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荧光探针设计原理

荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。

图1．1 荧光探针的结构

1.1.1 荧光探针的一般设计原理

(1) 结合型荧光探针[２1］

Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output

signal

图1．２共价连接型荧光探针

结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ）受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光

基团之间能通过连接基进行信号传递,对识别对象的识别信息(如荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等）可以及时传递出去。

N N

图1.3 共价连接型锌离子荧光探针

De Siｌｖａ在199７年报道的化合物１[22]是一个典型的共价连接法设计的荧光探针。它分别以有优良光学性质的蒽作为荧光基团,以对Zｎ２+有特异性识别的基团双( 2-吡啶甲基)氨(ＤPA)为识别基团，通过亚甲基将识别基团和荧光报告基团连接在一起。通过对比加锌前后荧光强度的不同实现了对锌离子的检测。

（２）置换型荧光探针

图1.４置换型荧光探针

利用该方法设计的荧光探针是通过识别基团分别与荧光指示剂和被分析物结合能力的强弱来实现对被分析物的检测。该类传感器对识别基团和荧光指示剂的要求都比较高,既要选择能和识别基团结合但结合能力又不是特别强的荧光指示剂,又要设计对被分析物能特异识别的识别基团。该类设计方法多用于阴离子传感器的设计。

20０2 年，Kｉｍ小组[2３］设计了邻苯二酚紫作为荧光指示剂,双锌配合物为HＰO４2－识别基团，并将二者自组装成化合物２，用于中性条件下水溶液中HPO4２-的检测。加入识别客体HＰＯ42-后,由于HPO42-与双锌配位能力强于邻苯二酚紫,从而把邻苯二酚紫挤开，使之进入溶液，表现为其原来颜色。在识别过程中,溶液颜色从蓝色变为黄色,常见的Ac－、CO32-、NO3-、N３-、ＣlＯ４-、Ｓ2－、F －、Cl-、Bｒ－都不影响HPO42-的检测，表现出较好的选择性。

图1.5 置换型HPＯ42-化学传感器

(3)化学计量型荧光探针（cheｍodoｓiｍeter）

化学计量型荧光探针分子是利用探针分子与识别客体之间特异不可逆的化学反应前后产生荧光信号的不同而对分析对象进行检测的一类探针[24］。主要包括两种类型:一类是目标离子和探针分子发生化学反应后仍旧通过共价键相连接：另一类是目标离子催化了一个化学反应（图1.6)。

图１.6化学计量法的两种类型

一般而言,化学计量型荧光探针分子都具有专一性和不可逆性。尽管这类探针已有不少报道,但由于设计较为困难和反应不够灵敏等缺陷而进展较为缓慢。

图1.7 氨基酸荧光分子探针

Kim和Hoｎg等[２5]设计的识别半胱氨酸及高半胱氨酸的荧光分子探针3,属于第一种类型。他们利用半胱氨酸及高半胱氨酸与醛生成五元噻唑环或六元噻嗪环的特异反应以及反应前后化合物3和4荧光性质的显著差异实现了对半胱氨酸及高半胱氨酸的高选择性检测。

化合物５[26]是较早应用化学反应原理实现检测客体的荧光探针,属于第二种类型。化合物５的乙腈溶液中加入汞离子后荧光显著增强(3４倍)并红移,进一步用质谱检测发现生成了脱硫产物6。

图1.8 基于汞脱硫原理的汞离子荧光探针

1.１.2 荧光分子探针的响应机理

目前，荧光分子探针的响应机理主要有以下几种：光致电子转移(PEＴ，pｈoｔo－induced electrｏnｔransfer）、分子内电荷转移(ICT, inｔｒamolecｕlａrｃharge trａnsfｅr）、荧光共振能量转移(FRＥT, flｕｏreｓｃencｅresoｎaｎｃｅeneｒgy tｒａnsfer）等。（1) 光诱导电子转移原理(PＥT）

光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后,激发态的电

子给体与电子受体之间发生电子转移的过程。典型的光致电子转移荧光探针体系是由具有电子给予能力的识别基团R通过连接基团S和荧光基团相连组成的功能分子。

一般情况下,荧光分子探针的识别基团是电子给体，荧光基团是电子受体，并且通常情况下多采用含有氨基的基团作为识别基团。具体ＰET工作过程如下：在识别基团与待测物种结合之前，当荧光基团受激发，具有给电子能力的识别基团能够使其处于最高占据轨道的电子转入激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光，导致荧光基团的荧光猝灭。而识别基团与待测物种结合之后,由于降低了识别基团的给电子能力，光致电子转移过程被减弱或者不再发生，荧光基团的荧光发射得到恢复（如图1.9)。

图１．９荧光分子光致电子转移的“开”“光”过程示意图。

由于与待测物种结合前后的荧光强度差别很大，呈现明显的“关”、“开”状态，因此这类荧光分子探针又被称为荧光分子开关。ＰET荧光分子探针的作用机制可由前线轨道理论[２]来进一步说明（见图1.10)。从图可以看出，识别基团处于自由态时，其HＯMO轨道上的电子可以向荧光基团的HOＭO轨道上转移,致使荧光基团被激发到LUMO上的激发态电子不能返回基态而难以产生荧光，此过程对应于发生PET现象。在识别基团与待测物种结合后,识别基团上的HOMO电子已无法转移到荧光基团的ＨＯMO轨道上，使PET过程无法进行,这时荧光基团的激发态电子可以返回基态，产生荧光。由此可见,利用识别基团对ＰEＴ过程的控制可以实现对体系荧光发射状态的调控。

荧光团结合受体前荧光团结合受体后

图1.10 光致电子转移机制机制的前线轨道理论解释。

化合物１是一个非常典型的PET机理荧光增强型的例子。锌离子不存在时，由于识别基团中氮原子上的孤对电子能够在荧光基团受激发态时占据激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光,导致荧光基团的荧光猝灭,即发生了光致电子转移(PET）。当Ｚｎ2＋存在时，Zn2+离子与两

个吡啶氮及氨基配位,束缚了氮上的孤对电子,使发生在氮原子和荧光团之间的PＥＴ过程被禁阻,荧光强度大幅度增强．实验结果也证实了此过程。在乙腈溶液中，加入Zn2＋离子之前,化合物1的荧光量子产率仅为0.０１;加入Zn2+离子之后，它的荧光量子产率为０.７7,荧光增强了７7 倍。

(2）分子内电荷转移( ＩCT )机理

分子内电荷转移荧光探针分子通常由富电子基团（电子给体）和缺电子基团（电子受体)共轭相连，形成推－拉作用的共轭体系，没有ＰEＴ探针分子那样明显的连接基。也就是说荧光团Ｆ和受体Ｒ通常融合在一起,识别过程二者同时参与。当受体结合被分析物后，作为受体的供电子部分或拉电子部分的供拉电子能力被改变,整个共轭体系的电荷重新分布，荧光团的推－拉作用被抑制或强化，进而导致吸收光谱、激发光谱以致发射光谱发生红移或蓝移（如图1.１1）［2７］。

化合物7[2８]两端分别含有羰基、苯并噻唑两个强拉电子基和两个氨基强供电子基团,激态时荧光团能够有效地实现了从供体到受体的整个体系电荷分离,是典型的ICT机理的荧光分子探针。当汞离子存在时,四氨基识别基团捕获Hg2+离子, 6,7位氮的供电子能力大大减弱，减弱了整个体系电荷分离程度，引起吸收波谱和荧光光谱分别蓝移了60ｎm 和92 nm ，荧光颜色由蓝色变为黄色,同时实现了比色及比率型Hg2＋离子的检测。

移动示意图

图1．1２具有D-Ａ结构的IＣT汞离子荧光探针

(3) 荧光共振能量转移(ＦRET)机理

荧光共振能量转移是指当一对合适的能量给体分子（Donor)和受

体分子(A ｃｃe ｐt ｏr)相距一定距离（一般为2-５ n ｍ),且给体的发射光谱与受体的吸收光谱能有效重叠时，处于激发态的给体将把一部分或全部能量转移给受体,使接受体被激发的过程。受体可以是荧光物质也可以是只有吸收而没有发射的荧光猝灭剂。根据F?ｒs ｔe ｒ理论，共振能量转移效率可以用式１.5 表示［2９］:

6011

??????+=R R T φ （1.5）

式中R 为两个荧光基团的距离，Ｒ０为F?r ｓte ｒ距离(供体-受体之间

的临界转移距离）。从这个方程可以看出,即使R 的微小变化都会导致

能量转移的效率强烈改变[２４-26]。

图１．13具有D-A 结构的ＦRET 汞离子分子荧光探针利用FR ＥＴ效率对距离的强的依赖性,ＦＲET 广泛应用于蛋白质和核酸的结构及动力学研究、分子结合的测定等领域[３0]。同样，能量共振转移原理也被用于荧光分子探针的设计。

20０4年，O ｎo 小组[31]设计了以荧光素为能量供体,以没有发射

的荧光猝灭剂４－(4－二甲氨苯偶氮)苯甲酰基为受体,二者通过富含胸腺嘧啶的碱基连接在一起。当加入汞离子之前，供体受体之间的距离较长,二者不会发生能量共振转移,只发射荧光素的荧光；当加入识别客体Hg2+后，含有多个T的碱基发生特异性分子识别,拉近了荧光素和4-(4-二甲氨苯偶氮)苯甲酰基间的距离，发生荧光素向4-(４-二甲氨苯偶氮)苯甲酰基的能量转移,从而猝灭荧光素的荧光。

荧光探针设计原理

Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２共价连接型荧光探针结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ）受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光

细胞示踪荧光探针的基础知识概述

细胞荧光探针北欧广泛应用于测定细胞总量、干细胞体外实验、追踪活细胞行踪，细胞荧光探针有许多种，由于篇幅原因这就主要介绍以下三种：细胞增殖示踪荧光探针CFDA SE、活细胞荧光示踪探针VFSE 450、DiI(细胞膜红色荧光探针)。细胞增殖示踪荧光探针CFDA SE CFDA SE的全称为Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester，是一种近年来被广泛应用的细胞增殖检测用荧光探针，也可以用于细胞的荧光示踪。基于CFDA SE荧光标记的细胞增殖检测和[3H]-thymidine掺入、BrdU标记获得的检测结果完全一致，但同时可以提供更多的细胞增殖信息。使用CFDA SE检测可以提供整个细胞群中有多少比例的细胞分裂了1次、2次或更多次数，同时如果和其它荧光探针联用，可以获取不同分裂次数细胞的其它相关信息。 CFDA-SE的分子式为C29H19NO11，分子量为557.47，CAS number为150347-59-4。CFDA SE 可以通透细胞膜，进入细胞后可以被细胞内的酯酶(esterase)催化分解成CFSE，CFSE可以偶发性地(spontaneously)并不可逆地和细胞内蛋白的Lysine残基或其它氨基发生结合反应，并标记这些蛋白。在加入荧光探针CFDA SE后大约24小时，即可充分标记细胞。被CFDA SE标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数个月。CFDA SE标记细胞的荧光非常均一，比以前使用的其它细胞示踪荧光探针例如PKH26的荧光更加均一，并且分裂后的子代细胞的荧光分配也更均匀。由于CFDA SE标记细胞的荧光非常均匀和稳定，每分裂一次子代细胞的荧光会减弱一半，这样通过流式细胞仪检测就可以检测出没有分裂的细胞，分裂一次的细胞(1/2的荧光强度)，分离两次的细胞(1/4的荧光强度)，分裂三次的细胞(1/8的荧光强度)以及类似的其它分裂次数的细胞。采用CFDA SE通过流式细胞仪检测获得的检测结果参考右图。每一个峰代表一种分裂次数的细胞，从右至左的峰通常依次为分裂0次、1次、2次、3次等次数的细胞。分裂次数较多后，分裂0次或1次等没有分裂或分裂次数较少的细胞会逐渐减少直至检测不到。使用CFDA SE可以检测分裂多达8次或更多次数的细胞增殖。目前CFDA SE标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞增殖检测。最常用于淋巴细胞的增殖检测，也可以用于成纤维细胞、NK细胞等其它细胞的增殖检测，甚至还可以用于细菌增殖的检测。 CFDA SE标记细胞呈绿色荧光，检测时的激发波长可以选择488nm，此时的发射波长为518nm，使用流式细胞仪检测时可以采用FL1 detection channel。CFDA SE标记的细胞也可以用荧光显微镜进行观察。 CFDA SE标记的细胞无论在体外还是体内都不会使邻近细胞染色。即CFDA SE荧光探针完成标记后不会从一个细胞转移到邻近细胞。 CFDA SE标记细胞仅需5-15分钟即可完成。对于不同细胞，最佳标记时间需自行摸索。 CFDA SE可以使用无水DMSO(anhydrous DMSO)配制，配制浓度通常为2-10mM。配制好的溶液宜当天使用完毕，不宜长时间保存。CFDA SE标记细胞时的最终浓度通常为0.2-10μM或更高一些。在工作浓度为5μM时，一个包装的本产品共可以标记约1.8升的细胞。

荧光比率探针及其应用研究进展

７前　言荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用，　此外还包括应用于体内荧光探针。分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据，　通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。荧光比率探针及其应用研究进展杨柳＊　，郭成海，张国胜（防化研究院第四研究所，北京　１０２２０５）摘要本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词荧光分析，比率测量＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。１应用比率测量的阳离子探针：各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用，　如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。１．１Ｃａ２＋检测的比率测量探针：探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－　Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、　ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２

基于EET机理比率型荧光探针的研究进展

有机化学 Chinese Journal of Organic Chemistry ARTICLE * E-mail: yuhaibo@https://www.wendangku.net/doc/0d10477921.html, Received September 23, 2014; revised November 18, 2014; published online December 2, 2014. Project supported by the National Natural Science Foundation of China (21302080). Program Funded by Liaoning Province Education Administration (L2014010). 国家自然科学基金(No.21302080)，辽宁省教育厅科研项目(No.L2014010)资助项目. DOI: 10.6023/cjo201409036 研究论文基于EET 机理比率型荧光探针的研究进展陈忠林a 李红玲a 韦驾a 肖义b 于海波a ,* (a 辽宁大学环境学院沈阳 110036) （b 大连理工大学精细化工国家重点实验室大连 116024) 摘要激发态能量转移（Excitation Energy Transfer, EET ）作为一类重要的光物理现象，被广泛用于比率型荧光探针和分子灯标的设计以及DNA 检测等多个领域。影响EET 效率的两个重要因素是供受体间的空间距离和光谱交盖，通过调节供受体间的空间距离或光谱重叠程度来调控能量转移过程，实现对目标客体的双波长比率检测。本文综述了基于不同供受体荧光团的EET 体系、供受体间的连接方式对能量转移效率的影响，以及通过调控供受体间光谱重叠程度或空间距离，获得识别不同客体的比率型荧光探针，并对EET 机理的比率型荧光探针的设计以及未来在生物成像和医学检测等领域的应用进行了展望。关键词荧光探针; 激发态能量转移; F?rster 能量转移; 比率型荧光探针; 荧光发色团 Recent Progress in Ratiometric Fluorescent Probes Based on EET Mechanism Chen Zhonglin a Li Hongling a Wei Jia a Xiao Yi b Yu Haibo a * (a College of Environmental Sciences, Liaoning University, Shenyang) (b State Key Laboratory of Fine Chemicals, Dalian University of Technology, Dalian) Abstract Excitation Energy Transfer (EET) is one of the vital photophysical phenomenons, which is wide-ly used in many applications, such as the design of ratiometric fluroesent probes, molecular beacon and DNA analysis, and so on. The process of energy transfer from donor to acceptor can be regulated by two factors: the spatial distance between donor and acceptor, and the spectral overlaps between donor’s emission and acceptor’s absorption, which results that there is a wide variety in the ratio at two different wavelengths of ratiometric fluo-rescent probes. In this review, noticeable EET systems with different donor fluorophore, connection form and energy transfer efficiency between donor and acceptor, and the modulation of spatial distance or spectral overlap are summarized. Finally, as a promising tool, the future developing prospects of EET fluorescent probes in bioi-maging and medical diagnostics are discussed and highlighted. Keywords Fluorescent probe, Excitation energy transfer, F?rster resonance energy transfer, Ratiometric probe, Fluorophore 随着荧光显微成像技术和时间分辨技术的迅速发展，基于超分子化学和有机染料的荧光探针现已成为研究生物学和医学领域相关问题的重要工具。荧光探针在与目标客体相互作用过程中荧光信号会发生改变，借助于荧光信号的变化，荧光探针能够对目标客体进行实时在线的检测或监测，并被广泛用于分析化学，生物化学，医学和环境监测等多个领域[1]。荧光探针主要有三种类型：淬灭型、增强型和比率型。由于增强型荧光探针在与目标客体作用后，荧光输出信号增强，在荧光显微成像中比淬灭型荧光探针更为灵敏，故增强型荧光探针是目前荧光探针领域设计的主流[2]。与增强型荧光探针相比，比率型荧光探针在定量检测方面具有明显的优势，近些年来，比率型荧光探针的设计

QPCR原理及指导应用

QPCR原理及应用由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR 所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-time qPCR发展史 Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman 技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISMStepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5、MyiQ、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler系列；Eppendorf Masercycler；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler和BIOER 的LineGene系列。

分子荧光的机理和荧光探针原理

1.3荧光分子探针识别机理 1.3.1光诱导电子转移[4,12](Photoinduced Electron Transfer,PET) 典型的PET体系是由包含电子给体的识别基团部分R(reseptor)，通过一间隔基S(space)和荧光团F(fluorophore)相连而构建。其中荧光团部分是光能吸收和荧光发射的场所，识别基团部分则用于结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。PET荧光探针中，荧光团与识别基团之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱，一旦识别基团与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射出强烈荧光（图1-1）。PET荧光探针作用机制可由前线轨道理论来说明（图1-2）。由于与客体结合前后，荧光强度差别非常大，呈明显的“关”、“开”状态，因此这类探针又被称做荧光分子开关。图1-1 PET荧光探针的一般原理图LUMO 图1-2 PET荧光探针的前线轨道原理图已报道的PET荧光分子探针中，多数都是以脂肪氨基或氮杂冠醚作为识别基团。de Silva 研究小组利用多种荧光团设计了大量该类PET探针用于氢质子、碱金属阳离子识别。化合物1是一个简单的PET荧光分子探针，在甲醇中和K+络合后，荧光量子产率从0.003增加至0.14。钱旭红等设计的PET荧光探针（化合物2），对氢质子有很好的识别作用，已被Molecular Probe公司推广为细胞内酸性内酯质探针。de Silva研究小组利用类似于EDTA

PCR和定量PCR的引物和探针设计

引物和探针设计 – PCR 和定量PCR 基本原理引物设计的重要因素针对特殊应用的其他提示引物的质量和纯度目录 1247

基本原理引物是短的寡核苷酸，充当DNA复制的起始点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3'-羟基作为DNA合成的起始点。这个3'-羟基由相配的引物提供。引物在体内由RNA聚合酶（称为引物酶）生成。这些引物（在此为小RNA）由DNA聚合酶用作延长的起始点。在延长过程中，RNA引物降解并由DNA取代。体外扩增反应，如聚合酶链反应（PCR）或逆转录（RT），需要引物。通过选择特异的引物序列，DNA 片段的所需区域可得到扩增。对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。在开始引物设计之前，必须弄清以下几点： PCR的目的（例如定量检测、克隆、基因分型） PCR类型（定量PCR、RT-PCR、长片段PCR) 样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）可能的问题（例如假基因、SNP) 1

引物设计的重要因素 2 有一些不同的软件工具可用于引物设计和序列分析。它们能简化相配引物对的搜索，一般考虑以下标准。最流行的软件为Primer 3(https://www.wendangku.net/doc/0d10477921.html,)，它是大多数基于网络引物设计应用的基础。典型的引物长度为18-30个碱基。短的引物（15个核苷酸以下）能非常高效地结合---但是它们的专一性不够。非常长的引物能提高专一性，但是退火效率低，从而导致PCR 产物量低下。应避免编码单一序列和重复序列的引物。引物长度和专一性引物的GC 含量应介于40%和60%之间。应避免聚-（dC ）-或聚（dG ）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA ）-和聚（dT ）-也应避免，因为这会生成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域退火温度是基于引物的解链温度（Tm ）计算。最常用的解链温度计算公式显示如下。“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于极短的寡核苷酸（最多14个碱基）有效，该法则提出每个AT 对能将双链DNA 的解链温度提高2°C ，每个GC 对则能提高4°C 。 GC 法则（适用于长于13个碱基的序列）也是一种简单但同时相当不准确的方法。两种法则都假设退火发生于以下标准条件下： 50 nM 引物、50 mM Na + 和pH 7.0。 “盐调整”法稍微准确一些，考虑到了反应缓冲液中的Na+离子浓度。最复杂的方法称为“碱基堆积”法。这里的计算中包括了杂交期间的焓（H ）和熵（S ）。计算出的解链温度可用于估算最佳退火温度。但是，经常需要经验性地估算最佳温度。所选引物的解链温度应允许退火温度介于55°C 和65°C 之间。一个引物对的两条引物都应具有相同或极相近的解链温度。退火温度 Tm = 2 °C ? (A + T) + 4 °C ? (G + C) Tm = 64.9 °C + 41 °C ? (G + C -16.4)(A + T + G + C) Tm = 100.5 °C + 41 °C ? ? 16.6 ? log 10([Na + ]) C + G A + C + G + T 820A + C + G + T 提示

【CN109761931A】一种检测细胞内pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910141848.9 (22)申请日 2019.02.26 (71)申请人济南大学地址 250022 山东省济南市市中区南辛庄西路336号 (72)发明人林伟英　宋文辉　董宝利　张楠　卢雅茹　 (74)专利代理机构济南泉城专利商标事务所 37218 代理人李桂存 (51)Int.Cl. C07D 277/66(2006.01) C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称一种检测细胞内pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用 (57)摘要本发明提供了一种检测细胞内pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用。该荧光探针的化学结构式为：。可通过4-氰基苯硼酸与5-溴水杨醛的反应产物在进一步与邻氨基苯硫酚反应获得。本发明的荧光探针具有高特异性，在进行相应pH检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活细胞内pH的实时测定。该探针的灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（415-700 nm），通过绘制标准曲线进行细胞内pH的测定，可以实现对细胞内pH快速准确检测的目的。本发明提供的荧光探针合成方法，工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。本探针在生物监测领域具有广阔的应用前景。权利要求书1页说明书4页附图3页CN 109761931 A 2019.05.17 C N 109761931 A

1.一种检测pH的比率型荧光探针，其化学结构式如式（I ）所示：式（I ）。 2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将4-氰基苯硼酸，5-溴水杨醛，Pd(dppf)Cl 2，醋酸钾溶于1,4-二氧六环，在氮气保护下加热搅拌至反应充分，将反应液冷却至室温，过滤除去固体杂质，滤液分离纯化得到浅黄色化合物1：；（2）化合物1和邻氨基苯硫酚在对甲基苯磺酸存在下于二甲基甲酰胺中加热搅拌反应；反应完成后，将反应液在0℃左右迅速冷却，后向反应液中加入水，得到黄色固体沉淀，分离沉淀并纯化得到化合物2，即荧光探针：。 3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，4-氰基苯硼酸与5-溴水杨醛的摩尔比为0.8-1:1-1.5；步骤（2）中，化合物1与邻氨基苯硫酚的摩尔比为1:1-1.5。 4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，分离纯化过程为：以石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1的淋洗液，将滤液通过柱层析（石油醚：乙酸乙酯=5:1）；步骤（2）中，纯化过程为：以石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1的淋洗液，将沉淀通过柱层析得到探针。 5.一种如权利要求1所述的荧光探针在检测溶液、细胞或生物体中pH的应用。权　利　要　求　书1/1页2CN 109761931 A

荧光

.1.1荧光探针的概述荧光探针(fluoresCentprobe)就是由一个连接体将荧光团和待测分子的接收基团连接在一起，随着待测分子的引入荧光会发生变化，通过荧光光谱的变化达到对待测分子识别的效果!’一3]。荧光探针将微观的化学变化转化成了宏观的光谱变化，是联系微观世界和宏观世界的桥梁。荧光探针通常由以下三个部分组成(图 1.1):(1)接收基团(ReeePtor)，用来结合待测分子;(2)荧光团(Chrom叩her)，用来产生光信号，加入待测分子前后荧光信号会发生变化;(3)连接体(SpaCer)，用来连接荧光团和接收基团，在整个荧光探针中起着枢纽作用。通过改变连接体与接收基团和荧光团的作用方式，可以设计出各种机理不同的荧光探针附]。目前荧光探针在分子识别中应用非常广泛，这是因为相对于其他检测手段荧光探针具有以下几个优点:(1)可以在不同的体系中识别，溶液中和界面上对分子识别的荧光信号都比较明显，通过光谱变化可以达到对分子识别的目的;(2)荧光探针的检测灵敏度高，可以在众多的分子离子中实现对某一种或某一个离子或分子的识别;‘3) 荧光探针对分子识别的检出限低，对一些阴离子，阳离子，中性小分子的最低检出限可以达到PPm级，可以应用于检测各种有危害性的离子或分子在环境中的存在浓度，对人类的健康有着重要的意义。荧光探针大部分都是含有共扼体系的有机小分子化合物，这是因为形成共辘双键的电子跃迁更容易吸收激发光，易于荧光的产生;同时其激发光的

波长大多处于近紫外区或者可见光区，发射光的波长大多处于可见光区，易于观测荧光光谱的变化16，7]。一般情况下，具有刚性结构的化合物通常发光能力较强，激发态的分子在势能曲线坐标上较小的范围内发生衰变，以辐射衰变为主(图12)。在荧光发射前是有一部分能量被消耗的，因此发射光的能量要比吸收光的能量小，就是发射的荧光的特征波长要比紫外吸收光的特征波长长，可以认为是荧光发射的最大波长与紫外吸收的最大波长相比要发生红移，红移的大小用来衡量发射光与激发光能量差值的大小，这个差值称作斯托克斯位移(Stokesshift)[8.9]。化合物的发光能力可以用荧光的量子产率来衡量，它是荧光发射的光子数与吸收的光子数的比值。由于在吸收光时，分子可以由基态跃迁到几个不同的激发态，而发射荧光时只有第一电子激发态的最低能级回到基态，所以荧光光谱通常只是呈现一个荧光光谱带，而不像吸收光谱那样有几个吸收带。 1阴离子探针的概述阴离子在扛境生命体系中广泛存在，在生化过程中扮演着重要的角色。一方面，生物大分子间的相互作用都涉及到大量阴离子，并在生物质合成和能量转化过程中起着十分重要的作用[20];另一方面，人类的活动会给环境带来阴离子，其含量虽然常在PPm量级，但也会给环境带来污染影响人类的健康。因此建立灵敏、快速、高选择性的分析方法对于检测生命和环境体系中的阴离子具有重要的意义和潜在的应用前景。在众多检测方法中，荧光光一潜法由于其灵敏度高、操作简便及成本低等优点，被广泛应用于环境生命体系中离子的识别和

有机荧光探针最新研究进展

有机荧光探针最新研究进展徐绍彬（化学化工学院，1081109001）摘要荧光探针是是一种极好的生物分子传感器,具备灵敏度高反应时间迅速等特点。近年来,随着生命科学的不断发展,荧光探针已经在蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面发挥了重要作用。随着荧光探针的合成及应用技术的不断改进,人们对有机荧光化合物的认识和研究也不断深入,有机荧光探针的发展前景将越来越广阔。本文对最近几年国内外有机荧光探针的研究情况做一综述。关键词BODIPY 荧光探针染料探针是一种能和某特异靶分子相互作用,实现对靶分子进行检测的分子,并要求相互作用后对被探测对象不产生或仅产生可忽略的干扰。荧光探针就是以荧光物质作为指示剂,并在一定波长光的激发下使指示剂产生荧光,通过检测所产生的荧光实现对被检测物质的定性或者定量分析。荧光分析方法灵敏度高,选择性好,试样量小,在分析化学,特别是在分子生物学、生物化学、医学等领域中有较广泛的应用。由于大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱,检测灵敏度较差,人们用强荧光的标记试剂或荧光生成试剂对待测物进行标记或衍生,生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质,使检出限大大降低,这就是荧光探针技术。荧光探针可有多种分类方法:按荧光波长可分为发射在紫外可见区的荧光探针和近红外区的荧光探针。按荧光探针用途不同可分为荧光标记试剂(fluorescent) 和荧光生成试剂(nuorlgenic)。按荧光探针物质本身的性质又可分为有机(包括稀土金属有机配合物) 荧光探针、量子点荧光探针、高分子荧光探针等。近年来随着生命科学的日益发展，大量的各式各样荧光探针被合成出来，人们对荧光探针技术的认识和研究也不断的深入。目前常用于合成荧光探针的染料有BODIPY、菁染料、噻嗪与噁嗪类染料、呫吨类染料等。本文将讨论最近三、四年的有机荧光探针的发展情况，并重点对基于BODIPY的有机荧光探针的合成及应用进行概述。 1 BODIPY类二氟化硼－2－二吡咯甲烷(BODIPY) 是一类重要的有机荧光染料，由于其分子结构易于改性，近十年来研究人员合成了一系列的BODIPY衍生物，并在荧光探针技术上得到应用。这类荧光染料具有荧光量子产率高、摩尔吸光系数大、稳定性好、对pH、溶液极性不敏感等优点，因而在金属离子检测、PH值测定、DNA的标记及测序等方面得到重要应用。 1.1基于BODIPY的金属离子荧光分子探针研究进展设计一种检测生理过程重要金属离子的荧光探针是非常活跃的领域，对金属离子探针的研究早在20世纪七八十年代就已开始，己经报道的探针分子成百上千。BODIPY类金属离子荧光探针的研究也陆续见诸报道，不少研究人员利用BODIPY荧光染料合成形形色色的金属离子荧光分子探针，使它代替了许多早期的荧光染料而应用在生物和化学分析方面。 2008年，Serdar Atilgan 等人通过逐步法合成了一种高灵敏的锌离子荧光探针。这种新颖的双苯乙烯基取代的BODIPY衍生物结合锌离子以后，发射峰从730nm蓝移至680nm，因而可做为发射峰在近红外区域的水溶性荧光探针。

2荧光探针设计原理(优选.)

最新文件---------------- 仅供参考--------------------已改成-----------word文本 --------------------- 方便更改赠人玫瑰，手留余香。荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图1．1)：1．识别结合基团(R)，能选择性地与被分析物结合，并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。2．信号报告基团(发色团, F)，把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(荧光等)。3．连接基团(S)，将信号报告基团和识别结合基团连接起来，根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。图1.1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理

(1) 结合型荧光探针[21] + Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1.2 共价连接型荧光探针结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针，是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中，必须充分考虑下列三个方面的因素。(a) 受体分子的荧光基团设计、合成：考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性），Stokes 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象），荧光发射最好要在长波长区（最好位于500 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰，另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力（如氢键、范德华力等）作为理论指导，多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(c) 荧光超分子受体的组装：组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识

EAST装置的磁探针设计

第28卷第1期核聚变与等离子体物理 V ol.28, No.1 2 0 0 8年 3 月 Nuclear Fusion and Plasma Physics March 2008 文章编号：0254?6086(2008)01?0073?04 收稿日期：2007?03?07；修订日期：2007?09?06 基金项目：国家自然科学基金资助项目(10405024) 作者简介：奚维斌(1970?)，男，安徽肥东人，博士研究生，研究方向：EAST 电磁测量系统研究和设计。 EAST 装置的磁探针设计奚维斌，武松涛，沈飚，万宝年，宋云涛 (中国科学院等离子体物理研究所，合肥 230031) 摘要：介绍了EAST 装置中磁探针设计中的结构、安装位置、匝面积的标定、幅频响应，并给出了该磁探针的标定误差和Mirnov 线圈幅频响应特征图。两轮EAST 放电试验表明，电磁测量的信号满足装置运行和等离子体控制的需要。关键词：EAST 装置；磁探针；幅频响应；工程设计中图分类号：TL65+5 文献标识码：A 1 引言 EAST 是全超导托卡马克核聚变实验装置，它的物理目标[1]是研究并实现稳态的高参数等离子体。为了实现确定的物理目标，电磁测量中磁探针的设计是重要的。在托卡马克中安装在等离子体边界处的磁探针是一种最简单、最重要的提供运行等离子体信息的工具。这些磁探针也提供用于对等离子体的位置、位形和磁流体动力学(MHD)不稳定控制所需要的各种信号。本文首先介绍磁探针设计的原理；其次详细地叙说EAST 装置中磁探针的结构、安装位置、匝面积标定及幅频响应；最后给出该磁探针的标定误差及幅频响应特征图。 2 磁探针的测量原理磁探针是安装在等离子体中或边界处的小螺线管线圈，其工作原理是根据电磁感应定律，当线圈所在空间中的磁场发生了变化时，由于穿过线圈横截面的磁通Φ发生变化，在线圈两端将产生一个感应电动势ε： t B S t Φd d d d eff ?=?=ε (1) 式中，B 为磁探针所在空间磁感应强度在线圈轴向的分量；S NS S Δ+=eff ，N 为线圈匝数，S 为线圈横截面，?S 是引出线和接头所形成的附加的杂散面积。在EAST 装置中设计了两种骨架尺寸相同的磁探针。一种是测量等离子体位置和形状的磁探针叫小探针。小探针测量的信号经过积分器积分，即ε积分就得到小探针几何中心处的磁场B ，磁场方向是线圈的轴线方向。在托卡马克中一般在垂直于等离子体小环方向的截面上安装一组小探针，来反演等离子体的位置和形状。另一种是测量MHD 的不稳定性的磁探针，叫Mirnov 线圈。Mirnov 线圈测量的信号不经过Mirnov 积分器积分。在托卡马克中Mirnov 线圈安装位置和数量都与小探针相同。满足EAST 装置电磁测量要求的磁探针必须满足如下条件： a. 所有磁探针安装的空间位置精确； b. 所有磁探针有标定精确的匝面积； c. Mirnov 线圈有100kHz 频率响应, 以使探针输出的信号能真实反映磁场的变化。 3 磁探针的设计 3.1 EAST 装置磁探针结构和安装位置在EAST 装置中，磁探针是安装在真空为1×10?6Pa 、内部部件的烘烤温度为350℃，承受的磁场为3.5T ，等离子体电流为1MA 的真空室内部。磁探针线圈是采用玻璃丝布套管绝缘的裸铜线。玻

甲基化引物探针设计方法

本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。专业的活就是要专业的用专业的工具干。

首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用https://www.wendangku.net/doc/0d10477921.html,/methprimer/，较为简单直观。

直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此网站也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。submit后就有转化后的序列信息，如下图：以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C，可直接复制到Word内标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。

关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议： Primer设计的基本原则： a)引物长度一般在18-35mer。 b)G-C含量控制在40-60%左右。 c)避免近3’端有酶切位点或发夹结构。 d)如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 e)如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。 f)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 g)退火温度Tm控制在58-60C左右。 h)如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。 TaqMan 探针设计的基本原则： a)TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。 b)长度一般为18-40mer 。 c)G-C含量控制在40-80%左右。 d)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 e)在引物的5’端避免使用G。 f)选用比较多的碱基C。 g)退火温度Tm控制在68-70℃左右。另：目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。

探针设计-Northern

核酸分子杂交基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。待测核酸序列为性病病原体基因组或质粒DNA。探针以放射核素或非放射性核素标记，以利于杂交信号的检测。所谓杂交（hydridization）指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体（hybrid），杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，我们把标记的分子叫探针（Probe）。将探针技术与分子杂交技术相结合，从而使分子杂交技术得以广泛推广应用。目前所用的核酸杂交技术均应用了标记技术。（一）DNA的变性 DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，称为DNA变性。加热、改变DNA溶液中的pH，或有机溶剂等理化因素的影响，均可使DNA变性。变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。（二）DNA复性变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价健的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA 或RNA与DNA的二条单链之间，由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。使单链聚合成双链过程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。（三）探针——靶分子反应从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分子反应。抗体——抗体、外源凝集素——碳水化合物、亲合素——生物素、受体——配基（Ligand）以及互补核酸间的杂交均属于探针——靶分子反应，蛋白质探针（如抗体）与特异靶分子是通过混合力（疏水离子和氢键）的作用在少数特异位点上的结合，而核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不同，通过氢键几十、几百甚至上千个位点上的结合。这就决定它的特异性。基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类。DNA探针还有单链和双链之分。下面分别介绍这几种探针。一、核酸探针的种类（一）DNA探针DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获的DNA探针种类很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类ALU探针，这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比用G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向，加之分子杂交技术的高度敏感性，分子杂交在临床性病病原体诊断上具有广泛的前景。DNA探针（包括cDNA 探针）有三大优点：第一，这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备