则少于2%。 2.RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。 3.用碱液提取的RNA有不同程度的降解 三、实验仪器 1.离心机 2.水浴锅 3.电炉 4.烧杯 5.量筒 四、实验试剂 1.干酵母粉 2.0.2%氢氧化钠溶液：2g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml。 3.乙酸 4.95%乙醇 5.无水乙醚

6.10%硫酸 7.氨水 9.5%硝酸银溶液：5g硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。 1.苔黑酚-三氯化铁溶液： 将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl 3.6H2O。 临用时配制。 五、实验步骤 1.RNA的提取： （1）称取2g干酵母粉于100ml烧杯中，加入 0.2%氢氧化钠溶液10ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌（如沸水浴过程中溶液蒸干可再加5~10ml氢氧化钠）。然后加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（pH 试纸检验），离心10-15分钟（4000r.p.m）。 （2）取上清液，加入2倍体积的95%乙醇，边加边搅，加毕，静止，待完全沉淀，过滤。 （3）滤渣先用95%乙醇洗2次，每次约5毫升，再用无水乙醚洗2次，每次也约5ml。 （4）洗涤时可小心地用玻璃棒搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可鉴定。 2.鉴定： （1）取上述RNA约 0.5g，加10%硫酸5ml,加热至沸1—2分钟，将RNA水解。

几种真菌的分离与鉴定教学文案

常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者，称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔，称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式，如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2．孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同，分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子，这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种：关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲，很少产生有性孢子，大多数是无性孢子。 （1）厚壁孢子：当真菌在不利环境中，由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成，呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。

3种酵母样真菌鉴定方法的比较

1　进修生 收稿日期:2001-04-103种酵母样真菌鉴定方法的比较农生洲　韦柳宏1　陈松峰 (广西壮族自治区人民医院检验科　南宁　530021) 为综合评价目前我国实验室常规手工发酵鉴定法(常规法)、生物梅里埃A T B Fug us卡鉴定法(仪器法)和近年国内开始应用的科玛嘉(CHRo M ag ar)酵母样真菌显色培养基鉴定法(显色法)等3种酵母样真菌鉴定方法的优劣。我们同时用这3种方法对实验室保存的122株酵母样真菌标准菌株进行了鉴定比较,报道如下。 1　材料与方法 1.1　菌株来源:122株实验菌为实验室历年保存的标准菌株,其中白假丝酵母菌53株,热带假丝酵母菌31株,光滑球假丝酵母菌18株,近平滑假丝酵母菌11株,克柔氏假丝酵母菌3株,季也蒙假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌各2株,粘红假丝酵母菌、酿酒假丝酵母菌各1株。 1.2　试剂:沙氏培养基和各种手工用发酵管均购自杭州天和微生物试剂公司;Fug us卡及其配套仪器A T B Ex pressio n 为法国生物梅里埃公司产品;显色培养基则购自郑州搏赛科技有限责任公司。 1.3　鉴定方法:常规法鉴定按卫生部医政司颁发的《全国临床检验操作规程》进行;Fug us卡法按配套的操作手册取菌制成悬液,加样后置37℃培养24h后上机鉴定;显色法则取F ugus卡法剩余的悬液直接接种于显色培养基制成的平板上,置37℃培养,每隔24h观察一次结果,据菌落颜色进行判定;翠绿色为白假丝酵母菌,兰灰色为热带假丝酵母菌,紫红色边缘模糊有微毛为克柔氏假丝酵母菌菌,整个菌落湿润且紫红色为光滑球假丝酵母菌,白色为其它假丝酵母菌。 2　结　果 2.1　培养鉴定耗时:常规法和仪器法需预先用沙氏培养基培养出真菌,平均耗时大约72h,再加上鉴定耗时又分别平均约需72h和24h,常规法培养鉴定总共平均约需6d,仪器法约需4d;显色法集培养与鉴定于一体,耗时平均约需4 d。 2.2　鉴定结果:122株酵母样真菌的鉴定中,三法对53株白假丝酵母菌鉴定全部正确。其它69株菌中,常规法有11株无法鉴定到种,占总株数9.0%(11/122)。此外有5株热带假丝酵母菌鉴定错误,3株错定为光滑球假丝酵母菌,2株错定为近平滑假丝酵母菌。有3株光滑球假丝酵母菌鉴定错误,1株误定为热带假丝酵母菌,2株误定为近平滑假丝酵母菌。有2株近平滑假丝酵母菌鉴定错误,1株误为热带假丝酵母菌,1株误为光滑球假丝酵母菌。除无法鉴定到种的11株菌后,鉴定错误率仍有9.0%(10/111);显色法对白假丝酵母菌等该法能鉴定的6种酵母样真菌鉴定准确率达100%,其它菌株却无法鉴定到种,占总株数4.1%(5/122); F ugus卡法全部菌株均可鉴定到种,且准确率达100%。详见表1。 表1　122株酵母菌样真菌3种方法鉴定结果比较(株) 菌名菌株数常规法显色法仪器法 白假丝酵母菌　53　53　53　53 热带假丝酵母菌31273131 光滑球假丝酵母菌18171818 近平滑假丝酵母菌11111111 克柔氏假丝酵母菌3133 粘红假丝酵母菌1111 季也蒙假丝酵母菌2102 葡萄牙假丝酵母菌2002 酿酒假丝酵母菌1001 2.3　成本核算:常规法鉴定每一株菌平均约需10元,仪器法平均约需50元,显色法平均约需15元。 3　讨　论 当前酵母样真菌引起的临床感染正呈逐步增加之势,临床医师急需实验室准确快速地检出病原体以协助诊治[1]。纵观本试验结果,加上预先真菌培养时间常规法鉴定耗时总共需要至少6d左右,且操作繁琐,生化结果判定较困难,即使是标准菌株,结果仍极易出错。而如F ugus卡等仪器测试卡法,虽然鉴定耗时较短,操作也简便,鉴定结果准确率又高且可配套进行体外药敏试验,但因仪器和试卡均为进口产品,价格昂贵,只适合在有大量标本的大型综合性医院应用。从本研究可看出,显色法培养加鉴定耗时平均仅需48h,与应用仪器法耗时基本相等,且培养基制备方便,价格适中,结果判定简便快速准确,虽然有一部分菌株无法鉴定到种,但已能鉴定出目前临床感染95%以上的3～4种酵母样真菌感染[2],故不失为一种替代常规法在中小医院普及开展的酵母样真菌检验方法。 参　考　文　献 1　周贵民,谢　灵.国内酵母菌感染和实验室诊断的现状及建议.中华医学检验杂志,1996,19(5):301-303. 2Pfaller M A,Housto n A,Co ffman S.A pplicatio n of CHR OM ag ar Ca ndida for r apid scr eening o f clinical specimens for Candida A lbicans,Candida tro picalis, Candida K rusei,and Candida(T or ulopsis)glabrata.J Clin M icr o bilo l,1996,34(1):58-61. ? 764?广西医科大学学报 JOURNA L OF GU ANGXI M EDICAL UNIVERSIT Y 　2002Oct;19(5)

生物梅里埃微生物快速检验建议方案

生物梅里埃微生物快速检验建议方案 一、致病菌检验现状 常见细菌性食物中毒的病原微生物有：1、致病性大肠杆菌（特别是出血性大肠杆菌O157：H7）；2、沙门氏菌属；3、致病性弧菌（包括：霍乱弧菌、副溶血性弧菌）；4、金黄色葡萄球菌及其肠毒素；5、近年来发现导致细菌性食物中毒的微生物越来越多，包括单核增生李司特菌、空肠弯曲菌等。 因此，包括上述致病菌在内的致病微生物的快速检验，对早日弄清食物中毒的病因，控制疫情，提高卫生防疫水平非常重要。 致病菌常规检验方法大致是： 其中，增菌是不可缺少的步骤。 1、如果在增菌后能够利用自动化仪器对标本进行快速筛检，就可以尽快发 现在那些标本中可能存在致病菌，可能存在那些致病菌，从而可大大缩 小检验范围，集中人力检验可疑标本和可疑致病菌。 2、由于大多数细菌目前没有血清试剂，而传统生化鉴定试验周期长，操作 繁琐，试剂质量无法保证，严重影响了致病菌确认工作。 3、选择性分离培养的培养基上挑选可疑菌落需要经验，存在漏检的可能。 4、葡萄球菌肠毒素热稳定性很高，加工后的食物虽然检不出，金黄色葡萄 球菌，但仍有可能存在葡萄球菌肠毒素，而肠毒素的常规检验方法需要 做动物实验，难度大，周期长。 鉴于上述原因，我们提出应用“全自动荧光免疫分析仪+API鉴定系统” 的快速检验方案如下：

二、致病菌快速检验系统建议方案 （一）检验流程 本系统能达到的效果 1、葡萄球菌肠毒素：从标本处理到上机检测只需1小时。 2、大肠杆菌O157、沙门氏菌、李司特菌、空肠弯曲菌的检验：在增 菌后1小时内即可完成筛检试验，从而缩小检验范围、明确检验 对象、提高总体检验速度。 3、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等最常 见肠道致病菌的生化鉴定时间缩短到4小时。 4、包括：革兰氏阴性杆菌（108种）、非肠道革兰氏阴性杆菌（64 种）、葡萄球菌（22种）、链球菌（47种）、酵母样真菌（43种）、 厌氧菌（67种）、棒状杆菌（33种）、李司特菌（6种）、奈瑟氏 及嗜血杆菌（10种）、弯曲菌（18种）、芽孢杆菌（24种）、乳酸 菌（52种）、肠杆菌分型（111种）在内的五百多种细菌可以得到 快速、准确的鉴定。

食品中霉菌和酵母分布检测和鉴定-福建疾病预防控制中心

食品中霉菌和酵母分布、检测和鉴定 福建省疾病预防控制中心马群飞 1. 霉菌和酵母的基本特性 霉菌和酵母这种称谓仅是为了方便起见，将小型真菌有真正菌丝的称为霉菌，没有菌丝的称酵母，并没有分类学上的依据。相对于低等的细菌来说，霉菌和酵母生长缓慢，竞争能力较弱，故霉菌和酵母常在不利于细菌生长繁殖的环境中形成优势菌群。由于霉菌和酵母的细胞较大，新陈代谢能力强，故10２～10４个酵母即可引起一克食物的变质，而细菌则需要100倍于此数的细胞。 通常霉菌和酵母适合在高碳低氮有机物如植物性物质上生存。适合的pH 3～8，有些霉菌可以在pH2，酵母在pH 1.5时生活。水活度要求0.99～0.61，霉菌0.85时最适宜，某些嗜渗酵母和霉菌常引起糖果类食品的变质。一般的霉菌的生长温度为20～30℃，部分霉菌可以在不低于－7℃的温度下生长。酵母一般在0～45℃时生长。耐热能力较差，酵母细胞55～56℃几分钟就被杀死。少数霉菌的孢子（如丝衣霉）则可在90℃中耐受 几分钟。霉菌和酵母很多可以耐受防腐剂。如乳酸、醋酸、CO ２和SO ２ 等。有些酵母酯酶 活性高并能合成B族维生素。 2. 食品中酵母的常见类群 在食品中能分离出各种酵母菌，但它们很可能没有什么意义，因为其中多数来源于外界的偶然污染。仅有非常有限的几个酵母属可使经过加工并正常生产工艺包装的食品腐败。比如抗SO ２ 熏蒸的酵母，就是饮料、葡萄酒变质的常见因素。耐受保鲜剂的毕赤酵母，高度嗜氧，可以形成泡菜和酱油的表面膜。 当然，如果不按照标准的生产程序进行食品生产，那么许多外界污染的酵母都将在食品中大量繁殖，这种情况下，就谈不上优势菌群问题了，也不必进行酵母的分类鉴定。处理方法只有一个，恢复正常的生产程序。 2.1 乳制品：鲜奶易因细菌污染而腐败，酵母菌不是重要问题。当鲜奶被加工成奶油、乳酪、酸奶等制品后，由于细菌被抑制，酵母可相应地成为优势菌。它们使奶油、乳酪产生怪味和气体，使黄油产生有味物质，并可使酸奶和酸乳酪腐败。在实验室中，汉逊德巴利酵母、布提利假丝酵母、多孢丝孢酵母和红酵母均能导致固体和液体乳酪的腐败。 2.2 肉类与肉制品：通常情况下，这类制品适于细菌的生长，酵母不是引起变质的主要原因。某些德巴利酵母可使冷冻的猪、牛肉香肠和午餐肉表面出现令人不愉快的粘滑感觉。

酵母样真菌鉴定及应用

酵母样真菌鉴定及应用 发表时间：2010-12-08T15:24:38.397Z 来源：《中外健康文摘》2010年第32期供稿作者：赵立春 [导读] 近年来随着广谱抗生素、免疫抑制剂广泛应用和机会致病菌的医院感染包括临床深部真菌感染增多 赵立春（黑龙江省哈尔滨市香坊区结核病防治所化验室150036） 【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2010）32-0440-01 近年来随着广谱抗生素、免疫抑制剂广泛应用和机会致病菌的医院感染包括临床深部真菌感染增多，特别是肺结核病人或肺部疾病患者，因药物治疗时间长，在杀死致病菌的同时，也杀死正常菌群，造成人体内微生态障碍，菌群失调，在肺结核等肺部疾患基础上继发支气管肺部酵母样菌感染，所以从肺部疾患病人中分离酵母样真菌，快速鉴定并及时治疗非常有意义。 我国现在快速、准确鉴定酵母样真菌的方法很少，近年国外开发的手工和自动化微量鉴定系统已大大简化了传统鉴定程序，但难已在中小医疗机构推广应用，我们研制的微量鉴定系统，通过与传统鉴定方法及生物梅里埃Api20c鉴定系统对比性评价，并经数家医疗单位临床应用，证明本系统具有可靠、快速、简便和价廉等优点，可推广为临床常规方法，报道如下： 1 材料与方法 1.1 菌株来源：主要来自香坊区结核病防治所，治疗一个月以上肺结核、脑膜炎、慢性支气管炎等患者，从痰中分离出2-3次同一种菌株。标准菌株为中国科学院微生物研究所“真菌国家开放专业实验室质控菌株。 1.2 试剂：葡萄糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、密二糖、纤维二糖、肌醇、棉子糖、海藻糖、卫矛醇、草糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖醇、赤藓醇、山梨醇、尿素、KNO3、KH2P4、NaHPO4和MgSo4、7H2O系分析纯。优质琼脂粉、玉米粉、酵母浸膏和吐温80。 1.3 90mm培养皿或U形塑料凹孔盒、新华Ⅲ号滤纸、打孔器等。 1.4 生物梅里埃公司生产的API——20C鉴定卡。 1.5 酵母菌编码鉴定手册：0.5麦氏单位，1麦氏单位、2麦氏单位比浊管。 2 微量鉴定系统制备 2.1 基础培训基：琼脂20g、酵母浸膏0.2g、MgSo4、7H2O0.5g、PH6.8PBS加至1000ml。加热溶解，分装后经8P、15分钟灭菌。存于4℃可用2个月。 2.2 玉米吐温琼脂：制成小安瓶备用。 2.3 生化基质制备：糖醇配方：糖或醇2.0g、B族维生索0.2mg、2％溴甲酚紫0.2ml，蒸馏水加至10ml。尿素配方：尿素5.0g、葡萄糖0.1g、B族维生素0.1mg，蒸馏水至10ml。硝酸盐配方：KNO32.0g、葡萄糖0.5g、B族维生素0.1mg，蒸馏水至10ml。阴性对照配方：不含糖、醇、尿素和硝酸盐，余皆相同。将6×6mm滤纸圆片浸入上述各基质液中，10分钟，取出置70℃烤干，经随机抽样无菌试验后，分装于小瓶中密封，-20℃可用一年以上。 2.4 沙保弱培养基按常规自配。 3 实验程序 3.1基础菌悬液制备：排取沙保弱氏之新鲜培养菌落以生理盐水制成0.5麦氏单位的菌悬液。基础培养基经隔热煮沸溶解，冷却至50℃，与菌悬液等量混合，置于50℃水溶备用。 3.2 操作步骤：各种基质纸片、阴性对照纸片按顺序置于分格的无菌平皿底部或U形塑料盒之凹内。消毒试器吸取上述菌悬液，每种纸片上滴加3滴，接种针挑取少许培养菌穿刺接种于玉米粉吐温琼脂。置于温盒、30℃孵育。 3.3 结果读取和判断：绝大部分酵母样真菌在24—48小时即可读取结果，个别种属需72小时。碳源同化阳性：培养基呈黄色与对照相比呈+～3+混浊；阴性呈紫色且不混浊。尿素水解阳性为红色；阴性为淡黄色不变。硝酸盐还原需以常规硝酸盐还原甲、乙两液依次加2滴，显红色为阳性；不显红色为阴性。玉米粉吐温球脂脂生长菌落用显微镜观察厚孢子、孢子及菌丝体。 4 评价方法 4.1 传统方法：包括形态学的质膜孢子、孢子、菌丝体及芽管形形成，糖醇同化，糖醇发酵（制成安瓶封装），尿素水解（安瓶封装），硝酸盐还原，氮源同化等。 4.2 标准菌株与传统鉴定方法．API20C鉴定止，微量鉴定系统鉴定比较。 4.3 41株临床分离酵母菌用APl20C鉴定卡与微量鉴定系统鉴定比较。 4.4 98株临床分离醇母菌用传统法与微量鉴定系统鉴定比较。 5 结果 5.1 6种标准酵母株用传统鉴定方法，APl20C鉴定卡与微量鉴定系统三种方法鉴定符合率100％。 5.2 与APl20C鉴定卡鉴定结果比较：对6种41株临床分离酵母菌用两种方法分别进行鉴定,两者的符合率为95.1％，两法结果不符的两株菌经传统方法鉴定和微量法重要鉴定是由于木糖、棉子糖、卫矛醇生化基质含量不均匀所致的鉴定错误。 5.3临床应用评价：徽量鉴定系统与传统方法之间的鉴定符合率达98％，其中2株鉴定错误的原因是由于接种菌悬液不符合要求致乳糖、密二糖、肌醇、棉子糖的同化结果变异。厚膜孢子和菌丝形成不良。经重点鉴定均可纠正，故提示其误差属随机性。 6 讨论 我们研究设计了以20种生化试剂辅之形态学观察的微量鉴定系统。本系统试剂制备的技术关键是在基础和纸片基体中加入了营养性添加剂和适当缓冲容量的缓冲剂。前者能够提高对基质利用菌的生长速率，但不改变其性质，大部分生长较快的酵母菌，在24—48小时即可显示阳性结果，少数生长缓慢者如隐球菌属在72小时亦可呈现阳性结果。后者可以防止酸性琼脂和孵育过程中CO2溶入培养基引起假性颜色改变，缓冲容量初确定因各种试剂的批号和来源不同，不可一概而论，一般应为0.015mo1／l。其容量应仅能缓冲各种基础试剂．基质试剂和CO2溶入的酸碱效应而又不缓冲醇母样菌分解碳源产生的酸。本法各种同化反应是以生长浊度和PH改变的双重指示判断结果，所以，试验结果具有较高的可靠性。经实验证明鉴定具有快速、简便和价廉等优点，适合中、小型实验室使用。 试验过程中，应注意无菌操作，接种菌悬液的最终浓度相当1／4麦氏单位，过浓过淡均不利于结果的判断。

真菌检测方法

分离培养：无菌采取病料接种马铃薯琼脂培养基中，置37℃恒温箱中培养24小时，长成绒毛样菌丝，未见其它细菌生长。经48小时培养长成白色菌落。72小时菌落呈纽扣状，由中心向外周逐渐变深，转变成灰白色、灰绿色。取培养物镜检可见大量球形的分生孢子。 通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部真菌，包括皮肤癣菌、孢子丝菌、念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌等。而霉菌多为细胞真菌的一种，也为深部感染真菌，包括烟曲菌、黄曲菌、黑曲菌、土曲菌等，常发生于免疫力低下的患者，引起全身播散性感然，影响预后。 培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。目前国标方法中使用的培养基有:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA),孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO),其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长,而CAO则适合于高渗性霉菌生长,酵母菌几乎不长。在日常检测中我们发现,有些常见的耐高渗性霉菌,如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生长非常缓慢或不长,而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18(M40Y琼脂配方:蔗糖400g,麦芽提取汁20g,酵母提取汁5g,琼脂20g,氯霉素50mg,蒸馏水1000ml;DG18琼脂配方:葡萄糖10g,蛋白胨5g,KH2PO41g,MgSO4·7H2O 0.5g,氯霉素0.1g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH6.5)上则正常生长,孢子、形态特征发育良好,而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长,因此,若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养各类样品中的霉菌,将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特别是对干燥食品、高糖食品、淹渍食品等,更有必要同时采用M40Y或DG18。 由于霉菌中很多种类不会产生有毒的霉菌毒素,危害较小,而有的菌株即使污染数量不多,但其产生的霉菌毒素却危害较大,因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度,重要的是要知道污染菌的菌相,才能更好地判断被污染食品的安全程度。为此,国外有些研究者设计出各类选择性培养基,可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方:酵母提取汁20g,蛋白胨10g,柠檬酸铁铵0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH5.6)用于分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培养2~3天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落,非常容易识别。有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了满意的结果。因此,针对不同样品,有目的地设计出相应的选择性培养基,以筛选污染菌中的危险菌群,将是一个值得探索的方向。 2接种方式 接种方式主要有倾注法和涂布法两种。目前国际方法中采用倾注法,但近来国际上有不少学者认为霉菌计数采用涂布法更合适。Beuchat和Matsuda等人分别对这两种方法作了大

酵母菌的死活细胞鉴定

酵母菌的死活细胞鉴别与镜检计数 一、实验目的 1.掌握鉴别酵母菌细胞死活的染色方法。 2.了解血球计数板的构造，掌握利用它进行酵母菌计数的方法。 二、实验步骤 1.酵母菌血球计数板镜检计数 1)取一块盖玻片，加盖在血球计数板中央计数室上方。 2)用滴管吸取菌悬液滴于盖玻片的边缘，通过毛细作用渗入计数室，注意不能有 气泡产生，然后放置于载物台，静止5min，使细胞全部沉降到其表面。 3)高倍镜镜检，数对角线上5个中方格中细胞的总数，再计算出菌悬液浓度。为 了减少误差，应注意对样品适当稀释，以每个小方格中平均4~6个细胞为佳； 另外，也可对同一样品重复计数，取其平均值。 附:计数板的结构及测定原理 利用血球技术板镜检技术是一种常用的计数方法。血球计数板是一块比普通载玻片厚的特质玻片，其上有四条凹槽，构成三个平台，中间比较宽，其中央又被一短横槽隔成两半，每半边各有一个计数区，其上有9个大方格，只有中央的一个大方格为计数室供计数用。这一大方格的长宽各为1mm。加盖盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的距离为0.1mm，因此计数室的容积为0.1mm3。 目前血球计数板常用的是25格×16格型，其计数室被分成25个中格，其中每个中格又分为16个小格，故计数室共有400 小格。 计数时，首先把适当浓度的菌悬液注入计数室，然后在显微镜下计数，一般数对角线上5个中方格（共80个小方格）中细胞总数再根据下式求得菌悬液的浓度 细胞个数=5000A×B 式中A---5个中方格中细胞总数 B---菌悬液的稀释倍数 三、实验结果

个数:30 37 11 25 21 24 17 27 28 25

临床酵母样真菌感染特点及药敏分析

临床酵母样真菌感染特点及药敏分析 目的通过了解沈阳医学院沈洲医院检验科微生物室收检的各类临床标本中分离到的各类酵母样真菌的菌群分布特点及耐药情况，从而指导临床合理使用抗真菌药物、有效预防真菌感染和耐药性的发生。方法所有菌株均分离自沈洲医院临床送检的痰液、尿液、粪便、咽拭子、分泌物等。实验采用贝瑞特公司的沙保弱琼脂培养基分离培养真菌，用法国生物梅里埃公司生产的ATB Expression 微生物半自动鉴定/药敏分析仪进行真菌鉴定和药敏分析。结果临床酵母样真菌检出率最高的为白假丝酵母菌（65.6%），其次为热带假丝酵母菌（13.9%）、光滑假丝酵母菌（11.1%）、近平滑假丝酵母菌（6.1%）、其他酵母样真菌（3.3%）；180株酵母样真菌对5种抗真菌药物（两性霉素B、5-氟胞嘧啶、伏立康唑、伊曲康唑、氟康唑）的平均耐药率依次为2.1%、5.5%、22.3%、25.6%、39.6%。结论180株酵母样真菌中，白假丝酵母菌检出率最高，其次为热带酵母菌；标本来源中痰液标本所占比例最高，其次为便和尿液标本；耐药监测中酵母样真菌对两性霉素B耐药性最低，对氟康唑耐药性最高。 标签：酵母样真菌；抗真菌药物；药敏试验；耐药 真菌广泛存在于自然界，并寄生于人体皮肤和黏膜，属于条件致病菌。近年来，由于广谱抗生素、抗肿瘤药物、激素和免疫抑制剂在临床的广泛应用，器官移植及导管技术的开展以及艾滋病和糖尿病发病率的不断上升，真菌感染的发病率呈上升趋势，临床上分离到的酵母样真菌菌株逐年增多，加之抗真菌药物有限，而耐药率有增无减。因此，加强真菌感染的控制及药物监测，有效防治真菌感染及提高治愈率已成为目前临床医学领域中的一个重要课题。现将沈洲医院2011年1～12月临床标本中分离到180株的酵母样真菌分布及耐药情况报道如下： 1 材料与方法 1.1 标本来源 180株酵母样真菌均分离自沈洲医院2011年1～12月临床送检的痰液、尿液、粪便、咽拭子、分泌物等。 1.2仪器与试剂 ATB Expression半自动鉴定仪及其配套鉴定板（法国生物梅里埃公司）；沙保弱琼脂培养基（贝瑞特公司）。 1.3 研究方法 1.3.1 培养鉴定标本接种于沙保罗培养基30℃培养24 h，涂片染色确认为酵母菌后，严格按操作说明书接种法国生物梅里埃公司生产的ATB ID32C鉴定条，并用ATB Expression半自动鉴定仪进行鉴定。 1.3.2 药敏试验将分纯的菌种严格按操作说明书接种法国生物梅里埃公司生产的ATB Fungus 2真菌药敏板条。该板条包括5种抗真菌药物：5-氟胞嘧啶（5-FC）、两性霉素B（AMB）、氟康唑（FCZ）和伊曲康唑（ICZ）、伏立康唑。该法为微量稀释法，用ATB Expression鉴定仪读取最小抑菌浓度（MIC）。 2 结果 2.1 酵母样真菌分类及在各种标本中的分布 临床酵母样真菌检出率最高的为白假丝酵母菌（65.6%），其次为热带假丝酵母菌（13.9%）、光滑假丝酵母菌（11.1%）、近平滑假丝酵母菌（6.1%）、其他酵母样真菌（3.3%）。详见表1。

酵母菌死活鉴定和显微镜检测

实验二酵母菌的死活鉴定和显微镜计数 一、实验目的 学习血球计数板使用的原理与方法，学习区别死活酵母的方法。 二、原理 测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微直接计数和平板计数法。 镜检计数法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，菌体较大的酵母或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌采用彼得罗夫?霍泽细菌计数板，两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察，而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。 血球计数板的构造 血球计数板是一块特制厚玻片。玻片上由四道槽构成三个平台，中间的平台分成两半，其上各刻一个相同而有一定面积的小方格网。方格的刻度有两种规格。一种是25×16，称为希里格式血球计数板，分为25大格，每大格又分为16小格；另一种是16×25，称为麦氏血球计数板，分16大格，每大格分为25小格。总数都是400小格（如图所示）。 每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1/400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3，使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数量，再换算成每毫升（或每克样品）中微生物细菌的数量。

三、实验材料 1、菌种：酵母菌 2、仪器：显微镜、血球计数板 3、材料：盖玻片、吸水纸、滴管 4、染料：美蓝染液 四、实验步骤和内容 1、视待测菌液浓度，加无菌水做适当稀释，以每小格菌数5-10个为宜，准确计算稀释 倍数。 2、取清洁干燥的血球计数板，加盖玻片盖住网格和两边的槽。 3、将待测菌液充分摇匀后，用无菌吸管吸少许，由盖玻片边缘或槽内加入计数板来回推压盖玻片，使其紧贴在计数板上，计数室内不能有气泡。静置5-10分钟。 4、在低倍镜下找到小方格网后更换高倍镜观察计数，上下调动细螺旋，以便看到小室内不同深度的菌体。位于分格线上的菌体，只数两条边上的，其余两边不计数。如数上线就不数下线，数左边线就不数右边线。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因为观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。凡酵母菌芽体达到母细胞一半时，即可作为两个菌体计算。 5、计数时若使用刻度为25×16（大格）的计数板，则数四角的4个大格（即100小格）内的菌数。如用刻度为16×25（大格）的计数板，除数四角的4个大格外，还需数中央1个大格的菌数（即80小格）。 6、每个样品重复计数2-3次，取其平均值，按下式计算样品中的菌数。 刻度为25×16（大格）的计数板：

川芎内生真菌的分离与鉴定

川芎内生真菌的分离与鉴定 汪杨丽，严铸云，郭晓恒，宋杰，陈新，万德光 成都中医药大学药学院中药材标准化实验室，四川成都 (610075） E-mail：wangyangli27@https://www.wendangku.net/doc/007055304.html, 摘要：目的：探讨川芎内生真菌类群与川芎品种和产地的关系。方法：采用平板分离法分离川芎的内生真菌，采用点植法对分离菌株进行分类鉴定。结果：从6个产地的川芎根茎样品共获得内生真菌50株，经形态观察分类鉴定为1纲、3目、4科、13属。结论：不同产地及不同品种川芎的内生真菌在数量、分布、种群及其组成存在差异，推测川芎的道地性可能和川芎内生真菌种群有关。 关键词：川芎，内生真菌，分离鉴定 川芎为伞形科（Umbelliferae）藁本属植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根茎，具有活血行气、祛风止痛的功效，是著名的川产道地药材。四川都江、彭州为川芎的主要产区。此外，云南丽江、甘肃庄浪和华亭、江西等地也产，分别称“云芎”、“西芎”、“抚芎”[1～3]。有关不同产地及不同品种川芎的化学成分品质、药理、药效的研究报道较多[4]，但至今未见从川芎根茎分离内生真菌及其内生真菌种群多样性的研究报道。根据内生真菌和植物互惠共生的关系[5，6]，本文对不同产地及不同品种的川芎进行内生真菌的分离，探讨川芎在特定生境中的微生物群落结构的特征。 1. 材料与方法 1.1材料 1.1.1植物来源（见表1） 1.1.2 培养基 PDA培养基[7]（马铃薯葡糖糖培养基）＋青链霉素混合液[8]（用于分离）；PDA 培养基；促孢培养基（KH2PO41g、KNO31g、MgSO4.7H2O 0.5g、KCl 0.5g、淀粉0.2g、葡萄糖 0.2g、蔗糖 0.2g、琼脂15～20g、蒸馏水 1000ml、PH自然)。 表1 各种川芎的样品情况 药材名原植物部位采集地采集时间 川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 根茎四川彭州敖平2006.5.20 川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川都江堰石羊2006.5.22 山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川彭州小鱼2006.7.24 山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川汶川水磨2006.8.10 西芎L. sinense Oliv. 根茎甘肃平凉市华亭马峡2006.9.14 云芎L. chuanxiong Hort. cv. Jinxiong根茎云南丽江泸沽湖2006.8.17注：以上品种经成都中医药大学严铸云副教授鉴定 1.2方法 1.2.1. 内生真菌的分离先去掉新鲜川芎的须根，用自来水将川芎根茎表面洗净，用5%的NaClO溶液浸泡5min，用自来水反复的漂洗，稍干后切成适宜大小的小块，在无菌的条件下，用75％酒精中浸泡5 min，用无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干，然后用无菌刀片将表皮削去，分别切成5 mm×5 mm×1 mm的小块种植于PDA培养基内，每个培养皿中放7小块，每个样品6个培养皿，置28℃恒温箱中培养3～15d，观察到培养基上从各植物组织块内部向周围

线索细胞、真菌感染(有图)

线索细胞 线索细胞是指阴道脱落上皮细胞上粘附大量加特纳杆菌等厌氧菌的一种形态表现，阴道分泌物中出现大量线索细胞，一般预示患了细菌性阴道病，当然还要结合其它几项重要指标来确诊，一般是PH值，胺试验及分泌物性状等指标。 线索细胞即阴道脱落的表层细胞，于细胞边缘贴附大量颗粒状物即加德纳尔菌。细菌边缘不清。 加特纳球杆菌 加特纳球杆菌（GV）最初是1954年Gardner从阴道炎病人的阴道分泌物中分离出来的与非特异性阴道炎相关的致病菌,过去 一直将细菌性阴道病称为非特异性阴道炎（nonspecific vaginitis， nsv），后来研究人员从患者阴道分泌物中分离到了阴道嗜血杆菌（haemophilus vaginalis），故称为阴道嗜血杆菌性阴道炎（haemophilus vaginalis vaginitis），阴道嗜血杆菌也称为加特纳菌，故又称为加特纳菌阴道炎（gardnerella vaginalis vaginitis）。为了统一起见，1984年确定为细菌性阴道病。该病可导致急性输卵管炎，早产及新生儿围产期并发症。应引起高度重视。 加特纳菌属是一种单一菌的菌属。是一个新发的菌属，加特纳菌为部分变异成为球菌样小杆菌，菌体小，两端呈园形，无荚膜，无鞭毛，营养性厌氧生活，部分专性厌氧。菌体长0.3-0.45μm,宽0.1-0.2μm，形体比乳酸杆菌小，呈多形性。培养的最适ph值6.0-6.5，在ph值小于4.0，不能生长。不产胺，也不产生过氧化氢酶和氧化酶。h2o2抑制试验阳性。糖发酵产物主要是乙酸。电镜下显示细胞壁的薄片有迭成的结构，并含有脂多糖。 加特纳菌性阴道炎[1]又名嗜血杆菌性阴道炎，以前曾归于棒杆菌性阴道炎，是由加特纳杆菌引起的一种阴道粘膜炎症，可通过性交传染。故列为性传播疾病。大量研究表明：在性关系混乱的人群中，加特纳菌性阴道炎有高流行率。与患者发生性关系的男性伴侣中，90%的尿道中可发现此菌。 加特纳杆菌为革兰氏阴性细小杆菌，常呈球杆状，有时呈丝状和多形状，常见两极染色。仅0.4～0.6毫微米至1～2毫微米大小，无活动力、无鞭毛、无芽孢。许多菌株有荚膜。在人工培养时必须给予新鲜血液才能生长繁殖，故有“嗜血”之称。但其生物特性与嗜血杆菌不尽相同，临床上引起的阴道炎为非特异性阴道炎。 [2]加特纳杆菌引起的感染多数较轻，多见于性活跃妇女。急性期白带增多，有鱼腥或氨的臭味，外阴潮湿不适，常伴有阴道灼热感、性交痛及外阴瘙痒。

一种抗真菌抗生素的分离纯化及初步鉴定

一种抗真菌抗生素的分离纯化及初步鉴定 摘要:从海南五指山采集的土样中分离到一株放线菌,编号为WS-23883,其发酵提取物对多种植物病原真菌具有很强的抑制活性?对其产物进行提取精制及制备液相纯化,获得了纯度达90%以上的化合物?生测表明,在20 μg/mL浓度下该抗生素对多种植物病原真菌的抑制率达100%?根据活性产物紫外吸收光谱,可判断其为一多烯大环内酯类抗生素?质谱分析表明,活性化合物分子质量约667 u,据此判断其为一四烯大环内酯类抗生素? 关键词:多烯大环内酯;抗生素;化合物;纯化;鉴定 Isolation, Purification and Preliminary Identification of A Kind of Antibiotic with High Antifungal Activity Abstract: One actinomyces strain WS-23883 was isolated from soil sample collected in Wuzhishan Mountain area, Hainan province. The extraction of the fermentation broth was bioassayed with some plant disease pathogens; and it exhibited high antifungal activity. The compound with purity above 90% was obtained through macroporus resin column absorbtion method and preparative HPLC. The bioassay showed that the inhitition ratio was 100% at the concentrition of 20 μg/mL. The UV absorption spectrum and mass spectrum showed that the compound was atetraene macrolide antibiotic. Key words: polyene macrolide; antibiotic; compound; purification; characterization 从海南五指山采集的土样中分离到一株放线菌,其发酵提取物对多种供试植物 病原真菌及某些腐生真菌具有很强的抑制活性?采用常规方法对该菌的发酵产物进行了提取精制,得到了纯度在90%以上的样品,从目标产物的紫外吸收光谱可判断其为一多烯类抗生素?HPLC-MS检测表明,活性产物分子离子峰为667,可以确定其分子质量约为667 u,综合分析后确定其为一四烯大环内酯类抗生素? 1材料与方法 1.1菌株 1.1.1抗生素产生菌编号为WS-23883,从海南五指山采集的土样中分离得到,由湖北省生物农药工程研究中心保存? 1.1.2生测指示菌番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)?小麦颖枯病菌(Septoria nodorum)?小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)?水稻纹枯病菌(Rhizoctonia

酵母菌分类方法研究张金龙

酵母菌分类方法研究 学生姓名：张金龙 系别：农学系 专业班级：生物技术2班 学号： 0701024228 指导老师：卢显芝 2010年6月

摘要：酵母菌是一个复杂的类群,其分类系统经数代酵母菌分类学家的努力正日趋完善,分类学方法也随着科学技术的进步而不断深化, 尤其是近年来发展起来的分子分类学方法给整个生物系统学和进化研究方法注入了活力,也使酵母菌的系统发育研究更接近于生物起源的本质。 关键词：酵母菌分类方法化学分子生物学技术 酵母菌是一类单细胞的真核微生物的通俗名称，并非是系统分类单元。酵母菌属于真菌，是具有核膜与核仁分化的较高等的微生物，细胞内有线粒体等较复已杂的细胞结构。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子（子囊孢子和担孢子）的能力，可将酵母菌分成3类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌。在真菌分类系统中分别属于子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类。[1]与其他微生物相比，尤其是细菌和丝状真菌，酵母菌的种数很少，但是其分布范围却很广泛。酵母菌大多数为腐生，生活在含糖量较高和偏酸性的环境中，如水果、蔬菜、花蜜及植物叶子上，尤其是果园、葡萄园和菜园的土壤中较多。 由于酵母菌拥有丰富的酶系统和蛋白质，对高糖环境、高碳环境、高渗透压环境等具有较强适应性，可以为其他生物体提供营养物质，可以代谢重金属或者降解某些难降解的物质，维持生态环境的稳定。[2]因此分类研究作为其他各方面研究的基础，研究手段不断改进，分类系统不断更新。 其中大致有三种分类方法：传统分类方法、化学分类方法、分子生物学分类方法。 1 传统分类方法 传统分类学方法是酵母菌分类学方法的基础 ,包括形态学特征和生理生化特征。形态学特征包括宏观特征(菌落特征)、微观特征(细胞形态、无性繁殖方式、有性生殖方式、孢子类型、假菌丝的形成)等；生理生化特征包括对糖发酵和碳、氮源化合物同化的能力 ,对外源维生素的依赖性和不同温度下的生长能力等生理学特性。经典分类学方法在酵母菌分类学中占有重要地位 ,当前权威的酵母鉴定系统就是在此基础上建立并发展起来的。 然而,它存在的局限性也是不容忽视的。酵母菌形态学特征可能随着培养基的改变而发生变化,因此必须采用标准化方法;有些种类或结构不同的碳水化合物具有相同的代谢途径 ,它们所反映的遗传基础是有限的;有些双糖、寡糖和多糖代

酵母样真菌药敏试验

一、目的： 指导实验人员准确完成酵母样真菌药敏试验（微量稀释法）。 二、适用范围： 怀疑酵母样真菌感染患者 三、检验原理： ATB FUNGUS 3试条包括16对杯状凹cupules。第一对不含任何抗真菌剂。用作阳性生长对照。另外的15对包含不同稀释度的5种抗真菌剂。用于测定最小抑菌浓度（MIC）和（或）区分临床敏感性。 将准备好的待测酵母样真菌的悬浮液转移到培养基中，并接种到试条上。孵育后，我们可以通过肉眼判读，或者应用A TB仪器或miniAPI判读杯状凹中液体的生长情况。获得MIC(两性霉素B[AMB])，氟康唑[FCA],伊曲康唑[ITR],伏立康唑[VRC],5-氟胞嘧啶[5FC]),将菌株分为敏感、中介或耐药。 四、职责：生物梅里埃 实验人员准确完成酵母样真菌药敏试验（微量稀释法） 试剂厂家： 规格：25测试／盒 内含物：-25个独立包装的A TB FUNGUS 3 试条，包括干燥剂 -25个孵育盖 -25安瓿A TB F2培养基 -25张结果记录单 -一份说明书 五、储存条件及有效期： 在包装盒上指示的有效期前，试条和培养基应在2-8℃下存放。 有效期为12个月。 六、工作程序： (一)试验的准备： 1、从包装中取出试条 2、在试条延长翼上记录下被测酵母菌株的编号 （二）接种物的准备： 1、打开一个API?0.85%氯化钠培养基安瓿（或API培养悬液） 2、采集不超过4天的菌落，制备成浊度相当于2 McFarland的悬浮液 3、用McFarland试剂盒的标准浊度管比较，或使用ATB比浊仪DENSIMAT 4、此菌悬液必须在准备后立即使用 5、使用一移液管转移20ul此悬浮液到一A TB F2培养基的安瓿中 （三）试验条的接种： 手工接种： 1、用ATB电子移液管混匀A TB F2培养基，避免产生气泡 2、使用ATB电子移液管在每个杯状凹中加入135ul的ATB F2 培养基（大约3*104酵母菌/毫升或4*103酵母菌/杯状凹）