第23讲病毒感染实验诊断

第23章病毒感染的实验诊断

一、教学大纲要求

（1）标本的采集、处理与运送注意事项

（2）病毒形态学检查方法

（3）病毒的分离与鉴定程序及方法

（4）病毒感染的快速诊断方法

二、教材内容精要

（一）标本的采集、处理与运送

根据临床诊断及病期采集不同的标本，用于病毒学分离和鉴定的标本应在病程初期或急性期采集，要进行预处理才能用于接种和其他方法的检测。病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）以防止反复冻溶使病毒灭活，存放在-70℃低温冰箱内保存。

（二）病毒形态学检查

1.光学显微镜

仅用于大病毒颗粒（如痘类病毒）和病毒包涵体的检查。

2.电子显微镜检查法

（1）电镜直接检查法

某些病毒感染的早期，临床标本中就可出现病毒颗粒。标本经粗提浓缩后用磷钨酸盐负染，电镜下直接观察，可发现病毒颗粒，获得诊断。

（2）免疫电镜检查法

将病毒标本制成悬液，加入特异性抗体、混匀，使标本中的病毒颗粒凝集成团，再用电镜观察，可提高病毒的检测率。本法比电镜直接检查法更特异，更敏感。

3.超过滤法

用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚，或用血凝试验来测定病毒是否通过滤膜，从而估计病毒的大小。

4.超速离心法

根据病毒大小的不同，其沉降速度也不同。可用超速离心法测得病毒的沉降系数（S），借以计算病毒的大小。

5.X线晶体衍射法

根据X线衍射图谱，用数学方式处理来研究病毒结构亚单位和分子结构等。但标本必须为结晶，

可用于无包膜病毒的研究。

（三）病毒的分离与鉴定

1.病毒分离培养

实验室分离培养病毒的方法主要有三种：动物接种、鸡胚接种和组织培养。根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同，可分为：原代和次代细胞培养，二倍体细胞培养，传代细胞培养。

2.病毒在培养细胞中增殖的指标

（1）细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。

（2）红细胞吸附

（3）干扰现象

（4）细胞代谢的改变

3.新分离病毒的鉴定

（1）病毒核酸类型的测定用RNA酶及DNA酶可鉴定出病毒核酸的类型。另外，DNA病毒受5-氟尿嘧啶的抑制，而RNA病毒不受影响。用此方法亦可区分DNA与RNA病毒。

（2）理化性状的检测对脂溶剂的敏感性：有包膜的病毒（如正粘病毒、副粘病毒、逆转录病毒等）含有脂类，对乙醚、氯仿和胆盐等脂溶剂均敏感，经作用后病毒失去感染性，而无包膜的病毒对脂溶剂有抵抗。耐酸性试验：肠道病毒与鼻病毒均属于小RNA病毒科，均耐乙醚。但前者可耐pH3，而后者在pH3~5环境中很快被灭活，故可将两者相区别。

（3）血清学鉴定病毒型别的最后鉴定必须依靠血清学方法。将分离的病毒与已知的诊断血清作各种试验进行鉴定。

（四）病毒的血清学检测

血清学试验是诊断病毒感染和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的主要方法之一。血清学试验的方法很多，最常用的如中和试验、补体结合试验、血凝及血凝抑制试验等。

1.中和试验

中和试验是病毒型特异性反应，是指应用特异性抗体中和病毒的致病性或感染性的试验。将病人血清与一定量的已知病毒混合，作用一定时间后，接种于实验动物、鸡胚或细胞培养中，观察病毒的致病作用是否被中和而不出现感染指标。以此判断病人血清中有无特异性抗体存在。本法特异性高，但操作比较复杂，费时。主要用于鉴定病毒；分析病毒抗原的性质；测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果；测定病人血清中的抗体，用于诊断病毒性疾病。

2.补体结合试验

特异性病毒抗原和相应的抗体结合形成免疫复合物时能结合补体。本实验操作繁琐，特异性较

中和试验低，但补体结合抗体出现早，消退快，有助于早期诊断。主要用于流行病学调查；病毒病的诊断；疫苗使用后人群抗体情况调查；检测病毒抗原；鉴定病毒属。

3.血凝及血凝抑制试验

血凝试验和血凝抑制试验为型特异性反应，其原理为某些病毒或病毒血凝素能选择性地引起个别种类的哺乳动物的红细胞发生凝集，当加入相应的特异性抗体时，这种凝集现象即被抑制。主要用途为发现与鉴定病毒；诊断病毒病；病毒分型；免疫机体后抗体效价的测定；浓缩病毒；病毒抗原分析（某些病毒可用交叉血凝抑制试验分析抗原成分）；病毒株变异相的测定等。

4.凝胶免疫扩散试验

以半固体琼脂糖为支架所进行的抗原、抗体的沉淀反应。本方法简便，特异性与敏感性均较高，而且衍生出对流免疫电泳和火箭电泳等更为敏感的检测技术。此法在病毒性疾病中主要用于诊断HBV 与乙型脑炎病毒等感染。

（五）病毒的分子生物学检测

1.分子杂交技术

分子杂交是利用放射性核素或非放射性核素标记的已知特异性核酸片段作为探针，检测标本中与探针有相同序列的目的核酸，常用的杂交方法：

（1）斑点杂交

（2）固相杂交技术

（3）原位分子杂交

（4）Sorthern印迹

（5）Northern印迹

（6）分支DNA技术

2.聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）

PCR是一种选择性体外酶促扩增DNA或RNA片段的方法，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。常用技术有：

（1）巢式PCR

（2）半巢式PCR

（3）逆转录PCR（RT-PCR）

（4）多重PCR

（5）原位PCR

（6）定量PCR

(7)RNA捕获

(8)免疫PCR

3.凝胶电泳技术

核酸和蛋白质等生物大分子的分子量大小、所带电荷等存在差异，使其在电场中表现为泳动速度的不同，在介质中形成各自不同的条带，而使其分离开。凝胶电泳技术是常用的分离鉴定核酸、蛋白质等生物大分子方法之一，可直接用于如轮状病毒、呼肠病毒等病毒的检测和病毒PCR产物检测等。凝胶电泳根据所用载体不同又可分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等，根据电泳槽不同可分为圆盘电泳、垂直板电泳和水平电泳，前者已很少被使用。

（1）琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖作载体，常采用水平电泳分离、鉴定核酸。

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳用于蛋白质和分子量在1kb以下核酸分离鉴定，分连续和不连续电泳。

（六）病毒感染的快速诊断

1.形态学检查

2.病毒抗原的检测

（1）免疫荧光技术

直接对标本或接种的组织培养进行早期抗原检测，可用标记荧光素的特异抗体直接从标本中检查病毒抗原（直接法），也可用未经标记的特异抗体先与标本中可能存在的抗原结合，然后加入荧光素标记的抗特异性抗体的免疫血清（一般为IgG型的抗体），使荧光抗体与特异性抗体结合，以检测标本中已与特异抗体结合的病毒抗原（间接法）。此法检测迅速、特异性高，但需有荧光抗体及荧光显微镜等设备。

（2）固相放射免疫测定

首先将特异性抗体吸附到微量反应板孔底部的塑胶小球或其他固相系统上，与待检的病毒抗原结合，洗涤后再加标记放射性同位素的特异性抗体，做成标记复合物，用γ-计算器检测。

（3）酶免疫技术

此法可检测多种病毒及其抗体，主要是酶免疫组化法和酶联免疫吸附试验法（ELISA）。前者又称免疫过氧化物酶染色，用酶标记的特异性抗体直接检测标本中的抗原，此法不仅能定性抗原，并能在显微镜下观察其定位和分布情况；ELISA是用酶标记的抗体或抗抗体来检测标本的病毒抗原或血清抗体。酶标抗体可被待检的抗原抗体固定在微孔反应板上，当加入的酶作用底物后则出现底物被酶分解的显色反应。此法克服了固相免疫法的缺点，其试剂安全、易保存、操作简便，而且其敏感性与特异性均与固相放免法相似。

（4）其他技术

如发光免疫分析技术、胶体金标记的免疫层析技术等。

3.早期抗体检测

检测病毒特异性IgM抗体可诊断急性感染，特别是IgM抗体的存在对证实孕妇感染风疹病毒尤为重要。目前IF法、固相放免法和ELISA法都已应用于IgM的检测，但应注意类风湿因子（IgM）的干扰。

4.病毒核酸检测

病毒感染实验诊断

病毒感染实验诊断 1. （1）一般原则是特异敏感、快速和简便。首先根据流行病学和临床特点，初步判断可能感染的病毒。 （2）然后根据可疑病毒的生物学特点、机体免疫应答和临床过程，以及病人当前所处的时机，确定实验诊断方法。 2. （1）对潜伏期短，发病时尚无抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。 （2）对潜伏期超过十天的感染，可检测特异性的IgM抗体来进行早期快速诊断，及区别初次和再次感染。 （3）对可在体内形成持续感染或潜伏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG 抗体有无4倍以上升高，或直接检测病毒核酸。 （4）对原因不明或有新病毒感染时，应采集标本进行病毒分离，同时应采取双份血清以确认分离的病毒为病原体。 （5）对同一症状可有多种病毒引起的情况，应同时检测几种相关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体。 （6）对由多个型别组成的病毒可测定它们的共同抗原。 第一节标本采集与运送 一、标本的采集 1. 采样时间：尽可能在发病的初期，急性期或患者人院的当天进行。 2. 标本种类的选择：根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择相应部位采取标本。 常见分离病毒标本的选择： 3．常见标本的采集方法 (1) 血液：以无菌取抗凝血10ml。抗凝选用100n／ml肝素钠。用于分离CMV、HSV，、黄病毒、EBV、HIV-1及新生儿肠道病毒。 (2) 脑脊液：以无菌取脑脊液1～2ml，冰浴立即送检。在4℃可存放72h。用于分离柯萨奇病毒、ECHO病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。 (3) 宫颈或阴道拭子：采取病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm停留5秒取出，冰浴立即送检。用于分离HSV、CMV。 (4) 粪便标本：取2～4ｇ粪便加10ml运送液立即送检，用于分离腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。 (5) 含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。用于分离流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV

第23讲病毒感染实验诊断

第23章病毒感染的实验诊断 一、教学大纲要求 （1）标本的采集、处理与运送注意事项 （2）病毒形态学检查方法 （3）病毒的分离与鉴定程序及方法 （4）病毒感染的快速诊断方法 二、教材内容精要 （一）标本的采集、处理与运送 根据临床诊断及病期采集不同的标本，用于病毒学分离和鉴定的标本应在病程初期或急性期采集，要进行预处理才能用于接种和其他方法的检测。病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）以防止反复冻溶使病毒灭活，存放在-70℃低温冰箱内保存。 （二）病毒形态学检查 1.光学显微镜 仅用于大病毒颗粒（如痘类病毒）和病毒包涵体的检查。 2.电子显微镜检查法 （1）电镜直接检查法 某些病毒感染的早期，临床标本中就可出现病毒颗粒。标本经粗提浓缩后用磷钨酸盐负染，电镜下直接观察，可发现病毒颗粒，获得诊断。 （2）免疫电镜检查法 将病毒标本制成悬液，加入特异性抗体、混匀，使标本中的病毒颗粒凝集成团，再用电镜观察，可提高病毒的检测率。本法比电镜直接检查法更特异，更敏感。 3.超过滤法 用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚，或用血凝试验来测定病毒是否通过滤膜，从而估计病毒的大小。 4.超速离心法 根据病毒大小的不同，其沉降速度也不同。可用超速离心法测得病毒的沉降系数（S），借以计算病毒的大小。 5.X线晶体衍射法 根据X线衍射图谱，用数学方式处理来研究病毒结构亚单位和分子结构等。但标本必须为结晶，

可用于无包膜病毒的研究。 （三）病毒的分离与鉴定 1.病毒分离培养 实验室分离培养病毒的方法主要有三种：动物接种、鸡胚接种和组织培养。根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同，可分为：原代和次代细胞培养，二倍体细胞培养，传代细胞培养。 2.病毒在培养细胞中增殖的指标 （1）细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。 （2）红细胞吸附 （3）干扰现象 （4）细胞代谢的改变 3.新分离病毒的鉴定 （1）病毒核酸类型的测定用RNA酶及DNA酶可鉴定出病毒核酸的类型。另外，DNA病毒受5-氟尿嘧啶的抑制，而RNA病毒不受影响。用此方法亦可区分DNA与RNA病毒。 （2）理化性状的检测对脂溶剂的敏感性：有包膜的病毒（如正粘病毒、副粘病毒、逆转录病毒等）含有脂类，对乙醚、氯仿和胆盐等脂溶剂均敏感，经作用后病毒失去感染性，而无包膜的病毒对脂溶剂有抵抗。耐酸性试验：肠道病毒与鼻病毒均属于小RNA病毒科，均耐乙醚。但前者可耐pH3，而后者在pH3~5环境中很快被灭活，故可将两者相区别。 （3）血清学鉴定病毒型别的最后鉴定必须依靠血清学方法。将分离的病毒与已知的诊断血清作各种试验进行鉴定。 （四）病毒的血清学检测 血清学试验是诊断病毒感染和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的主要方法之一。血清学试验的方法很多，最常用的如中和试验、补体结合试验、血凝及血凝抑制试验等。 1.中和试验 中和试验是病毒型特异性反应，是指应用特异性抗体中和病毒的致病性或感染性的试验。将病人血清与一定量的已知病毒混合，作用一定时间后，接种于实验动物、鸡胚或细胞培养中，观察病毒的致病作用是否被中和而不出现感染指标。以此判断病人血清中有无特异性抗体存在。本法特异性高，但操作比较复杂，费时。主要用于鉴定病毒；分析病毒抗原的性质；测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果；测定病人血清中的抗体，用于诊断病毒性疾病。 2.补体结合试验 特异性病毒抗原和相应的抗体结合形成免疫复合物时能结合补体。本实验操作繁琐，特异性较

病毒感染细胞实验整体流程及原理

病毒感染细胞实验整体 流程及原理 Standardization of sany group #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#

病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理

分子诊断检测项目介绍分子诊断检测项目介绍

分子诊断检测项目介绍 天津万盖得门诊部是一家由海外归国人员为主体创办的股份制民营医疗机构, 以引进、开发和推广新的医学检验技术为主要经营内容。万盖得三字来自英语“ V nguard”的音译，其意译为前哨或尖兵的意思，这表明了创办者“敢为天下人先”的意愿。希望能够凭借自身的知识、技术、信息和观念优势，为国内医学检验方面的技术进步以及医疗体制的改革做出贡献。万盖得将以严肃、严谨和科学的态度开展各项业务，为医院和社区提供高质量的医疗和检验服务。 分子诊断是我们首先开展的实验诊断服务，这是一个全新的、被称之为实验诊断一场革命的领域，因为分子技术的临床应用已经使很多用常规技术根本无法检测的病理变化可以被精确的测到。我们首先开展的用细胞DNA 定量分析系统进行肿瘤的早期诊断，处于世界领先地位，这项技术已使脱落细胞的检查成为一项客观、准确、自动化和高通量的肿瘤筛查和早期诊断的技术平台。我们自主开发的多重PCR 检测性病病原、病毒和难以培养的细菌性病原，将给感染性疾病的诊断和治疗带来新的突破性进展。在医疗服务方面，我们计划引入发达国家中行之有效的家庭医生服务模式，为中等收入以上的家庭和个人提供个体化和优质的医疗和保健服务，引导我们的服务对象建立起防病重于治病的观念，主动地提高自身的保健意识。与同等规模的医疗机构，保持一种即竞争又合作的新型关系。与大型综合医院和专科医院，我们希望能建立起互补和互利的协作关系。我们相信，万盖得在各级领导和医务界同仁的关怀和支持下，定能发展壮大。 万盖得首席科技顾问 临床微生物学博士吴 尚为2006 年元月

分子诊断目录 细胞分子生物学检测 细胞DNA定量分析系统简介 细胞DNA定量分析的基本原理 细胞DNA定量分析的临床应用价值 不同DNA指数（DI）在宫颈癌普查中的临床意义 宫颈癌和宫颈癌的早期诊断宫颈癌筛查和常规宫颈细胞学检查宫颈细胞学检查的方法宫颈细胞DNA定量分析细胞DNA定量分析的其他用途 核酸检测技术 基本概念 多聚酶链反应-PCR 人类乳头状瘤病毒的检测 人类乳头状瘤病毒人类乳头状瘤病毒与宫颈癌人类乳头状瘤病毒对宫颈癌的“预警”作用万盖得宫颈癌筛查—预警—监测和早期诊断系统宫颈标本采集、送检注意事项 慢性生殖道感染和性传播疾病病原的检测慢性生殖道感染和性传播疾病引起慢性生殖道感染和性传播疾病的常见病原诊断困难造成对发病率统计的困难实验检测方法及优、缺点分子扩增技术的应用促进了对性病的了解 PCR已成为检测性病病原的金标准 万盖得多重PCF检测性病病原 脑脊液中感染病原的检测 中枢神经系统感染和诊断 人类疱疹病毒与中枢神经系统感染 脑脊液中检测病毒的困难 万盖得多重PCR检测脑脊液中的疱疹病毒 细菌性中枢神经系统感染

病毒感染的实验诊断

病毒感染的实验诊断 病毒感染的实验诊断（一） ●考点 病毒的生物学性状 病毒的实验室检查方法 常见病毒的感染 [讲义编号NODE70103300270100000101：针对本讲义提问] 【内容讲解】 第一节概述 一类非细胞型微生物，个体极小，可通过细菌滤器，需用电子显微镜观察。 仅含一种核酸作为遗传物质，外被蛋白质衣壳或还有包膜。 病毒只能在活细胞内寄生，以复制的方式进行增殖。 在临床微生物感染中，近75%的传染病是由病毒引起的。 [讲义编号NODE70103300270100000102：针对本讲义提问] 一、病毒的基本性状 （一）形态结构 1.大小和形状： 大小：测量单位用纳米表示，一般在20-300nm之间。 形态大致可分为：球形或近似球形、杆状、弹形、砖形、蝌蚪形等。 [讲义编号NODE70103300270100000103：针对本讲义提问] 2.结构 [讲义编号NODE70103300270100000104：针对本讲义提问] （二）病毒的增殖 病毒必须依赖宿主细胞，

以特殊的自我复制方式进行增殖。 病毒的复制周期： 吸附、穿入、脱壳、生物合成、 组装与成熟、释放6个阶段。 [讲义编号NODE70103300270100000105：针对本讲义提问] 异常增殖： 顿挫感染：病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能合成本身的成分或不能组装和释放有感染性的病毒颗粒。 缺陷病毒：由于病毒基因组不完整或基因位点改变而不能进行正常增殖的病毒。 干扰现象：当两种不同的病毒或两株性质不同的同种病毒，同时或先后感染同一细胞或机体时，可发生一种病毒抑制另一种 [讲义编号NODE70103300270100000106：针对本讲义提问] （三）噬菌体 以细菌、真菌等为宿主，能引起细菌等裂解的病毒。 噬菌体特异性识别细菌表面受体，可用于进行细菌的鉴定与分型。 噬菌体感染细菌后产生两种后果： 溶菌周期和溶源性周期。

[VIP专享]病毒感染细胞实验整体流程及原理

病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒

1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较 慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较 病毒表达系统慢病毒表达系统（Lentivirus）腺病毒表达系统（Adenovirus）病毒基因组RNA病毒双链DNA病毒复制自主复制自主复制 是否整合病毒基因组整合于宿主基因组，长时 间、稳定表达外源基因病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬 时表达外源基因 感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞，适用于难转 染的原代细胞（如神经细胞）及体内 实验 感染分裂和不分裂细胞表达风度中水平表达高水平表达

第25章 病毒感染的检查方法

第25章病毒感染的检查方法 与防治原则 第一节病毒的诊断 随着对病毒感染从生物学及分子生物学水平的研究进展，病毒的诊断技术已由传统方法扩展至新的快速诊断技术。病毒感染的快速诊断有利于对病毒感染者的治疗；例如对有些病毒（如疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒）感染已有较特异的抗病毒药物治疗。早期诊断及早期治疗对控制病毒感染十分重要。此外，从群体感染角度分析，确诊病毒感染的病原在监测病毒的流行病学（如新型流感病毒、肺出血型汉坦病毒的发现等）方面也有重要的现实意义。 标本的采集与送检用于分离病毒或检测病毒及其核酸的标本应采集病人急性期标本。根据不同病毒感染采取不同部位的标本（如鼻咽分泌物、脑脊液、粪便或血液）。由于病毒在室温中很易被灭活，应在采集和运送标本中注意冷藏。如欲检测抗体，早期单份血清可用于检测IgM抗体，而欲检测早期与恢复期的抗体效价的变化，则需采集早期与恢复期双份血清。血清抗体检测标本应保存于－20℃。 病毒的分离、培养与鉴定目前最常用的方法是细胞培养。在注明欲检测的病毒后，病毒分离培养的实验室将选择适当的原代培养细胞（敏感性高）及传代细胞系（便于在实验室保存）作病毒分离培养。接种标本后，细胞可出现病变或也可并不出现病变而需用血细胞吸附等方法检测是否有病毒增殖，并进一步还需用特殊的抗体鉴定病毒的种类，例如用特异荧光抗体染色或抗体中和试验等。当无病毒增殖时，可能标本中病毒含量较低，未被检出，则需要盲目传代3次后方可明确标本中是否存在病毒。这一分离与鉴定病毒的全过程有时可长达2～3个月，而且仅在有设备、实验条件及合格工作人员的实验室方可进行。虽然这种方法所需时间长、步骤多，但在确定病原上是“黄金标准”，即其准确性高而无误。如我国台湾省确定由肠道病毒71型引起多数患儿发生脑膜炎并致死的研究报道，就是由分离培养及鉴定病毒所确诊。如欲提高病毒感染细胞培养的敏感性，可将病毒接种于内有盖玻片的细胞培养瓶，经低温离心后，以增加病毒与细胞接触的机率。再将盖玻片进行培养，并用单克隆抗体染色，藉以通过检测病毒的早期抗原进行诊断。 在流感病毒的分离培养中，最敏感而特异的方法是鸡胚接种，并用血凝和血

国外主要分子诊断POCT概览

POCT设备携带方便，操作简单、检测时间短，使用成本低。在美国，70%的临床检测均由POCT完成，以小于1%的检测费用影响了超过70%的临床决策，年产值超过百亿美元。而在中国，这一比例不到10%，发展潜力极为巨大。 分子诊断从基因层次进行检测，检测对象为核酸，灵敏度和准确性高，可在感染初期识别病毒或者提早确认基因突变，基于PCR的分子诊断往往是医院对传染病诊断的“金标准”。虽然目前市场份额较低，仅有5%，但分子诊断目前还处在行业技术的起步阶段，未来将有巨大的发展空间。 应用分子诊断方法的POCT凭借其灵敏度和准确度高、携带方便、操作简单、检测时间少、对环境无要求及成本低的优点，极有可能会成为未来体外诊断行业发展的主流。然而POCT分子诊断系统技术门槛非常高，基本被Danaher、Roche、Biomerieux、Abbott等几大巨头垄断，国内很多公司想尽办法去copy这些产品都没有成功。2013年生物梅里埃以4.5亿美元收购Filmarray，丹纳赫2016年更以40亿美元的天价收购Cepheid，而国内POCT的龙头企业万孚生物采用银行贷款的方式以1.25亿元人民币投资了POCT分子诊断公司Atlas Genetics，充分显示了POCT分子诊断平台技术的稀缺性。 本篇主要介绍国外几个主要的分子诊断POCT产品。 1. Cephid GeneXpert 平台 该平台运用半巢式qPCR+微流控技术，组建了多机并联检测系统，满足不同通量的检测需求。已拥有17项FDA认证及23项欧盟认证的诊断项目，如：结核分枝杆菌、MRSA、难辨梭菌、碳氢霉烯耐药肠杆菌、甲流/乙流、B族链球菌、肠病毒脑膜炎、沙眼衣原体/淋病奈瑟菌、HPV、凝血二因子及五因子、BCR-ABL等，满足患者从常规传染病到癌症基因检测的各个领域。包括取样、加样、检测三个步骤，手工操作时间不超过1分钟，但检测时间根据检测项目不同最少需要20min，最高则需要120分钟。设备价格在5k-17k美元，17-35美元/test。Cepheid的GeneXpert在欧美和中国已经建立起比较强的竞争优势，并且背靠丹纳赫这棵大树，不容小视。 2. Roche Cobas Liat平台 该平台将qPCR和气压式微流控技术相融合，采用非传统的微流控芯片结构，通过温控进行PCR扩增，全自动触摸屏导引操作。检测项目主要有甲流/乙流，甲流/乙流和呼吸道合胞病毒，A组链球菌。需要加样、扫描和开始3步操作，20分钟出结果。设备价格大约20k 美元，约30美元/test。该平台原本由IQuum 研发，2014年4月，IQuum 被罗氏以4.5亿美元收购。

分子诊断知识点

分子诊断知识点

1、基因（gene）是含有生物信息的DNA 功能片段，根据这些生物信息可以编码具有生物功能的产物，包括RNA 和蛋白质（多数）. 2、基因组genome, 指细胞或生物体一套完整的遗传物质，包括所有基因和基因间的区域（序列）。 3、基因组学genomics 以基因组为研究对象的一门学科，包括基因组作图、基因组测序、基因定位、基因功能分析 4、结构基因：编码RNA 或蛋白质的核苷酸序列 5、基因表达：DNA 携带遗传信息通过转录传递给RNA，mRNA 通过翻译将基因的遗传信息在细胞内合成具有生物功能的各种蛋白质的过程 6、C 值基因组DNA 全部碱基（对）数。C 值是物种的一个重要特性常数。C 值矛盾，C 值悖论：生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象 7、N 值矛盾，N 值悖论：基因组中的基因数目与生物进化程度或复杂程度的不对称性 8、必需基因（致死基因）关系到生物体存活的

基因。可通过基因突变实验确定必需基因。：9、原核生物基因组1、细菌、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体、放线菌、蓝绿藻等 10、重叠基因:是指两个或两个以上的基因共有一段DNA 序列，或是指一段DNA 序列为两个或两个以上基因的组成部分。 11、操纵子：由一组功能相关的结构基因连同其上游调控序列共同组成一个转录单位 12、质粒的分类致育质粒F 质粒）编码性菌毛，介导细菌之间的接合传递；耐药性质粒R 质粒）编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性；毒力质粒Vi 质粒）编码与该菌致病性有关的毒力因子；细菌素质粒编码细菌产生细菌素；代谢质粒编码产生相关的代谢酶。 13、严紧控制型拷贝数少，一般<10 个，分子量大；调节因子是蛋白质，复制受限，受染色体DNA 复制系统的控制；严谨控制机理（低拷贝原因），认为是该质粒可以产生阻遏蛋白，反馈抑制自身DNA 合成。松弛控制型拷贝数多，10-200 个，分子量小；调节因子是RNA，复制不受染色体DNA 复制系统限制基因工程使用松弛型（高拷贝数）质粒，以获得较多的

第五节 病毒病的实验室诊断方法.

第二章病毒 第五节病毒病的实验室诊断方法 畜禽病毒性传染病是危害最严重的一类疫病，给畜牧业带来的经济损失最大。除少数如绵羊痘等可根据临床症状、流行病学、病变作出诊断外，大多数病毒性传染病的确诊，必须在临床诊断的基础上进行实验室诊断，以确定病毒的存在或检出特异性抗体。病毒病的实验室诊断和细菌病的实验室诊断一样，都需要在正确采集病料的基础上进行，常用的诊断方法有：包涵体检查、病毒的分离培养、病毒的血清学试验、动物接种试验、分子生物学的方法等。 一、病料的采集、保存和运送 病毒病病料采集的原则、方法以及保存运送的方法与细菌病病料的采集、保存和运送方法基本是一致的，不同的是病毒材料的保存除可冷冻外，还可放在50%甘油磷酸盐缓冲液中保存，液体病料采集后可直接加入一定量的青、链霉素或其他抗生素以防细菌和霉菌的污染。 二、包涵体检查 有些病毒能在易感细胞中形成包涵体。将被检材料直接制成涂片、组织切片或冰冻切片，经特殊染色后，用普通光学显微镜检查。这种方法对能形成包涵体的病毒性传染病，具有重要的诊断意义。但包涵体的形成有个过程，出现率也不是100%，所以，在包涵体检查时应注意。（能出现包涵体的重要畜禽病毒见表2-3） 表2-3 能产生包涵体的畜禽常见病毒 病毒名称感染范围包涵体类型及部位 痘病毒类 狂犬病病毒 伪狂犬病病毒 副流感病毒III型 马鼻肺炎病毒 鸡新城疫病毒 传染性喉气管炎病毒人、马、牛、羊、猪、鸡等 狼、马、牛、猪、人、猫、羊、 禽等 犬、猫、猪、牛、羊等 牛、马、人 马属动物 鸡 鸡 嗜酸性，胞浆内，见于皮肤的棘层细胞中 嗜酸性，胞浆内，见于神经原内及视网膜的神经节 层的细胞中 嗜酸性，核内，见于脑、脊椎旁神经节的神经原中 嗜酸性，胞浆及胞核内均有，见于支气管炎、肺泡 上皮细胞及肺的间隔细胞中 嗜酸性，核内，见于支气管及肺泡上皮细胞、肺间 隔细胞、肝细胞、淋巴结的网状细胞等 嗜酸性，胞浆内，见于支气管上皮细胞中 嗜酸性，核内，见于上呼吸道的上皮细胞中 三、病毒的分离培养 将采集的病料接种动物、禽胚或组织细胞，可进行病毒的分离培养。供接种或培养的病料应作除菌处理。除菌方法有滤器除菌、高速离心除菌和用抗生素处理三种。如用口蹄疫的水疱皮病料进行病毒分离培养时，将送检的水疱皮置平皿内，以灭菌的pH7.6磷酸盐缓冲液洗涤数次，并用灭菌滤纸吸干、称重，剪碎、研磨制成1∶5悬液，为防止细菌污染，每毫升加青霉素1000IU，链霉素1000μg，置2～4℃冰箱内4～6h，然后用8000～10000r/min速度离心沉淀30min，

分子诊断

SYBRgreen法定量PCR的原理： 基因芯片的原理： 杠氏肌营养不良的多重PCR诊断的原理： 核酸分子杂交技术的原理：具有互补序列的异源核酸单链在一定条件下通过碱基配对原则形成杂合双链的过程 荧光阈值：同一样本在多次扩增过程中达到某 一荧光强度值时所需循环次数是一样的，这一荧光强度值为荧光阈值 ct值（阈值循环数）：达到荧光阈值时的循环次数 扩增曲线： 癌基因：一类能够引起细胞恶性转化的基因 原癌基因：细胞癌基因在正常情况下以非激活的形式存在的基因 抑癌基因：抑制细胞生长并且具有潜在抑癌作用的基因 PCR技术：利用针对目的基因所设计的一对特异性寡核苷酸引物，以目的基因为模板，在体外合成DNA片段 内含子：基因中不编码的序列 外显子：基因中编码的序列，与mRNA的序列相对应 转座因子：能在基因组中从一个位点移至另一位点的DNA序列 多基因家族：一些有编码功能的重复序列 单核苷酸多态性：单个核苷酸变异而形成的FNA分子多态 病毒基因组：由一种核酸组成，包括4种类型，双链DNA单链DNA双链RNA单链RNA 单核苷酸多态性：单个核苷酸变异而形成的FNA分子多态 病毒基因组：由一种核酸组成，包括4种类型，双链DNA单链DNA双链RNA单链RNA 重叠基因：两个或两个以上基因的开放阅读框共有一段DNA序列，既某段DNA序列成为两个或两个以上共有的组成部分 基因表达：受内外因素的影响，在复杂的调控机制控制下，多数基因经历激活转录和翻译等过程，产生具有特异生物学功能的蛋白质或RNA，赋予细胞或生物体特定功能或表型 组成性表达基本表达：某些资源对环境因素不敏感，在一个生物体几乎所有细胞中表达相对恒定，且持续表达 循环核酸游离循环核酸：一种存在于人体液中的细胞外游离状态的核酸，包括游离循环DNA 和游离循环RNA 熔解温度：在热变性过程中，使被测DNA分子双链解开50％所需温度 原核生物的转座因子 ①插入序列②转座子③可转移性噬菌体 基因组DNA序列分为4类 ①单一序列②轻度重复序列③重度重复序列④高度重复序列 线粒体基因组与核基因组相比自身的特点 ①母系遗传②线粒体DNA损伤后不易修复③遗传密码与通用遗传密码有区别 基因突变和基因多态的区别 通常DNA分子中某一特定位点的变异频率低于1％认为基因突变，高于1％则为DNA分子多态，基因多态是基因组多样性的分子机制 PCR原理或PCR反应过程 变性-退火-延伸，扩增效率达100%

分子诊断检测项目介绍-分子诊断检测项目介绍

分子诊断检测项目介绍-分子诊断检测项目介绍前言 天津万盖得门诊部是一家由海外归国人员为主体创办的股份制民营医疗机构, 以引进、开发和推广新的医学检验技术为要紧经营内容。万盖得三字来自英语“V anguard”的音译，其意译为前哨或尖兵的意思，这表明了创办者“敢为天下人先”的意愿。期望能够凭借自身的知识、技术、信息和观念优势，为国内医学检验方面的技术进步以及医疗体制的改革做出奉献。万盖得将以严肃、严谨和科学的态度开展各项业务，为医院和社区提供高质量的医疗和检验服务。 分子诊断是我们第一开展的实验诊断服务，这是一个全新的、被称之为实验诊断一场革命的领域，因为分子技术的临床应用差不多使专门多用常规技术全然无法检测的病理变化能够被精确的测到。我们第一开展的用细胞DNA定量分析系统进行肿瘤的早期诊断，处于世界领先地位，这项技术已使脱落细胞的检查成为一项客观、准确、自动化和高通量的肿瘤筛查和早期诊断的技术平台。我们自主开发的多重PCR检测性病病原、病毒和难以培养的细菌性病原，将给感染性疾病的诊断和治疗带来新的突破性进展。在医疗服务方面，我们打算引入发达国家中行之有效的家庭大夫服务模式，为中等收入以上的家庭和个人提供个体化和优质的医疗和保健服务，引导我们的服务对象建立起防病重于治病的观念，主动地提升自身的保健意识。与同等规模的医疗机构，保持一种即竞争又合作的新型关系。与大型综合医院和专科医院，我们期望能建立起互补和互利的协作关系。我们相信，万盖得在各级领导和医务界同仁的关怀和支持下，定能进展壮大。 万盖得首席科技顾咨询 临床微生物学博士 吴尚为 2006年元月

分子诊断名目 细胞分子生物学检测 细胞DNA定量分析系统简介 细胞DNA定量分析的差不多原理 细胞DNA定量分析的临床应用价值 不同DNA指数（DI）在宫颈癌普查中的临床意义 宫颈癌和宫颈癌的早期诊断 宫颈癌筛查和常规宫颈细胞学检查 宫颈细胞学检查的方法 宫颈细胞DNA定量分析 细胞DNA定量分析的其他用途 核酸检测技术 差不多概念 多聚酶链反应-PCR 人类乳头状瘤病毒的检测 人类乳头状瘤病毒 人类乳头状瘤病毒与宫颈癌 人类乳头状瘤病毒对宫颈癌的“预警”作用 万盖得宫颈癌筛查—预警—监测和早期诊断系统宫颈标本采集、送检注意事项 慢性生殖道感染和性传播疾病病原的检测 慢性生殖道感染和性传播疾病 引起慢性生殖道感染和性传播疾病的常见病原

分子诊断名词解释

分子诊断学：是临床检验诊断学的一个重要分支，它利用分子生物学技术来研究机体外源性和内源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的改变，从而为疾病的预测、预防和转归提供分子生物水平信息。 开放阅读框ORF：始于密码子并终于终止密码子的一串密码子组成的核苷酸序列。 密码子偏爱codon bias:在不同物种的基因中经常为某种氨基酸编码的只是其中的某一特定的密码子，这种现象叫做密码子偏爱。 基因组学genomics：对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能的一门科学。 C值矛盾：生物的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象。 基因组:细胞或非细胞生物体的一套完整的单倍体遗传物质的总和称为基因组（genome） 基因(gene):是基因组中一个功能性遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列 质粒:独立于细菌细胞染色体以外，能自主复制的共价闭合环状DNA（cccDNA）分子，称为质粒(plasmid) 转化transformation:指受体菌直接吸收来自周围环境游离的DNA片段，通过同源组将其整合到自身的基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象。 转导transduction：以噬菌体为媒介把细菌的基因从一个细菌细胞转移到了另一个细菌细胞的过程。分普遍性传导和局限性转导。 转座transposition:由插入序列和转座子介导的基因移位或重排成为转座。 外显子与内含子：断裂基因的内部非编码序列成为内含子intron,编码序列成为外显子exom 单拷贝基因：基因组中仅出现一次的基因称单拷贝基因，多为编码蛋白质的结构基因。 微卫星DNA：存在于常染色体由2~6个核苷酸的重复序列组成，又称为简单串联重复序列STR。以(CA)n、(GT)n、(CAG)n较常见，重复次数多为15~60次，总长度一般在400bp以下。 假基因pseudogene:基因家族中一类与具正常功能的基因序列相似，但无转录功能或转录产物无功能的基因称为假基因。 断裂基因：细胞内结构基因并非完全有编码序列组成。而是在编码序列中插入非编码序列，这类基因被称为断裂基因。 端粒酶telomere:一种由蛋白质和RNA两部分组成的以自身的RNA为模板，可合成端粒重复序列而延长端粒的特殊转录基因。 遗传图（genetic map）：又称连锁图（linkage map),是以具有遗传多态性的遗传标记作为“位标”，遗传学距离为“图距”的基因组图。 物理图（physical map)：是以一段已知核苷酸序列的DNA片段为“位标”，以DNA实际长度（Mb或kb)作为图距的基因组图，用于确定遗传标志之间的物理距离。 单核苷酸多态性STR：因单个碱基的变异（主要是置换，也有缺失和插入）引起的DNA序列多态性，在特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中最少一种在群体中的频率不少于1% 基因组家族gene family:一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因，可能由某一共同祖先基因经重复和突变长生，这一组基因就称为基因家族 重叠基因overlapping:许多病毒基因组的一段DNA序列有两个或两个以上的ORF，可以编码两种甚至三种以上的多肽链，成为重叠基因 分段基因组segmented genome病毒基因组由数条不同的核酸分子组成。分段基因组多见于正链RNA病毒、负链RNA病毒与双链RNA病毒

分子诊断检测项目介绍分子诊断检测项目介绍

分子诊断检测项目介绍 前言 天津万盖得门诊部是一家由海外归国人员为主体创办的股份制民营医疗机构, 以引进、开发和推广新的医学检验技术为主要经营内容。万盖得三字来自英语“Vanguard”的音译，其意译为前哨或尖兵的意思，这表明了创办者“敢为天下人先”的意愿。希望能够凭借自身的知识、技术、信息和观念优势，为国内医学检验方面的技术进步以及医疗体制的改革做出贡献。万盖得将以严肃、严谨和科学的态度开展各项业务，为医院和社区提供高质量的医疗和检验服务。 分子诊断是我们首先开展的实验诊断服务，这是一个全新的、被称之为实验诊断一场革命的领域，因为分子技术的临床应用已经使很多用常规技术根本无法检测的病理变化可以被精确的测到。我们首先开展的用细胞DNA定量分析系统进行肿瘤的早期诊断，处于世界领先地位，这项技术已使脱落细胞的检查成为一项客观、准确、自动化和高通量的肿瘤筛查和早期诊断的技术平台。我们自主开发的多重PCR检测性病病原、病毒和难以培养的细菌性病原，将给感染性疾病的诊断和治疗带来新的突破性进展。在医疗服务方面，我们计划引入发达国家中行之有效的家庭医生服务模式，为中等收入以上的家庭和个人提供个体化和优质的医疗和保健服务，引导我们的服务对象建立起防病重于治病的观念，主动地提高自身的保健意识。与同等规模的医疗机构，保持一种即竞争又合作的新型关系。与大型综合医院和专科医院，我们希望能建立起互补和互利的协作关系。我们相信，万盖得在各级领导和医务界同仁的关怀和支持下，定能发展壮大。 万盖得首席科技顾问 临床微生物学博士 吴尚为 2006年元月

分子诊断目录 细胞分子生物学检测 细胞DNA定量分析系统简介 细胞DNA定量分析的基本原理 细胞DNA定量分析的临床应用价值 不同DNA指数（DI）在宫颈癌普查中的临床意义 宫颈癌和宫颈癌的早期诊断 宫颈癌筛查和常规宫颈细胞学检查 宫颈细胞学检查的方法 宫颈细胞DNA定量分析 细胞DNA定量分析的其他用途 核酸检测技术 基本概念 多聚酶链反应-PCR 人类乳头状瘤病毒的检测 人类乳头状瘤病毒 人类乳头状瘤病毒与宫颈癌 人类乳头状瘤病毒对宫颈癌的“预警”作用 万盖得宫颈癌筛查—预警—监测和早期诊断系统 宫颈标本采集、送检注意事项 慢性生殖道感染和性传播疾病病原的检测 慢性生殖道感染和性传播疾病 引起慢性生殖道感染和性传播疾病的常见病原 诊断困难造成对发病率统计的困难 实验检测方法及优、缺点 分子扩增技术的应用促进了对性病的了解 PCR已成为检测性病病原的金标准 万盖得多重PCR检测性病病原

2017年初级检验技师《微生物检验》练习题第27章病毒感染的实验诊断

2017年初级检验技师《微生物检验》练习题第27章病毒感染的实验诊断

2017 第二十七章病毒感染的实验诊断 一、A1 1、关于病毒的描述正确的是 A、原核细胞型微生物 B、非细胞型微生物 C、真核细胞微生物 D、较大微生物 E、以二分裂方式繁殖的微生物 2、包涵体检查在下列哪种病毒感染中有重要意义 A、流感病毒 B、巨细胞病毒 C、呼吸道合胞病毒 D、EB病毒 E、副流感病毒 3、病毒标本长期保存应置于 A、4℃ B、0℃ C、-20℃ D、-70℃ E、-196℃

4、用于分离培养病毒的标本冻存时加入的保护剂为 A、叠氮钠 B、硝酸甘油 C、二甲基亚砜 D、对氨基苯甲醛 E、丁二酮 5、用于分离柯萨奇病毒常接种下列哪种动物 A、小鼠 B、乳鼠 C、家兔 D、豚鼠 E、猴 6、下列实验室方法中哪种可确诊获得性免疫缺陷综合征（艾滋病） A、动物接种 B、免疫荧光法 C、酶免疫测定法 D、凝集试验 E、免疫印迹试验 7、引起婴幼儿急性胃肠炎的主要病原体是 A、新肠道病毒

B、志贺菌 C、Norwalk病毒 D、轮状病毒 E、大肠埃希菌 8、从流感病人的咽漱液中分离流感病毒，最好接种于 A、人胚羊膜细胞 B、小鼠腹腔 C、鸡胚羊膜腔 D、鸡胚尿囊腔 E、鸡胚卵黄囊 9、易在鸡胚尿囊腔中生长的病毒为 A、流感病毒 B、流行性乙型脑炎病毒 C、呼吸道合胞病毒 D、疱疹病毒 E、腺病毒 10、病毒的特征是 A、个体极小 B、没有细胞结构 C、专性细胞内寄生 D、以复制方式增殖

E、以上均是 11、病毒的核心是 A、核酸 B、蛋白质 C、多肽 D、脂类 E、糖蛋白 12、病毒在细胞内的增殖过程不包括下列哪一个 A、吸附与侵入 B、脱壳 C、病毒成分的合成及装配 D、释放 E、二分裂 13、病毒的衣壳是指 A、核酸 B、核酸外围的蛋白质 C、核酸外围的多肽 D、核酸外围的糖蛋白 E、核酸外围的脂类 14、甲型肝炎病程中传染性最强的阶段是 A、潜伏期

EB病毒感染的实验室指标

EB病毒感染的实验室指标 2016-03-08 EBNA二聚体带状模型 EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）属于4型疱疹病毒，类似其他疱疹病毒科的病毒，EBV感染包括增殖性感染（或称活动性感染）和潜伏感染两种状态，EBV感染人淋巴细胞和上皮细胞，初次感染后病毒可长期在人上呼吸道上皮细胞或淋巴组织中潜伏，潜伏感染和终生携带是EBV感染的重要特征。人群对EBV普遍易感，大多数人初次感染发生在儿童或青少年时期并可终生携带，在中国，8岁以上人群90％以上血清学阳性。 传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis，IM）是典型的EBV初次感染表现；值得注意的是在免疫抑制（如器官移植）、遗传缺陷（如X连锁淋巴组织增生）或潜伏感染的反复激活的情况下，EBV感染可能导致不良预后，如发展成为慢性活动性EB病毒感染（CAEBV）和EBV相关的噬血性淋巴组织增生（EBV-HLH）。另外EBV还与儿童及成人的淋巴瘤等多种肿瘤发病有关。因而及时准确的实验室诊断有助于临床对EBV 感染的时相、机体状况和发生不良转归的风险进行评估，这对于儿童EBV感染性疾病的诊断及预后至关重要。 EBV-DNA阳性是EBV存在的直接证据。由于潜伏感染的存在，正常人外周血单个核细胞中也常有低载量的EBV-DNA检出（通常低于200拷贝数／m1）。在活动感染发生时EBV 在人淋巴细胞中大量增殖（IM患者一般可达103～105拷贝数／m1）并释放到血浆或淋巴液中。随着感染的控制，EBV感染进入潜伏状态，血浆或淋巴液中的病毒颗粒迅速消失，而外周血淋巴细胞中的EBV仍将以潜伏状态保持较高滴度数月～1年。对于复发性感染外周血EBV-DNA载量会更高，CAEBV可达105～106拷贝数／ml甚至更高，EBV-HLH一般在104～106拷贝数／ml之间。由于不同感染状态下病毒的状态和分布不同，EBV-DNA测定结果的解释因标本来源的不同而有不同。 1．全血：淋巴细胞是EBV感染的靶细胞，淋巴细胞中潜伏期EBV的存在和活动感染后长达数月的持续阳性使得该检测结果不能反映现症感染，也不适合急性感染如IM的诊断。因此外周血单个核细胞EBV-DNA定量测定更适合复发感染如CAEBV、EBV-HLH或移植相关EBV感染的诊断和检测。本方法的一个缺陷在于单个核细胞分离步骤繁琐，自动化程度低，定量结果受单个核细胞的分离效率影响较大。为解决这一问题，有研究者使用吸附法抽提全血DNA进行定量，现有大量商品化的抽提系统可供使用，抽提步骤自动化程度大大提高，且定量结果与分离单个核细胞的测定结果具有良好的相关性。 2．血浆或血清：血浆中的EBV-DNA来自活动感染期由感染淋巴细胞中释放的病毒颗粒，感染被控制后血液中游离的病毒颗粒和EBV-DNA又被免疫系统迅速廓清。因此血浆或血清中的EBV-DNA只有活动期感染时为阳性，恢复期和潜伏感染为阴性，这使得血浆EBV-DNA成为一个很好反映活动感染的指标，在IM、EBV-HLH和淋巴瘤等急慢性活动感染患者的血浆中均可检出，而潜伏感染者多为阴性。

乙型肝炎病毒感染分子诊断的研究进展

综述 收稿日期 2009-01-18; 修回日期 2009-07-10 作者简介 李艳艳(1977-),女,籍贯内蒙古赤峰,检验技师,研究方向,临床免疫。 乙型肝炎病毒感染分子诊断的研究进展 Research progress in the hepatitis B virus infection with molecular diagnosis 李艳艳,薛凤凤综述,孟祥红审校 (解放军总医院第二附属医院检验科,北京100091) 关键词:乙型肝炎病毒;DNA 检测;临床应用 文章编号 1008-5041(2009)10-0900-04 中图分类号 R512 6 文献标识码 B 乙型肝炎病毒(HBV )感染是一个严重的全球问题,据估计全球大约有20亿人曾经感染乙肝病毒,慢性HBV 感染者约3 5亿~4亿人,每年有50万~120万人死于HBV 感染。我国是乙型肝炎的高发区,每年约有10%~20%的急性乙肝将转成慢性肝炎,肝硬化甚至发展成肝癌,严重威胁着人们的健康,急性乙肝的慢性化及慢性肝炎癌变的发生机制是多年来肝病研究的重点。1 HBV 的分子生物学特性 HBV 的基因组是已知DNA 病毒中最小的,仅含3200bp,组成独特的带有部分单链区的双链DN A 环状模式。长链为负链,几乎形成完整的环,其5 末端有蛋白与之共价相连。短链为正链,长度因毒株的不同而变化较大,其5 末端有一段戴帽的寡核苷酸与之相连。因此长链与短链的5 端均不能被多聚核苷酸酶磷酸化。长链和短链的5 端的位置是固定的,短链可长可短。尽管短链的3 端 长度有不同,但通过正、负链的5 端的粘性末端互补,使HBV 基因组DNA 形成部分环形结构。在正、负链的5 端 的互补区的两侧各有由11个核苷酸构成的同向重复,分别称为DR1和DR2,其中DR1在负链的5 端,DR2在正链的5 端。 HBV 基因组非常独特,正链及负链DNA 可分别编码,所有顺式调控序列均位于编码区内,无内含子。HBV DNA 长链含有分别编码结构蛋白(pre -S 、S 和核心蛋白)以及复制蛋白(聚合酶和X 蛋白)的4个ORF ,编码区有广泛的重叠以充分扩大其编码容量。HBV 基因组高度压缩,重复利用,使有限基因得到充分的利用。这种基因组的结构特点在其他生物极为罕见。 目前根据乙型肝炎病毒HBV 全核苷酸序列的差异,可将HBV 分为A 、B 、C 、D 、E 、F 、G 、H8个基因型,基因型反映了HBV 自然感染过程中的变异特点,是病毒变异进化的结果。近年研究表明,HBV 基因型对HBV 感染者自然病程,疾病严重程度,HBV e 抗原(HBeAg )血清转换率,前C 区/C 变异以及抗病毒疗效均有一定影响。2 HBV D NA 检测 HBV 感染的病原学诊断目前主要依靠免疫血清学检测HBV 的血清学标志物和分子生物学方法检测HBV 核酸。免疫学方法测定病毒抗体是一种快速简便的检测手段,常用的方法是间接EL ISA,目前我国HBV 检测采用的第三代EL ISA 试剂由多种病毒抗原组合匹配,具有较好的灵敏性和特异性,但其在病毒感染的窗口期不能检测到抗体,这在很大程度上限制了EL ISA 检测的准确性,不能有效的控制病毒的传播,因而,发展新的诊断HBV 感染主要依赖分子生物学技术对病毒DNA 的检测。2 1 PCR 基因分型法 [1] 是一种在临床上准确、快速、简便地对乙型肝炎病毒进行基本分型(BCD )的方法,该方法通过大量分析已分型的HBV 基因组序列,寻找出HBV 各基因型的型特异性硷基的分布规律,设计型特异性的引物和探针,利用已知全序列HBV 建立荧光PCR 的基因分型方法,结果显示其与基因组分型完全一致,利用大量随机临床标本摸索的最佳反应条件为94 ,1min;94 ,10s;60 ,30s,40个循环。与PCR-RF LP 相比,分型结果一致性在84 0%;与S 基因测序分型相比,一致性为96 2%。荧光PCR 是目前最灵敏的检测方法之一,检测极限可达到100copise/ml 的DNA 浓度,以常规PCR 为基础的分型方法常常需要进行2次PCR 。荧光P CR 分型实验仅需要DN A 抽取和1次荧光PCR 就可以了,免除第2次P CR 、杂交、洗涤、显色等传统方法的诸多步骤。利用荧光PCR 法检测HBV 基因