第六章胚胎培养

第六章胚胎培养

一、胚胎培养的意义

1.概念

胚胎培养指胚及其胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下，使胚发育成幼苗的技术2.分类

广义: 离体胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养、试管受精、胚轴、胚芽等

狭义：离体胚培养（成熟胚培养、幼胚培养）

3.意义

可克服一些早熟品种胚早期败育现象，从而缩短育种周期，增加种子发芽度

可克服远缘杂种的不育性

利用胚乳培养可获得无籽的三倍体果实

可用于研究与胚发育有关的内外因素以及有关的代谢和生理生化变化

4.发展简史

1904年，Hanning培养萝卜、辣根的胚，提前萌发成苗，成为世界上胚胎培养最早成功的一例

30年代，Tudey培养多种果树胚胎获得成功

1942年，Dietrich对十字花科、豆科、菊科、葫芦科和禾本科的多种植物离体胚培养进行研究

二、离体胚培养

（一）成熟胚培养

指子叶期后至发育完全的胚的离体培养

易成功，在含有大量无机无素和蔗糖的培养基上培养即可萌发

培养目的

研究发育过程的形态建成、激素的作用、营养要求等生理问题

培养方法

消毒（种子70%酒精5-30`表面消毒---饱和漂液或0.1%升汞10-30 min----无菌水冲冼3-4次）——取胚（无菌解剖,直接取胚）——培养（置于培养基上培养----萌发成苗）

（二）幼胚培养

1.概念

指子叶期以前的具有胚结构的幼小胚培养

2.培养方法

包括消毒(子房)、取胚、接种。需在高倍解剖镜下取胚，操作要细心

3.胚发育方式

a.胚胎发育：即按胚胎的正常发育途径生长发育最后成苗，是最理想的发育方式

b.胚性发育：培养的幼胚可增大，但不能萌发成苗，只呈现胚性生长

克服方法

1.提高渗透压

2.改变激素的种类或浓度

3.加入天然复合物

4.改善培养条件(pH、温度、光）

c.早熟萌发：指离体培养的幼胚越过正常胚胎发育阶段,在未达到生理和形态成熟的情况下,萌发长成幼苗。形成畸形、弱苗或死亡.

克服途径:提高培养基渗透压(蔗糖、无机盐、甘露醇) 胚龄越小要求的渗透压（糖浓度）越高。

产生愈伤组织或胚状体

生长调节剂浓度高时易形成愈伤组织

4.影响胚培养成功的因素

○1胚的发育程度：胚越小, 离体培养难度越大

○2培养基

a.基本培养基：MS、B5、white

b.碳源：蔗糖最佳，2-4%。重要作用是调节渗透压

不同发育时期的胚要求不同浓度的蔗糖浓度，胚年龄越小，蔗糖浓度越高

结论：

渗透压与幼胚生长关系密切，胚越小，Vp要求越高

在胚培养中，要定期将胚转移到逐渐降低Vp的培养基中

推论：

高渗透压调节胚的生长，减少由于低渗而造成对从高渗环境中分离出的胚的影响

高渗可抑制早熟萌发，并把细胞的伸长状态转到分裂状态

c.生长调节物质：IAA、KT、GA等合理浓度配比

不同植物的胚培养要求的生长物质不同（种类、浓度等）

在培养一种新的植物幼胚之前，对生长物质合理的种类、浓度进行筛选

d.胚乳营养物质

研究表明，培养基中添加胚乳抽提物可促进幼胚生长

小胚接种于破碎的胚乳上培养成功率提高

e.天然复合物：椰子汁、椰乳、酵母提取物、水解酪蛋白、水解乳蛋白

○3胚胎培养的环境条件

a. 温度

通常25-30℃。有些种类、品种需低温打破休眠

b. 光照

黑暗或弱光下培养幼胚比较适宜

促进胚芽生长，抑制胚根生长

根据植物种类决定光照条件

c. pH 值

通常5.6-5.8之间。有同植物种类,最适pH不同

三、胚珠培养

（一）胚珠培养的目的

克服幼胚培养难度大,不易成功

有些种类成熟胚很小,取胚珠培养较易成功

利用未受精的胚珠培养可诱发大孢子发育成单倍体

（二）胚珠培养的发展

1932年,white,胚珠培养,使胚珠只进行了很有限的生长

1942-1943年,withner,兰花胚珠培养,获得成熟种子

1958年,Maheshwari,培养授粉5天的罂粟胚珠成功,在试管内萌发成苗

胚珠培养还处于试验摸索阶段,育种方面的应用也刚开始,园艺植物如洋葱、四季桔、矮牵牛、凤仙花等胚珠培养获得成功

（三）培养方法

授粉或未授粉子房——表面消毒——无菌解剖——取出胚珠——培养

培养基：

基本培养基：Nitsch、white常用；MS、B5、N6

添加物：生长调节特质+其它（糖、V、椰乳等）

（四）胚珠离体培养的原理

胚是一个完整的细胞体系,位于胚珠之中,它与包围着它的胚珠其他部分构成一个整体.当进行离体培养时,胚珠与培养接触,胚也会受到来自培养基中的各种因素的刺激,发生反应

离体培养的胚,发育受到外源物质和胚珠中本身存在的内在因素的共同作用

提供胚生长的适合内在和外在的因素,是取得胚珠培养成功的关键

（五）影响离体胚珠培养成功的因素

1.胚的发育时期

发育时期越早,越难培养成功。球形期以后的胚珠培养较易成功

2.胎座和子房的影响

带有部分胎座和子房组织的胚珠培养较易成功

影响机制不祥

3.培养基附加物质的影响

添加复合物对许多植物的胚珠培养有效

不同植物、不同发育时期添加物种类、数量不同

四、子房培养

（一）概念：子房培养指受粉或未受粉的子房的离体培养

受粉的子房----成熟胚

未受粉子房----单倍体植株

（二）培养方法

1.材料消毒

未受粉子房----花被包裹，只需对花蕾灭菌即可

受粉的子房----需表面灭菌

2.材料的选择

未受粉子房----选取卵细胞适宜的发育时期.通常接近成熟时的子房培养较易成功

3.培养基

基本培养基：MS、White、Nitsch、Heller等；N6、B5用于禾本科植物

适当添加生长素类物质有效

碳源多用蔗糖，浓度3-10%

4.环境条件

T：22-27℃，冬作物可低些

光照：500-1500lux

5.附属花器

附属花器对胚发育生长有利

机制不祥

6.子房植株的倍性

子房存在两种细胞（性细胞和体细胞），子房植株出现混倍现象

获得单倍体要促进大孢子细胞分裂，抑制体细胞分裂

五、离体受精（试管受精）

（一）概念：试管受精指在无菌条件下培养离体的未受精子房或胚珠和花粉，花粉萌发产生

的花粉管进入胚珠，从而完成受精过程的技术

（二）意义

克服自交不亲和性

克服杂交时受精遇到的一些障碍

缺点：

花粉不能在柱头上萌发

花粉管太短

生长太慢

（三）方法

1.花粉收集

花蕾开放前数天,将花套袋,开花当天或前一天,取尚未裂开的花蕾,常规表面灭菌,无菌条件下收集花粉

2.剥取子房和胚珠

开花前一天,对花套袋,去雄,开花前一天或花后1-2天,将花蕾取下,常规表面消毒,无菌条件下剥取子房或胚珠

3.离体授粉受精

将花粉撒在培养基上,再将子房接种上去,待花粉萌发,伸入珠孔受精

将子房接种到培养基上,再将花粉直接撒在子房上,直接萌发受精

4.胚培养

将授粉受精后的子房移至Nitsch固体培养基上培养

胚形成后移至胚培养基上培养

（四）影响试管受精成功的因素

1、离体胚珠的成活率和受精力，关键是培养基。

2、花粉萌发和花粉管的生长速度，关键是培养基,注意钙和硼的作用。

3、花粉的灭菌，新鲜花蕾浸渍灭菌,然后剥出花粉使用。紫外线照射灭菌,15min。

六、胚乳培养

胚乳为胚的发育和种子萌发时幼苗生长提供营养物质

被子植物的胚乳为双受精的产物，所以通常为三倍体

裸子植物的胚乳由雌配子体发育而来，为单倍体

早在三十年代，人们就进行了胚乳培养，已证明胚乳细胞同样具有潜在的形成发生能力，只要条件适宜“全能性”即可表现出来

（一）胚乳培养的意义

1.基础理论方面

了解胚乳的全能性

了解胚与胚乳的相互关系

研究胚乳细胞合成蛋白、糖等物质的生理机制

2.育种方面

胚乳植株染色体倍性不稳定，多数为多倍体和非整倍体，从而为园艺植物多倍体遗传育种提供丰富的原始材料

胚乳培养可获得无籽结实的三倍体植株

胚乳培养的遗传基础2/3来自母本，从而提高对育种后代的预见性

（二）胚乳培养的方法

1.愈伤组织的诱导

取授粉4-8天的幼果——表面灭菌——无菌取出胚乳——接种——愈伤组织2-30mm——分

化培养基——胚乳植株

○1MS、White、LS，2.4-D 0.5-2.0 mg/ml，BA 0.1-1.0 mg/ml，蔗糖2-3%，黑暗或弱光

○2MS、White，NAA 0.5-2.0 mg/ml，BA 0.5-3.0 mg/ml，充足的光照，注意转移时愈伤的年龄

（三）胚乳植株的倍性

多数胚乳植株都是由具有多种数目的染色体细胞组成的嵌合体

可从中筛选取出各种类型非整倍体，在遗传育种中具有一定利用价值

目前为止，胚乳培养成功的例子十分有限，应深入开展这方面的研究，尽快开辟诱导形成三倍体植株的途径

（四）胚乳离体培养的研究进展

仅能形成愈伤组织：黄瓜、檀香、小麦、沙针、黑麦草、美洲槲寄生、澳洲根寄生

达到器官分化水平：玉米、蓖麻、巴豆、变叶木、葡萄荷叶芹、黑种草等

形成完整植株：大麦、水稻、苹果、柚、橙、马铃薯、桃、荷叶芹

第六章胚胎培养

第六章胚胎培养 一、胚胎培养的意义 1.概念 胚胎培养指胚及其胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下，使胚发育成幼苗的技术2.分类 广义: 离体胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养、试管受精、胚轴、胚芽等 狭义：离体胚培养（成熟胚培养、幼胚培养） 3.意义 可克服一些早熟品种胚早期败育现象，从而缩短育种周期，增加种子发芽度 可克服远缘杂种的不育性 利用胚乳培养可获得无籽的三倍体果实 可用于研究与胚发育有关的内外因素以及有关的代谢和生理生化变化 4.发展简史 1904年，Hanning培养萝卜、辣根的胚，提前萌发成苗，成为世界上胚胎培养最早成功的一例 30年代，Tudey培养多种果树胚胎获得成功 1942年，Dietrich对十字花科、豆科、菊科、葫芦科和禾本科的多种植物离体胚培养进行研究 二、离体胚培养 （一）成熟胚培养 指子叶期后至发育完全的胚的离体培养 易成功，在含有大量无机无素和蔗糖的培养基上培养即可萌发 培养目的 研究发育过程的形态建成、激素的作用、营养要求等生理问题 培养方法 消毒（种子70%酒精5-30`表面消毒---饱和漂液或0.1%升汞10-30 min----无菌水冲冼3-4次）——取胚（无菌解剖,直接取胚）——培养（置于培养基上培养----萌发成苗） （二）幼胚培养 1.概念 指子叶期以前的具有胚结构的幼小胚培养 2.培养方法 包括消毒(子房)、取胚、接种。需在高倍解剖镜下取胚，操作要细心 3.胚发育方式 a.胚胎发育：即按胚胎的正常发育途径生长发育最后成苗，是最理想的发育方式 b.胚性发育：培养的幼胚可增大，但不能萌发成苗，只呈现胚性生长 克服方法 1.提高渗透压 2.改变激素的种类或浓度 3.加入天然复合物 4.改善培养条件(pH、温度、光） c.早熟萌发：指离体培养的幼胚越过正常胚胎发育阶段,在未达到生理和形态成熟的情况下,萌发长成幼苗。形成畸形、弱苗或死亡. 克服途径:提高培养基渗透压(蔗糖、无机盐、甘露醇) 胚龄越小要求的渗透压（糖浓度）越高。

胚胎干细胞的体外诱导分化模型

胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源　李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1　胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2　胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1　神经细胞　体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 　1　Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 　2　Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 　3　Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 　4　裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)

胚胎干细胞体外诱导分化综述

胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞

【人教版】生物选修三：3.2《体外受精和早期胚胎培养》教学案(含答案)

选修三 专题3 3.2 体外受精和早期胚胎培养 一、学习目标 1.简述哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。 2.简述哺乳动物胚胎的早期培养方法。 3.认同体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义。 二、教学建议 1.课时数：本节教学建议用2课时。 2.课时侧重点： （1）体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义。 （2）哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。 3.教学策略 教学过程一定要根据学生的具体情况、教材的内容、教学的条件综合考虑进行。本节教材是在哺乳动物体内受精和胚胎发育的理论基础上，着重简述哺乳动物体外受精和胚胎早期培养的技术方法。本节内容简单，学生通过阅读基本能明白。另外，由于所讲内容技术性较强，与学生的生活相距较远，不易引起学习兴趣，所以教师可采用探究式的学习方法，以“试管牛”为例，创设出一种新的学习情景，在教师的带领下，让学生以胚胎工程学家的身份出现，亲历其境地去思考和探究“体外受精和早期胚胎培养”的过程，领悟其探究的方法，以达到激发兴趣、培养能力、获取知识的目的。对具体的教学方法建议如下。 教师课前搜集有关“试管牛”技术及其发展的资料，并制作“利用屠宰厂牛卵巢收集卵母细胞，并工厂化生产试管胚胎”的计算机辅助教学软件（或投影片）。同时，教师布置学生搜集有关“试管牛”的资料。 在课堂活动中，教师首先提出问题：“你听说过试管牛、试管羊吗？你知道什么是试管动物技术吗？”从而引出试管动物技术的概念及体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义，提出本节主题。 接着，请学生回忆第一节课的内容，并思考讨论以下各题： （1）哺乳动物体内胚胎的形成需要经过哪些过程？（精子和卵子的发生—受精—胚胎的发育） （2）哺乳动物体外胚胎的发育需要完成哪些环节？（获得精子和卵子—体外受精—体外胚胎培养）。在学生讨论出结果的基础上，教师告诉学生，胚胎工程专家就是根据这几个环节来研究哺乳动物体外受精和胚胎早期培养方法的。今天请大家来扮演胚胎工程专家，共同模拟研究“试管牛”工厂化生产的技术流程。 首先，请学生阅读教材；然后教师与学生一起制定研究“试管牛”工厂化生产的技术流程，并拟出以下关于技术流程的研究题目： （1）卵母细胞的采集和培养； （2）精子的采集和获能； （3）受精； （4）胚胎的早期培养； （5）画出“试管牛”工厂化生产的技术流程图解（图3-2） 教师让学生自由组合成课题小组，选定研究题目（全部课题都要被不同组选定）。教师指导学生研究的方法：查阅有关资料（可根据教材或利用自己搜集的有关“试管牛”的资料）→研讨、制定技术方法→写出研究报告。 各课题小组按选定的研究课题进行研讨，并写出研究报告。各课题小组的代表公布研究报告，教师与学生共同进行评价。

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

胚胎工程 电子教案

专题3 胚胎工程教材 学情分析； 在普通高中《生物课程标准》的内容标准中，“胚胎工程”是选修3“现代生物技术专题”模块的第3个专题。该专题涉及胚胎工程的理论基础，胚胎工程的基本技术及原理。胚胎工程的应用与前景，以及胚胎干细胞的研究和应用对生命基础科学研究的重大作用等内容。 本专题的主线是从胚胎工程的理论基础到技术基础，再到应用及发展，因此哺乳动物精子和卵子的发生、受精过程及胚胎发育、哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤、胚胎移植的生理学基础及基本程序和应用、胚胎分割的实践意义、胚胎干细胞研究的意义是教学的重点；哺乳动物受精过程中精子的获能与顶体反应及两道屏障的概念及特点、哺乳动物胚胎发育各阶段的主要特点、胚胎移植的生理学基础与基本程序、胚胎干细胞的培养方法与分离途径是教学的难点。尽管在必修部分学习了细胞器的结构与功能、减数分裂等内容，但是要对精卵发生中精子的变形、卵泡的形成及排卵、卵子成熟的两次减数分裂场所及时间等有关内容进行全面深入的介绍及拓展，还是有一定难度的，特别是有些内容与必修部分不一致，如卵细胞形成中的减数第二次分裂是在受精过程中完成的，并且有些哺乳动物减数分裂中极体的数量是两个而不是三个，因为有些哺乳动物的第一极体不进行减数第二次分裂形成两个第二极体，这些内容既是重点也是难点。 学情分析； 学生在必修二的学习中已经学到了相关减数分裂合生殖细胞的形成以及受精作用等内容，所以学生对于这个专题的学习有一定的基础。能从胚胎工程的整个格局来分析问题，也就是学习这一节的目的是为后面学习其它技术打基础，体外受精做好准备的，如自然受精——体外受精，受精卵发育及进入子宫——胚胎移植。就是有一个总体观，不象以往就是为了上课而上课，将其分开来。另外也能带着学生一同来分享整个过程。 第一节体内受精和早期胚胎发育 第一课时 教学目标 1．知识与技能： （1）简述哺乳动物的精子和卵子的发生过程 2．过程与方法： （1）学生通过阅读、自学、质疑、讨论、训练和总结等环节，逐步提高独立获取知识的能力、逻辑思维能力、分析问题和解决问题的能力。 （2）通过学习精卵形成和受精过程，使学生联系已有知识，培养学生的知识迁移能力，思维能力。 3．情感态度与价值观： （1）初步培养学生勇于探索、不断创新的精神和合作精神。 （2）通过向学生介绍动物精卵细胞的形成，使学生明确对生命奥秘的揭示愈加广泛 和深入，形成终身学习的意识。 教学重点、难点： 1.教学重点 （1）哺乳动物精子和卵子的发生。

胚胎干细胞体外培养.

胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs

《体外受精和早期胚胎培养》名师教案

3．2 体外受精和早期胚胎培养 教学设计 吉林省九台市实验高中董俊一、教学目标 知识与能力目标 （1）通过阅读文本、师生活动，能够简述哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。 （2）通过资料分析、小组讨论，能够说出哺乳动物胚胎的早期培养方法。 学科素养 （1）基础知识（哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤；哺乳动物胚胎的早期培养方法）； （2）基本技能（通过“胚胎工程小专家”的讲解，能够用语言描述体外受精与早期胚胎培养的基本流程，培养学生语言表达和应用能力；通过课下查找关于试管动物的资料，体验搜集信息的过程，培养学生整理、分析、归纳资料的能力）；（3）基本思想（过本节课的学习，能够画出并讲解“试管牛”体外受精胚胎工厂化生产流程图，尝试解决我国牛产肉量和产奶量低的实际问题，能将所学知识应用于社会实践）； （4）基本活动经验（通过体外受精和早期胚胎培养的学习，认同体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义）。 二、教材分析 本节课是人民教育出版社选修三专题三第二节的内容，学生在学习了《体内受精和早期胚胎发育》的基础上，进一步学习胚胎工程技术，着重简述哺乳动物体外受精及早期胚胎培养的技术方法。体外受精在胚胎工程技术中应用的较多，是胚胎工程技术的基础。 从知识体系上看，胚胎工程与基因工程、细胞工程等现代生物科技联系密切，比如将基因表达载体导入受精卵中，在体外完成早期胚胎培养，然后移植到生物体内，是基因工程与胚胎工程的结合;卵母细胞在体外培养至成熟的过程，利用的细胞工程中的动物细胞培养技术，体现了胚胎工程与细胞工程的结合。关于“试

管婴儿”，存在着伦理道德方面的问题，因此与专题四《生物技术的安全性和伦理问题》存在着一定的联系。因此在高中生物教学中起着承上启下的作用。 从教学内容上看，教材通过“问题探讨”“思考与讨论”等环节结合图文形式来展现，符合学生认知思维和发展过程。 三、教学重点 （1）体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义 （2）哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤 四、教学难点 （1）卵母细胞的采集和培养。 （2）精子的采集和获能。 五、学情分析 学生通过日常生活中的书籍、电视、网络等接触对“试管动物”、“试管婴儿”、“借腹怀胎”、体外受精等知识，有着一定程度的了解，为本节课的学习打下基础。由于有上一节《体内受精和早期胚胎发育》的知识作铺垫，学生已经掌握了自然条件下精子和卵子的发生及受精和早期胚胎发育，而胚胎工程的体外受精和早期胚胎培养实际是在体外条件下模拟操作动物自然受精和早期胚胎发育的，因此，本节内容对于学生来说易于接受和理解。高中学生具有一定的观察能力、分析问题解决问题的能力。因此，教学中可以利用学生的知识基础并遵循学生的认知规律，通过适当的教学策略完成知识上的学习，能力的培养。 六、教学策略 通过视频的播放，完成对“试管婴儿”产生过程及其意义的学习； 通过投影展示讲解“试管牛”工厂化生产的技术流程图，完成对解决我国牛产肉量和产奶量低的实际问题的学习。 通过问题引导、学生自学，小组合作，“胚胎工程小专家”的讲解，完成对“体外受精和早期胚胎培养”基础知识的学习； 通过对试管动物和克隆动物的比较，达到高阶思维的训练。 设计思维梯度，循序渐进，引导学生从个别到一般，从现象到本质，从已知到未知，从而完成对知识的掌握和能力的培养。 七、教学设计

胚胎培养液

胚胎培养液 胚胎培养液的主要成分包括：水、离子、能量物质、氨基酸、维生素、核酸前体、蛋白质、生长因子激素、缓冲系统及气体，都有商品化现成的培养液可供购买。 水是组成任何培养液的主要成分，在IVF实验室，一般使用Milipore-Q系统产生无致热原的高质量的水( Mii-o)准备培养液及洗涤所有玻璃制品及设备。目前我们对离子在种植前的作用了解很少，因为在培养液中有许多复杂的相互作用，很难了解一种离子的单独作用。哺乳动物的输卵管液的特征是高钾和高氯化物浓度。Roblero等报告高钾有利于精子获能和胚胎发育，培养液中离子的最大作用是控制培养液的渗透压，而渗透压对于人的胚胎发育是很重要的。 种植前胚胎的营养物质包括丙酮酸、乳酸和葡萄糖，胚胎从2细胞发育至囊胚期的各个阶段所需要的各种营养物质的浓度是不同的。氨基酸在种植前和种植期间对于哺乳动物的发育有生理作用，Hardy和Gardner等观察到在培养液中加入氨基酸可加速小鼠和金黄地鼠胚胎的发育。人IVF中最常用的蛋白质的来源是血清，一般浓度为5%～10%。蛋白质在胚胎培养液中的作用不仅仅是固定的氮的来源，并可作为有害金属离子的整合物。但Caro等发现人胚胎在含有或不含有母亲血清的T6培养液中培养，其受精率、胚胎分裂率和妊娠率无明显差异。 大多数胚胎培养液利用碳酸氢盐／二氧化碳作为缓冲系统以维持培养液的生理pH值为7.2—7.4，这是哺乳动物细胞周围液体的生理性缓冲液。其缺点是若培养液暴露在空气中时间过长，pH值迅速增加可引起胚胎损伤或坏死。在培养液上覆盖一层油可减慢培养液中的气体交换。磷酸盐( HERPES)作为缓冲系统可不需要二氧化碳内环境维持其在空气中的pH 值。胚胎培养液中的两种气体是氧和二氧化碳，二氧化碳不仅维持碳酸氢盐缓冲液的pH值，还可使种植前各个阶段的小鼠胚胎与蛋白质和核酸结合。大多数IVF中心应用5%的二氧化碳。许多作者证明，在培养液中将氧的水平减低至5%～7%时，与空气中20%的氧相比对胚胎发育更有利。

生物选修三胚胎工程整理

胚胎工程 第1节体内受精和早期胚胎发育 一、概念 1. 胚胎工程：指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。（经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求） 二、知识结构 精子发生→精子获能 受精→胚胎发育 卵子发生→卵子准备 （一）精子的发生 1. 发生时间：雄性动物从初情期（相当于人的青春期），直到生殖机能衰退，生殖细胞不断增殖，精子不断产生。 发生部位：睾丸曲精管内 2. 发生过程：（各种家畜，大体分为三个阶段）： 第一阶段：（曲细精管管壁的）精原细胞有丝分裂→大量精原细胞→部分形成初级精母细胞第二阶段：初级精母细胞连续两次分裂（减数分裂的MI和MII） 1个初级精母细胞→2个次级精母细胞→4个精子细胞（含单倍染色体） 第三阶段：精子细胞变形→精子 ①细胞核→头的主要部分 ②高尔基体→头部的顶体 ③中心体→尾 ④线粒体（聚集在尾的基部）→线粒体鞘 ⑤细胞内其他物质浓缩→球状原生质滴 （二）卵子的发生 1. 发生时间：动物的胚胎性别分化后 发生部位：卵巢内 2. 发生过程： 第一阶段：【动物的胚胎性别分化后】雌性胎儿卵巢内的卵原细胞有丝分裂→增加数量→演变为初级卵母细胞→被卵泡细胞包围，形成卵泡 第二阶段：【排卵前后】减数第一次分裂→1个次级卵母细胞和第一极体→进入输卵管，准备受精 第三阶段：【精子和卵子结合过程中】减数第二次分裂，次级卵母细胞→1个成熟的卵子和第二极体

△判断是否受精的标志：卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体 ☆精子和卵子在发生上的重要区别： 哺乳动物卵泡的形成和在卵巢内的储备，是在出生前完成的（即胎儿时期） 注：多数不如动物的第一极体不进行减数第二次分裂形成两个第二极体。 卵子发生成熟示意图 （三）受精 一、概念 1. 受精：精子与卵子结合形成合子（即受精卵）的过程。包括会搜经前的准备阶段和受精阶段。自然条件下是在雌性的输卵管内完成。 2. 放射冠：包围在卵子透明带外面的卵丘细胞群。 3. 透明带反应：在精子触及卵黄膜的瞬间，会产生阻止后来的精子进入透明带的生理反应。它是防止多个精子进入透明带，引起多个精子入卵受精的第一道屏障。 4. 卵黄膜封闭作用：精子入卵后，卵黄膜会立即发生一种生理反应，拒绝其他精子再进入卵内，这是防止多精如卵受精的第二道屏障。 二、过程 1. 准备阶段1-精子获能：刚刚排出的精子，不能立即与卵子结合，必须在此行动物【生殖道】发生相应的生理变化后，才能获得受精能力。 2. 准备阶段2-卵子的准备：卵子在受精前也要经历类似精子获能的过程，动物排出卵子的成熟程度不同（初级卵母细胞-如马、犬等；次级卵母细胞-如猪、羊等），但都要在【输卵 3. 受精阶段： 主要包括精子穿越放射冠和透明带，进入卵黄膜，原核形成配子结合 ①顶体反应，释放顶体内的酶，额直接溶解卵丘细胞之间的物质，形成精子穿过放射冠的通路。 ②透明带反应：穿过放射冠的精子立即与透明带接触，穿过顶体酶溶出通道后，接触卵黄膜，发生透明带反应。 ③卵黄膜封闭作用：精子与卵黄膜接触后，立即被卵黄膜表面的微绒毛抱合→精子外膜与卵黄膜融合→精子入卵→卵黄膜封闭作用 ④入卵后的变化： 精子：尾部脱离，核膜破裂→形成新的核膜→雄原核形成（比原来精子核还大）

2018_2019学年高中生物专题3胚胎工程3.2体外受精和早期胚胎培养教学案含解析新人教版选修

体外受精和早期胚胎培养 一、试管动物技术 1．概念：试管动物技术是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育为早期胚胎后，再经移植产生后代的技术。 2．主要技术手段：体外受精、早期胚胎的培养和胚胎移植。 3．应用：主要用于良种动物的快速大量繁殖。 二、体外受精 1．卵母细胞的采集和培养[连线 ] 2．精子的采集和获能 (1)精子的采集：[连线 ] (2)精子的获能：[填表] 1．试管动物技术运用的技术手段主要有体外受精、早期胚胎培养和胚胎 移植。 2．哺乳动物的体外受精主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等 几个主要步骤。 3．从卵巢采集的卵母细胞需在体外培养到M Ⅱ中期才能与获能的精子受 精。 4．收集精子常用的方法有假阴道法、手握法和电刺激法。 5．精子体外获能的方法有培养法和化学诱导法两种。 6．哺乳动物胚胎的培养液中，除一些无机盐和有机盐类外，还需添加维 生素、激素、氨基酸、核苷酸，以及血清等营养物质。 7．动物胚胎一般在桑椹胚或囊胚阶段进行移植。

3．受精 获能的精子和培养成熟的卵子，一般情况下都可以在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。 三、胚胎的早期培养 1．培养液的成分 无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。 2．培养的目的 (1)检查受精状况和受精卵的发育能力。 (2)使胚胎发育到适宜的阶段向受体移植或冷冻保存。 3．胚胎移植的时间 (1)牛、羊一般在桑椹胚阶段或囊胚阶段进行移植。 (2)人的体外受精胚胎，可在8～16个细胞阶段移植。 1．采集卵母细胞常用的方法有( ) ①用促性腺激素处理后，从输卵管中冲取卵子 ②化学诱导法 ③电刺激法 ④从活体动物卵巢中吸取卵母细胞 A ．①② B ．②③ C ．①④ D ．③④ 解析：选C 小型动物常用促性腺激素处理后，从输卵管中冲取卵子，此方法获得的是成熟的卵子；对于大型动物，常从活体动物卵巢中吸取卵母细胞，此方法获取的卵母细胞需要继续培养至成熟。 2．可以与获能精子进行体外受精的卵母细胞需要培养到( ) A ．MⅠ期 B ．MⅡ中期

动物细胞培养及胚胎培养培养基的要求

动物细胞培养时对培养基的要求： 培养基按其来源可分为天然培养基和合成培养基。天然培养基的营养成分与细胞在体内所需条件比较接近，但就细胞在体外生存的环境来说，合成培养液也有其独特之处，譬如成分便于控制和标准化。体外培养的细胞直接生活于培养基中，无论何种培养基都应该能满足细胞生长所需的营养与生理的基本要求。 (1)营养成分： 1）氨基酸合成培养液中的氨基酸以12种必需氨基酸为主，这些氨基酸不能由细胞自身合成，必需由培养液供给。在氨基酸的成分中谷氨酰胺的作用特别重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在配制各种培养液中应补加一定量的谷氨酰胺。 2）单糖葡萄糖是最常用和最好的单糖 3）维生素维生素在细胞代谢过程中必不可少，主要可以提供辅酶和辅基。生物素、叶酸、泛酸、核黄素、维生素B12等等 4）其他成分：细胞生长过程中除需钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素外，还需要一些微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼等。此外，为优化细胞生存环境，合成培养基中有时还添加些其他成分，包括核酸降解物、抗氧化剂等。 （2）促生长因子及激素 各种激素、生长因子对于促进细胞生长、维持细胞功能、保持细胞的状态具有十分重要的作用。如胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，泌乳素可促进乳腺上皮细胞生长的作用。各种生长调节因子的作用更加明显并具有特异性。 （3）pH 大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围对细胞将产生有害影响。造成培养基pH 波动的主要物质是细胞代谢产生的二氧化碳。解决这一问题可采取两种方法：一是用具有一定缓冲能力的培养基，如使用NaHCO3-CO2缓冲系统，二是采用开放式培养的方法，使细胞代谢产生的二氧化碳及时逸出培养皿。 （4）渗透压 细胞必须生活在等渗的环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定的耐受性。 注：天然培养基主要指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。 合成培养基是人工配制的培养基，给细胞提供一个近似体内生存的环境，又便于控制和标准化的体外生存环境，但合成培养基尚未成为十分完全的培养基。只能维持细胞不死，不能促进细胞增殖生长，使用时还需要添加一定比例的天然培养基（如小牛血清） 早期胚胎的体外培养 体外受精的早期胚胎在体外发育的中，往往会停止在某一阶段不再发育，这种现象称为：发育阻滞。此外体外培养环境下不能及时清除有害物质（如细胞内H2O2），不断积累也会造成细胞中毒，使胚胎阻滞。 发育阻滞是体外培养中的一个主要障碍，通过改进培养液成分和建立体细胞共同培养体系，在不少动物中已克服，使胚胎顺利发育到囊胚阶段。 1.培养条件： （1）能量底物 胚胎培养液一般不含葡糖糖，代之以乳酸和丙酮酸为能量供应物。研究表明早期胚胎对葡萄糖的利用是有限的，而主要以乳酸和丙酮酸为能量代谢的底物，所以，培养液中低剂量葡萄糖的添加是必需的。

人教版高中生物选修三3.2《体外受精和早期胚胎培养》word教案

【优化设计】-高中生物 3.2体外受精和早期胚胎培养教案新人教 版选修3 教学建议 本节内容是在哺乳动物体内受精和胚胎发育的理论基础上,着重简述哺乳动物体外受精和胚胎早期培养的技术方法。本节内容简单,学生通过阅读基本能明白。另外,由于所讲内容技术性较强,与学生的生活相距较远,不易激发学习兴趣,所以教师可采用探究式的学习方法,以“试管牛”为例,创设出一种新的学习情境,在教师的带领下,让学生以胚胎工程学家的身份出现,去思考和探究“体外受精和早期胚胎培养”的过程,领悟其探究的方法,以达到激发兴趣、培养能力、获取知识的目的。 创设情境,提出如何解决良种牛的快速繁殖问题,并很自然地提出“借腹怀胎”问题。这样学生很容易理解体外受精在生产实际中的意义,也能激发学生学习抽象内容的兴趣。 请学生回忆第一节课的内容,并思考讨论以下问题。 (1)哺乳动物体内胚胎的形成需要经过哪些过程?(精子和卵子的发生—受精—胚胎的发育) (2)哺乳动物体外胚胎的发育需要完成哪些环节?(获得精子和卵子—体外受精—体外胚胎培养) 首先,请学生阅读教材;然后教师与学生一起制定研究“试管牛”工厂化生产的技术流程,并拟出以下关于技术流程的研究题目,由学生讨论交流:卵母细胞的采集和培养,精子的采集和获能,受精,胚胎的早期培养,画出“试管牛”工厂化生产的技术流程图解;最后,教师进行总结。 参考资料 如何选择用于体外培养的卵母细胞 在选择卵母细胞时,无论用哪种方法采集到的卵母细胞,外围一般都应该有数层卵丘细胞所包围,形成一个叫卵丘复合体的结构。这种结构对于卵母细胞在体外条件下的成熟是十分重要的。在对家畜体外受精的操作中,一般把未成熟的卵母细胞分成A、B、C、D四级。对A级卵母细胞要求是有3层以上的卵丘细胞包围,卵母细胞的细胞质均匀;B级是少于3层卵丘细胞,但卵母细胞质要均匀;C级为没有卵丘细胞包围的卵母细胞,又称裸卵,培养效果很差;D级是退化或死亡的卵母细胞,应淘汰。A、B两类卵母细胞培养效果较好。 第1页共1页

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明胶包被 细胞传代 体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） 体外分化方法 注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。 一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF

简述胚胎工程技术的发展历程及应用

简述胚胎工程技术的发展历程及应用 摘要胚胎工程是我们高中生物的重要知识点，基于对课本知识的进一步理解和相关文献资料的收集整理，文章简述了胚胎工程技术的发展历程，对其在畜牧业上的应用进行了分析，从而让我们对胚胎工程有了更全面的认识和了解。 关键词胚胎工程；移植；分割；转基因 1 胚胎工程的定义 胚胎工程主要是对哺乳动物的胚胎进行某种工程技术操作，然后让其继续发育获得人们所需要的成体动物的一种技术。对动物早期胚胎所进行的多种显微操作和处理技术。包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养等技术[1]。 2 胚胎工程技术的发展历程 2.1 胚胎移植 哺乳动物的胚胎移植始于1890年，当时英国剑桥大学Heape首次获得兔受精卵移植的成功。Heape的成功，第一次证实了受精卵在寄主体内发育的可能性，从而奠定胚胎移植的生理学基础和原则。19世纪30年代以后，胚胎移植成为生物科学研究的主要方向之一，几种家畜如绵羊（1934）、山羊（1949）、猪（1951）、牛（1951）和马（1973）都相继获得移植成功。但这一时期，胚胎移植主要停留在实验室水平和鲜胚的移植上。其原因是移植过程中，手术操作常常会对受体和供体造成不良影响，甚至影响供体以后的生殖能力，同时胚胎来源途径少，使移植失去了生产意义。60年代以后，随着畜牧业的发展和繁殖基础理论研究的深入，人们开始采用激素对供体进行超数排卵处理，对受体进行同期发情处理。尤其是Sugie（1972 年）设计成功非手术采卵方法，推动了胚胎移植技术的成熟和胚胎移植的商品化。1971年，世界上出现了第一个胚胎移植的商业运作公司。 2.2 胚胎分割 胚胎分割是继冻胚移植之后对胚胎处理的又一新技术。胚胎分割始于六十年代，它是通过对胚胎进行显微手术，人工制造同卵双胎或同卵多胎是胚胎移植中增加胚胎来源的一个重要途径。同时，还有利于良种扩群；可培养同卵孪生动物，为药学、医学、生物学试验提供试验动物，获得更准确研究结果，对科学实验和生产应用都有重要意义。1968年Mular 兔胚分割移植获得成功。继而绵羊（Trouson等，1974；Willadsen，1979年）、小鼠（Trunoda &Mclaren，1983年）、牛（Willadsen，1982年）、山羊（Tsunnoda等，1984年）、马（Allen &Pashen，1984年）等胚胎分割移植先后获得成功。胚胎移植已从半胚移植发展到将晚期桑葚胚二分、三分、四分、甚至八分。分割后的胚胎可还原于透明带内培养后移植，也可以直接培养后移植。八分胚移植成功率达50%，效率提高了4倍。在今

云南省昭通市高三生物 《3.2 体外受精和早期胚胎培养》教案.doc

专题三胚胎工程体外受精和早期胚胎培养 我说的课题是高中生物（选修三）专题三第二节《体外受精和早期胚胎培养》一课。下面我就教材内容、学生情况、教学方法及手段、教学程序、教学设计、教学体会六个方面进行说明。 一、教材内容 （一）教材的地位和作用 《体外受精和早期胚胎培养》为专题三《胚胎工程》第二节。这部分内容是在哺乳动物体内受精和胚胎发育的理论基础上，着重简述哺乳动物体外受精和早期胚胎培养的技术，为第三节《胚胎工程的应用及前景》打下基础。所以这节课在教材中起到了很好的承上启下作用。所以，本节内容在专题三中有重要地位。（二）教学目标 1、简述哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。 2、简述哺乳动物胚胎的早期培养方法。 3、认同体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义。（三）教学重难点 重点： 1、体外受精在家畜快速繁殖中重要意义。 2、哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。 难点： 1、卵母细胞的采集和培养。 2、精子的采集和获能。 二、学生情况 高二阶段是学生由半幼稚、半成熟逐步走向成人化的关键时期。这一阶段学生的思维比较活跃，好奇心、成就感较强，但缺乏生活经验及社会体验。在小学和初中时，他们学习了解过相应的生物知识，但高中生物的跨度较大，且主要目的是高考，这样，就更增大了学生学习的难度。所以我在教学过程中更注意激发学生学习的兴趣和积极性，培养学生良好的学习习惯。 三、教学方法 教法：以讲授法为主。 问题导入：设计问题串，引导学生主动思考“试管动物技术”中所蕴涵的科学原理。利用多媒体演示：让学生熟悉“试管牛”的培养过程和技术。通过列表比较，让学生理解试管动物与自然分娩动物、克隆动物的异同。 学法：利用学生分组讨论：卵母细胞的采集方法和培养、精子的采集和获能、动物体外受精和胚胎早期培养的技术流程，让学生思考和领悟相关方法，以达到激发兴趣、培养能力、获取知识的目的。 四、教学手段 采用多媒体课件辅助教学。 五、教学过程 本节课我按照“问题导入——讲授新课——小结——巩固练习”的程序来组织教学。首先我通过设计问题：“你今天喝牛奶了吗？如何提高奶牛的产奶率？如何快速、大量繁殖动物优良品种”等问题引出试管动物技术的概念及体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义，提出本节主题。 对于体外受精我采用学生分组讨论：卵母细胞的采集方法和培养、精子的采集方法和获能方法、动物体外受精过程，由学生汇报讨论情况后我再对这部分知识进行讲解，让学生对这部分知识内化，达到突破重难点的目的。 对于早期胚胎发育，我通过学生思考、教师讲解归纳的方式让学生理解早期胚胎培养的目的、培养液的成分等知识。 最后，通过“试管牛”工厂化生产的技术流程来升华本节内容。 小结时我利用多媒体让学生回顾本节主干知识，使所学知识系统化，条理化，从而在脑海中留下清晰的知识网络。