等电聚焦平板电泳法

附录V F 电泳法

第六法等电聚焦水平板电泳法

两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的pH值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点（此处的pH值使相应的蛋白质不再带电荷）时，电流达到最小，不再移动。本法用于检测蛋白类和肽类供试品的等电点。

除另有规定外按以下方法测定。

1. 仪器装置恒压或恒流电源、带有冷却装置的水平电泳槽和制胶模具。

2. 试剂

（1）水（电阻率应不低于18MΩ·cm）

（2）A液称取丙烯酰胺5.0g，亚甲基双丙烯酰胺0.15g，加适量水溶解，并稀释至50ml，双层滤纸滤过，避光保存。

（3）B液10％过硫酸铵溶液，新鲜配制。

（4）甲基红试液称取5mg甲基红，溶于10mL 0.05mol/L 氢氧化钠中。

（5）50%甘油

（6）正极液0.5mol/L磷酸溶液

（7）负极液1mol/L 氢氧化钠溶液

3. 操作法

（1）制胶取A液2.5ml，pH3~10的两性电解质（或其它pH范围的两性电解质）0.35ml，水1.25ml，50%甘油0.5ml，抽气5~10分钟，加B液25μl，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺6μl，混匀后缓慢的注入水平模具内，室温下聚合。

（2）预电泳将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放到冷却板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免气泡的产生。用正极液与负极液分别润湿正极与负极电极条，然后分别放于阳极与阴极上，将电极对准电极条中心，加盖，在恒压法下进行测定，在起始电压200V 下预电泳30分钟。

（3）对照品溶液和供试品溶液的制备将供试品对水透析（或用其它方法）脱盐，并将蛋白或多肽含量调节至0.5~5mg/ml （如供试品蛋白或多肽浓度太低，则需采用适当方法浓缩）。对照品溶液同供试品溶液制备。

（4）电泳将加样滤纸条以一定间隔置于凝胶上，加入供试品、对照品及等电点标准溶液5~20μl。选择恒压方式进行电泳，起始电压为200V。电泳0.5~1小时待甲基红迁出加样条后，去除加样条。调高电压至400V，电泳至电流不再变化，再调高电压至600V，待电流不再变化时停止电泳。

4. 固定和染色

（1）试剂

a. 固定液20％三氯醋酸

b. 染色液i) 染色储备液称取1.0gG-250，溶于20ml水中，

为溶液1；称取125g（NH4）2SO4，溶于400ml水中，为溶液2；称取20g H3PO4，为溶液3；将溶液3加入到溶液1中，待G-250完全溶解后，与溶液2混合，并加水至1L，混匀后即得，用前应充分混合。

ii) 工作染色液取60ml染色储备液，与30ml甲醇混匀，新鲜配制。

c. 脱色液蒸馏水

（2）固定与染色电泳完毕后，取出胶片，置于固定液中固定20分钟以上，取出胶片，置染色液中3小时，用脱色液脱色至背景透明后取出晾干，亦可做成干胶永久保存。

5. 结果判断

将胶片置凝胶电泳扫描仪中扫描，通过扫描定位法测量蛋白质或多肽与等电点标准的迁移距离。

（1）鉴别供试品主成分迁移位置应与对照品迁移位置一致。

（2）等电点以等电点标准试剂中各种蛋白的等电点（p I）对其相应的迁移距离直线回归作图；将供试品的迁移距离代入直线回归方程，求出供试品的等电点。

07 实验七 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法

实验七. 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法 【实验目的】 1.掌握聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的基本原理 2.学习用等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作和方法 【实验原理】 等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体-Ampholine，从而使凝胶柱上产生pH梯度。当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。 蛋白质为两性电解质，其所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，则聚焦形成一条蛋白质区带。这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。 利用这种方法，在蛋白质聚焦的相应位置测定凝胶的pH值，就可得知该蛋白质的等电点。 【实验材料】 1.实验器材 小玻璃管：内径0.5cm，长10cm 2支；小玻管架；圆盘电泳槽；注射器和长针头；移液管；pH计 2.实验试剂 (1) 两性电解质载体凝胶：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉双丙烯酰胺0.1g，pH3一10的Ampholine 2.5ml，核黄素溶液（4mg/100ml）12.5ml，加水至50ml。 (2) 蛋白质溶液：纯牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸馏水。此蛋白溶液应无盐离子。 (3) 5％磷酸溶液 (4) 2％氢氧化钠溶液 (5) 考马斯亮蓝R-250染色液：称取考马斯亮蓝R-2500.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。 (6) 40%蔗糖溶液 (7) 12％三氯醋酸溶液 (8) 脱色液：乙醇:冰醋酸:蒸馏水= 25：10：65(v／v)。 【实验操作】 1. 取4ml两性电解质载体凝胶，置于抽气瓶中，加入0.07ml蛋白质溶液，轻轻摇动混匀，抽去气泡。 2. 取干净的小玻璃管2支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40％蔗糖溶液3—4滴，然后吸取抽气瓶中的两性电解质载体-蛋白质混合液1.8ml缓缓放入玻璃管中，加入胶液后立即用注射器加上一薄层水（3-5mm高），使混合液表面与空气隔绝。放置约0.5-1小时，观察凝胶的凝聚情况。 3. 管内凝胶凝聚后，用滤纸将顶端水吸去，小心拔去管底橡皮塞，让蔗糖溶液流出，并用少量蒸馏水清洗，然后将小玻璃管垂直放入圆盘电泳槽中。上槽加入5％磷酸溶液，接正极，下槽加入2% NaOH溶液，接负极，于150V条件下进行聚焦，过一段时间后（约2-3小时），电流稳定不变时（基本为零），说明聚焦完毕。 4. 聚焦结束后取出小玻璃管，迅速用蒸馏水将两端洗净。用一带长针头的注射器灌满蒸

毛细管电泳的基本原理及应用

毛细管电泳的基本原理及应用 摘要：毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，比HPLC 分析高效、快速、微量。 关键词：毛细管电泳原理分离模式应用 1概述 毛细管电泳(Caillary Electrophoresis)简称CE，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流场为驱动力的新型液相分离分析技术。CE的历史可以追溯到1967年瑞典Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis，CZE)。但他没有完全克服传统电泳的弊端[1]。现在所说的毛细管电泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支: 胶束电动毛细管色谱(MEKC)。1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年，Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作。近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。 毛细管电泳和高效液相色谱（HPLC）一样，同是液相分离技术，因此在很大程度上HPCE与HPLC可以互为补充，但是无论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了一定的优势毛细管电泳（C E）除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外，其仪器结构也比高效液相色谱（HPLC）简单。C E只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。 毛细管电泳具有分析速度快、分离效率高、试验成本低、消耗少、操作简便等特点，因此广泛应用于分子生物学、医学、药学、材料学以及与化学有关的化工、环保、食品、饮料等各个领域[2]。

等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点

等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点 【实验原理】 等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF． 【试剂与器材】 1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。 2．1％(V/V)TEMED溶液。 3．5g/L过硫酸铵称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。 4．40％两性电解质载体。 5．0．5mmol/L磷酸溶液量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。 6．0．5mmol/L NaOH溶液称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。 7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。 8．酸性乙醇脱色液乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。 9．血清样本血清无须稀释，但最好透析去除离子。 10．电泳仪选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。 11．电泳槽圆盘电泳槽及电泳玻管。 12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。 食品安全检测农药兽药残留土壤成分分析焦炭成分分析 【操作步骤】 1．凝胶制备取洁净干燥的电泳玻璃管2支，将管底用胶布封闭，垂直放置在电泳管架上。取一锥形瓶，分别加入凝胶贮存液2mL，两性电解质载体0．4mL，1％TEMED溶液2mL，人血清2μl，蒸馏水2．58mL，轻轻搅匀，注意勿带入气泡。立即用滴管将此凝胶溶液加入上述玻璃管中，直至距上端25px处为止，然后小心加入蒸馏水(3～5mm高)，注意保持凝胶表面平坦，以保证凝胶正常聚合。室温中静置1小时，让凝胶完全聚合。此时，凝胶浓度为3．8％，两性电解质载体含量为2％。 2．聚焦将聚合完毕的各凝胶管上端水层吸去，除去下端胶布。垂直插入圆盘电泳槽装置中。下槽加入0．5mmol/LNaOH溶液，接负极；上槽加入0．5mmol/L磷酸溶液，接正极。凝胶管上下端均不得产生气泡，如有气泡，可用针头或细玻棒驱除。打开电泳仪开关，调至100V处，待电压稳定后调至150~160V，电泳4小时可完成聚焦。 3．剥胶取下凝胶管，先用蒸馏水充分洗涤凝胶管两端，再用带长针头的注射器吸满 蒸馏水，将针头小心插入胶柱与管壁之间，边注水边缓慢旋转玻管，并将针头向前慢慢推进，靠水流压力和润滑力将玻管内壁与凝胶分开，然后用洗耳球在胶管一端轻轻加压，凝胶柱便缓缓从玻管中滑出，将其放在洁净的玻板上，在一端做上标记。 4．固定、染色将凝胶柱平放于玻板上，量取并记录其长度后立即浸入预热到60℃的lg/L考马斯亮蓝固定染色液中约30分钟，取出后用蒸馏水洗涤，再用酸性乙醇脱色液漂洗，洗去背景颜色。 凝胶柱经固定染色后其长度会发生变化，未经固定染色的凝胶柱长度与固定染色后凝胶柱长度之比为变形系数。量取并记录固定染色后凝胶柱的长度和蛋白质区带中心至正极端的距离，此距离乘以

IEF-PAGE聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法

【实验目的】 1.掌握聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的基本原理 2.学习用等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作和方法 【实验原理】 等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体-Ampholine，从而使凝胶柱上产生pH梯度。当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。 蛋白质为两性电解质，其所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，则聚焦形成一条蛋白质区带。这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。 利用这种方法，在蛋白质聚焦的相应位置测定凝胶的pH值，就可得知该蛋白质的等电点。 【实验材料】 1.实验器材 小玻璃管：内径0.5cm，长10cm 2支；小玻管架；圆盘电泳槽；注射器和长针头；移液管；pH计 2.实验试剂 (1) 两性电解质载体凝胶：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉双丙烯酰胺0.1g，pH3～10的Ampholine 2.5ml，核黄素溶液（4mg/100ml）12.5ml，加水至50ml。

(2) 蛋白质溶液：纯牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸馏水。此蛋白溶液应无盐离子。 (3) 5%磷酸溶液 (4) 2%氢氧化钠溶液 (5) 考马斯亮蓝R-250染色液：称取考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。 (6) 40%蔗糖溶液 (7) 12%三氯醋酸溶液 (8) 脱色液乙醇：冰醋酸：蒸馏水=25：10：65（v/v）。 【实验操作】 1. 取4ml两性电解质载体凝胶，置于抽气瓶中，加入0.07ml蛋白质溶液，轻轻摇动混匀，抽去气泡。 2. 取干净的小玻璃管2支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40%蔗糖溶液3～4滴，然后吸取抽气瓶中的两性电解质载体-蛋白质混合液1.8ml缓缓放入玻璃管中，加入胶液后立即用注射器加上一薄层水（3～5 mm高），使混合液表面与空气隔绝。放置约0.5～1小时，观察凝胶的凝聚情况。 3. 管内凝胶凝聚后，用滤纸将顶端水吸去，小心拔去管底橡皮塞，让蔗糖溶液流出，并用少量蒸馏水清洗，然后将小玻璃管垂直放入圆盘电泳槽中。上槽加入5%磷酸溶液，接正极，下槽加入2% NaOH溶液，接负极，于150V条件下进行聚焦，过一段时间后（约2～3小时），电流稳定不变时（基本为零），说明聚焦完毕。 4. 聚焦结束后取出小玻璃管，迅速用蒸馏水将两端洗净。用一带长针头的注射器灌满蒸馏水，并将针头紧贴玻璃管内壁插至凝胶和管壁之间，转动玻璃管，同时推动注射器，并使针头在管壁与凝胶间前进，注入蒸馏水，使凝胶胶条从玻璃管中脱出。

电泳的基本原理

电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析，但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。 电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间

实验五 等电聚焦测蛋白质等电点

实验五等电点聚焦测蛋白质等电点 Mangogola 等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要进展，其实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。IEF的关键是得到一定范围内的稳定pH梯度，即找到合适的两性载体。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧基的同系物和异构物的混合物，其氨基和羧基的比例不同，使pH和pI相异、相近。经过适当电泳时间后，两性电解质将依等电点递增的次序在支持物中从正极到负极彼此相互衔接，形成一平滑稳定的pH梯度。 蛋白质靠近正极在低于其pI的环境中带正电荷，向负极移动，反之则向相反方向移动，最终停在其pI处。聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离等电点分子因pH的改变而重新带上正或负电荷，从而又向pI迁移。最后测出蛋白质停留位置的pH即为该蛋白质的pH。 一．实验过程 1.圆柱体凝胶制备 用封口膜将玻管[D4×120mm]的一端封口，将玻管套上橡胶塞放置在支架上，加入凝胶至10cm处（注意摇动玻管，震出底部气泡），轻轻铺上一层双蒸水，放置聚合1h。 凝胶T=%，C=%，共4mL 30%Acr，%Bis 1mL 10%过硫酸铵 双蒸水 载体两性电解质 样品液（BSA-10mg/mL） 样品液（肌红蛋白-5mg/mL） TEMED 共作三支管，每管加胶液约 2.聚焦电泳 在电泳下槽注入%硫酸500mL，将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳上槽(注意塞紧所有孔，以防电极液下漏)，加入上槽溶液%乙醇胺约1000mL（注意排除凝胶下表面的气泡，凝胶上下表面都要接触电极液）。接上电源，正极接酸，负极接碱，恒压160V至电流为0，再继续通电20min。 3.蛋白质染色及等电点测定 用注射器向胶管注水取出胶条，测量胶体总长度及肌红蛋白距酸端（碱端）距离。将其中一胶条放在玻璃板上用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入装有2mL10mM的KCl溶液中，

毛细管电泳电化学发光联用技术及应用新进展

信阳师范学院 研究生课程论文 2014—2015学年第1学期 毛细管电泳电化学发光联用技术及应用新进展提交日期：2015 年 1 月 6 日研究生签名：

毛细管电泳电化学发光联用技术及应用新进展 姓名：学号：2 摘要：生命与健康是关系人类生活和可持续发展的永恒话题。为了检测食品中的有毒物质和人类身体内的有害物质，并达到快速检测和灵敏度高的目的，毛细管电泳(CE)和电化学发光(ECL)技术相结合的方法应运而生。这种方法充分利用了CE技术快速、灵敏、需样量少的优点及ECL线性范围宽和仪器简单的特点，使其在生命和医药等方面得到了广泛的应用。 关键词：毛细管电泳；电化学发光；生命；医药 引言 毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis，CE)也叫做高效毛细管电泳(HPCE)，是二十世纪八十年代问世的高效液相分离法之一[1]，是将经典的电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。它是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性(大小、电荷、等电点、极性、亲和行为、相分配特性等)为依据的液相微分离分析技术。与传统的分离分析方法相比，毛细管电泳显著特点是简单、高效、快速和微量。另外，毛细管电泳还有经济、清洁、易于自动化和环境污染小等优点。因此，毛细管电泳迅速发展为高效的分离和检测技术，广泛应用于物质的检测与分离。 电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)是指电极表面通过电子的转移形成激发态，电子从激发态返回基态而产生的发光过程[2]，由电极上施加的电压所引发和控制[3]，以电激发为驱动力，通过电化学反应产生光信号。因此，电化学发光兼有化学发光的特点，是一种可控性强，灵敏度高的检测方法。 将毛细管电泳和电化学发光技术联用，产生了毛细管电泳-电化学发光检测技术(CE-ECL)，该技术兼有CE微量、迅速、高效及ECL高选择性、高灵敏等特点。这些特点使CE-ECL检测技术在药物分析、生命分析等领域应用越来越广泛，在实际样品的分离和分析工作中也发挥着重要的作用。本文主要简述毛细管电泳-电化学发光联用技术在各个领域的应用进展。 1. 毛细管电泳-电化学发光联用技术

等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点

实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点 一、实验目的 了解等电聚焦的原理。通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。 二、实验原理 等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。 蛋白质分子是典型的两性电解质分子。它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。 两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。若不同的pH值的两性电解质的含量与pI值的分布越均匀，则pH梯度的线性就越好。对Ampholine两性电解质的要求是缓冲能力强，有良好的导电性，分子量要小，不干扰被分析的样品等。 在聚焦过程中和聚焦结束取消了外加电场后，如保持pH梯度的稳定是极为重要的。为了防止扩散，稳定pH梯度，就必须加入一种抗对流和扩散的支持介质，最常用的这种支持介质就是聚丙烯酰胺凝胶。当进行聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳时，凝胶柱内即产生pH梯度，当蛋白质样品电泳到凝胶柱内某一部位，而此部位的pH值正好等于该蛋白质的等电点时，该蛋白质即聚焦形成一条区带，只要测出此区带所处部位的pH值，即为其等电点。电泳时间越长，蛋白质聚焦的区带就越集中，越狭窄，因而提高了分辨率。这是等电聚焦的一大优点，不像一般的其他电泳，电泳时间过长则区带扩散。所以等电聚焦电泳法不仅可以测定等电点，而且能将不同等电点的混合的生物大分子进行分185

等电聚焦平板电泳法

附录V F 电泳法 第六法等电聚焦水平板电泳法 两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的pH值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点（此处的pH值使相应的蛋白质不再带电荷）时，电流达到最小，不再移动。本法用于检测蛋白类和肽类供试品的等电点。 除另有规定外按以下方法测定。 1. 仪器装置恒压或恒流电源、带有冷却装置的水平电泳槽和制胶模具。 2. 试剂 （1）水（电阻率应不低于18MΩ·cm） （2）A液称取丙烯酰胺5.0g，亚甲基双丙烯酰胺0.15g，加适量水溶解，并稀释至50ml，双层滤纸滤过，避光保存。 （3）B液10％过硫酸铵溶液，新鲜配制。 （4）甲基红试液称取5mg甲基红，溶于10mL 0.05mol/L 氢氧化钠中。 （5）50%甘油 （6）正极液0.5mol/L磷酸溶液 （7）负极液1mol/L 氢氧化钠溶液 3. 操作法

（1）制胶取A液2.5ml，pH3~10的两性电解质（或其它pH范围的两性电解质）0.35ml，水1.25ml，50%甘油0.5ml，抽气5~10分钟，加B液25μl，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺6μl，混匀后缓慢的注入水平模具内，室温下聚合。 （2）预电泳将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放到冷却板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免气泡的产生。用正极液与负极液分别润湿正极与负极电极条，然后分别放于阳极与阴极上，将电极对准电极条中心，加盖，在恒压法下进行测定，在起始电压200V 下预电泳30分钟。 （3）对照品溶液和供试品溶液的制备将供试品对水透析（或用其它方法）脱盐，并将蛋白或多肽含量调节至0.5~5mg/ml （如供试品蛋白或多肽浓度太低，则需采用适当方法浓缩）。对照品溶液同供试品溶液制备。 （4）电泳将加样滤纸条以一定间隔置于凝胶上，加入供试品、对照品及等电点标准溶液5~20μl。选择恒压方式进行电泳，起始电压为200V。电泳0.5~1小时待甲基红迁出加样条后，去除加样条。调高电压至400V，电泳至电流不再变化，再调高电压至600V，待电流不再变化时停止电泳。 4. 固定和染色 （1）试剂 a. 固定液20％三氯醋酸 b. 染色液i) 染色储备液称取1.0gG-250，溶于20ml水中，

电泳技术相关习题

电泳技术相关习题 一、名词解释 1．电泳：指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。2．蛋白质的等电点：当溶液的酸碱度处于某一特定pH值时，它将带有相同数量的正、负电荷（即净电荷为零），致使蛋白质分子在电场中不会移动，称此特定的pH值为该蛋白质的等电点。 3．电泳速度：在单位时间内，带电粒子在毛细管中定向移动的距离。 4．迁移率：带电粒子在单位电场强度下的移动速度，常用μ来表示。 5．迁移时间：毛细管中，带电粒子在电场作用下作定向移动的时间。 二、单项选择题 1 ．瑞典科学家A ．Tiselius 首先利用U 形管建立移界电泳法的时间是（） A ．1920 年 B ．1930 年 C ．1937 年 D ．1940 年 2 ．大多数蛋白质电泳用巴比妥或硼酸缓冲液的pH 值是（） A ．7.2 ～7.4 B ．7.4 ～7.6 C ．7.6 ～8.0 D ．8.2 ～8.8 3 ．下列有关电泳时溶液的离子强度的描述中，错误的是（） A ．溶液的离子强度对带电粒子的泳动有影响 B ．离子强度越高、电泳速度越快 C ．离子强度太低，缓冲液的电流下降 D ．离子强度太低，扩散现象严重，使分辨力明显降低 4 ．电泳时pH 值、颗粒所带的电荷和电泳速度的关系，下列描述中正确的是（） A ．pH 值离等电点越远，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越慢 B ．pH 值离等电点越近，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越快 C ．pH 值离等电点越远，颗粒所带的电荷越少，电泳速度也越快 D ．pH 值离等电点越远，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越快 5 ．一般来说，颗粒带净电荷量、直径和泳动速度的关系是（） A ．颗粒带净电荷量越大或其直径越小，在电场中的泳动速度就越快 B ．颗粒带净电荷量越小或其直径越小，在电场中的泳动速度就越快 C ．颗粒带净电荷量越大或其直径越大，在电场中的泳动速度就越快 D ．颗粒带净电荷量越大或其直径越小，在电场中的泳动速度就越慢 6 ．电泳时对支持物的一般要求除不溶于溶液、结构均一而稳定外，还应具备（） A ．导电、不带电荷、没有电渗、热传导度小、 B ．不导电、不带电荷、没有电渗、热传导度大 C ．不导电、带电荷、有电渗、热传导度大 D ．导电、不带电荷、有电渗、热传导度大 7 ．醋酸纤维素薄膜电泳的特点是（） A ．分离速度慢、电泳时间短、样品用量少 B ．分离速度快、电泳时间长、样品用量少 C ．分离速度快、电泳时间短、样品用量少 D ．分离速度快、电泳时间短、样品用量多 8 ．聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，其优点是（） A ．机械强度好、弹性小、无电渗作用、分辨率高

毛细管电泳及其应用

毛细管电泳及其应用 摘要：毛细管电泳技术(Capillary Electrophoresis, CE)，是近二十年来发展最为迅速的新型液相分离分析技术之一。CE实际上包含电泳、色谱及其相互交叉的内容，是继高效液相色谱之后的又一重大进展，具有分离效率高、简单、经济、快速和微量、自动化程度高等优点。毛细管电泳这些特点使其成为一种极为有效的分离技术，目前已是生命科学及其它学科中一种常用的分析手段，已广泛应用于蛋白质、氨基酸、无机离子、有机化合物等的分离分析。关键词：毛细管电泳，分离效率高，生命科学 引言 毛细管电泳是在传统电泳技术的基础上逐步发展起来的。电泳技术的出现可以追溯到100多年前[1]。1807-1809年，俄国物理学家F.F.Reuss首次发现黏土颗粒的电迁移现象，并开始研究带电粒子在电场中的电迁移行为，测定它们的迁移速度。起初电泳只是作为一种物理化学现象来研究。电泳真正意义上进入分析化学被视为一种重要意义的技术，是在瑞士化学家Tiselius[2]公布了移动界面电泳技术的细节之后。他首先将电泳现象成功的应用于人血清的分离，获得了多种血清蛋白，他制成第一台电泳仪，并进行自由溶液电泳。Tisedius对电泳技术的发展和应用所做的巨大贡献，使他获得了1948年诺贝尔化学奖。但是传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热。1967年Hjerten[3]最先使用慢速旋转的内径为3 mm的石英玻璃管进行自由溶波电泳，以UV进行检测，成功地分离了蛋白质、多肽、无机离子、有机离子等，Hjerten最早证明可以把高电场用于细内径的毛细管电泳，但他没有完全克服传统电泳的弊端。1974年Virtanen提出使用细毛细管提高分离效率，阐明电渗流就像泵一样可以驱动液体流过毛细管，并说明了使用更细内径的毛细管做毛细管电泳的特点。1979年Everaerts和Mikkers[4]使用内径为200μm聚四氟乙烯毛细管，提高了毛细管的分离效率，成功分离了16种有机酸。1981年Jorgenson和Luckas[5]发表了划时代的研究工作，采用内径为75μm 石英毛细管进行实验，采用高电场电迁移进样，以灵敏的荧光检测器进行检测，使丹酞化氨基酸高效、快速分离，首次获得理论塔板数高达4x105/m的柱效。Jorgenson和Lucas等人的开创性工作，使CE发生了根本性的变革，标志着CE从此跨入高效毛细管电泳时代。 1983年Hjerten[6]将毛细管的内壁填充聚丙烯酰胺凝胶并将其用于毛细管电泳分离，发展了毛细管凝胶电泳(CGE)。CGE具有极高的分辨本领。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，可用于蛋白质碎片的分离及DNA序列的快速分析。 1984年Terabe等[7]将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支—胶束电动毛细管色谱(MECC)。他首次将表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)加入缓冲液中，在溶液中形成离子胶束作假固定相，实现了中性离子的分离，目前，MEKC己成为应用非常广泛的电泳模式之一。1985年Hjerten[8]等把平板等电聚焦电泳过程转移到毛细管内进行，发展了等电聚焦毛细管电泳(CIEF)。他是将带有两性基团的样品、载体两性电解质、缓冲剂和辅助添加剂的混合物注入毛细管内[9]，当在毛细管两端加上直流电压时，载体两性电解质可以在管内形成一定范围的pH梯度，从而达到使复杂样品中各组分分离的目的。1987年，Karger等[10]对凝胶填充技术进行了改进，优化了CGE技术,极大提高了其分离效率并阐明了用小内径毛细管可进行毛细管凝胶电泳。同年Smith等[11]将毛细管通过电喷射接口与质谱相连，从而实现了质谱和毛细管电泳联用的检测法，毛细管电泳-电喷雾质谱联用技术以其高效及高准确性被广泛应用于很多领域。 毛细管电泳根据分离机理和介质不同，具有多种分离模式，每种模式的选择性不同。毛细管电泳现有以下六种经典分离模式：毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis, CZE)，CZE是毛细管电泳中应用最广泛的一种分离模式，CZE用以分析带电溶质，其分离机理是基

等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定

等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步 测定1 常灏，黄耀江，沈光涛 中央民族大学生命与环境科学学院，北京（100081） E-mail：haobio@https://www.wendangku.net/doc/198425954.html, 摘要：作为一种新型的速效局部止血药和工具酶，凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛，牛血浆是其重要的来源之一。等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤，测定其等电点后，再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品。本实验的目的是通过测定胰蛋白酶的等电点建立载体两性电解质等电聚焦电泳的方法，并以该方法结合SDS-PAGE测定牛凝血酶的等电点。经双向电泳后，SDS聚丙烯酰胺凝胶中出现了4个清晰的斑点，分别测定它们的分子量和等电点，其中一个斑点与牛凝血酶B链的分子量一致为32kDa，其等电点为5.19。 关键词：牛凝血酶，等电点，等电聚焦，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 引言 凝血酶（Thrombin，EC3.4.21.5）是一种丝氨酸蛋白水解酶，在血液凝固系统中起重要作用。它能催化溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，达到迅速止血的目的。[1][2]凝血酶在参与凝血作用的同时，对底物还具有高度的特异性，可以专一性地切割X-Arg-Gly或Gly-Arg-X序列中由精氨酸羧基参与形成的肽键。 [3] 由于凝血酶具有以上的特性，近年来使其成为一种新型的速效局部止血药，在临床上被广泛应用于消化道出血和外科手术止血。[1]此外，利用其作用的特异性，还可作为工具酶用来加工目的产物，在医学和生物学研究上的用途也很广泛。 现在，制备凝血酶的原料多为牛、猪和人的血浆。我国猪血的来源相当广泛，随着开发利用猪血的意识逐渐提高，有关猪凝血酶提取方法的文献报道也越来越多。目前，凝血酶的制备方法主要有柠檬酸钡吸附法、氢氧化镁吸附法和等电点沉淀法3种。[1]其中等电点沉淀法是最简单易行的分离方法，也是后续纯化工作的基础。凝血酶的等电点在5.0～5.5之间[1]，但物种之间是有差异的。已有报道显示，将猪血浆采用适宜的稀释度稀释后，用1%或2%冰醋酸调pH至5.0~5.3，可将猪凝血酶原粗制品沉淀出来。[2][4][5][6] 在我国，牛血的来源也是比较丰富的，因此从牛血中提取凝血酶也具有一定的社会意义。欲利用等电点沉淀法得到牛凝血酶的粗制品，需预先得知其等电点。虽然已有文献报道，将牛血浆稀释10倍后，用2%冰醋酸调pH至5.0~5.3，可沉淀出牛凝血酶原[7]，但其等电点的准确值在文献中尚未见报道。 随着系统生物学和蛋白质组学的迅速发展，作为其主要的研究手段之一的电泳，应用范围越来越广泛和普遍。等电聚焦（Isoelectric Focusing, IEF）电泳技术，凭借其高分辨率等优点，现已成为一种被广泛采用的蛋白质分析和制备技术。它不仅可以测定蛋白质的等电点，分离混合的蛋白质，而且与SDS-PAGE组成双向电泳后可大大提高分离蛋白质的能力。因此，可以采用双向电泳的方法（第一向：IEF，第二向：SDS-PAGE），测定牛凝血酶的等电点。根据凝胶过滤法的测定，牛凝血酶的相对分子质量为37 kDa，由两条多肽链通过一个二硫键相连，A链为5kD，B链为32kD。[2]这样就可以在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中确定牛凝血酶的条带，从IEF中得知其等电点。等电点测定后，使得采用等电点沉淀法获取牛凝血酶粗制品时纯度更高，有利于纯化操作和研究其功能，以及其它相关研究工作的进行。 2.等电聚焦基本原理 1本课题得到学校“211工程”基金资助。

SDS-PAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理

SDS－PAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS-PAGE电泳成功的关键是什么？ ①溶液中SDS单体的浓度 SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存在，能与蛋白质分子结合的是单体。为了保证蛋白质

与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1∶4或1∶3。②样品缓冲液的离子强度因为SDS结合到蛋白质上的量仅仅取决于平衡时SDS单体的浓度，不是总浓度，而只有在低离子强度的溶液中，SDS 单体才具有较高的平衡浓度。所以，SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10-100 mM。③二硫键是否完全被还原只有二硫键被完全还原以后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上从而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。Sample buffer 中的β-巯基乙醇的浓度常为4-5%，二硫苏糖醇的浓度常为2-3%。前者有挥发性，最好使用前加入。 SDS-PAGE缓冲液系统的选择，Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸盐或者其他？ 一般来说，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡是不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键的。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。如果要测定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸盐缓冲系统，对于分子质量小于15 kDa的蛋白样品，可以使用SDS-尿素系统，也可以采用Tris-tricine缓冲系统。 积层胶（或称浓缩胶）的作用原理？

第一向等电聚焦系统

第一向等电聚焦（IEF） 图示：Ettan IPGphor3等电聚焦仪器和Ettan IPGphor3控制软件双向电泳的第一向IEF电泳采用IPGphor，实验将变得很简单。IPGphor包括半导体温控系统(18°C-25°C)和程序化电源(8000V，1.5mA)。可采用普通型胶条槽一步完成胶条的水化、上样和电泳，大大减少操作步骤。IPGphor一次可进行12个胶条槽的电泳(7, 11, 13 ，18 ，24cm)，因采用高电压(8000V)，可缩短聚焦时间。最新推出的通用型杯上样胶条槽因采用可移动的上样杯和电极，适合任何长度的IPG 胶条，尤其适合极性等电点蛋白的分离。 1．IPG胶条的水化和电泳 （1）仪器：IPGphor （2）试剂：水化液（8M尿素，2%CHAPS，15mM DTT和0.5%IPG缓

冲液）：水化液需当天新鲜配制(可配成储液分装-20℃保存，但不可反复冻融，尿素溶液加热温度不能超过37°C，否则蛋白会发生氨甲酰化)。（3）实验步骤： 1）用样品溶解缓冲液(9M尿素，4%CHAPS，2%IPG缓冲液，40mM DTT，40mM Tris-base)溶解样品。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml(若浓度过高，可以加Lysis buffer稀释)，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。2）吸取适量(见表2.1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。 表2.1IPG胶条所需水化液体积 3）从酸性端（尖端）一侧剥去IPG胶条的保护膜，胶面朝下，先将IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中（酸性端抵住胶条槽底端），慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下IPG胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。 4）IPG胶条上覆盖适量（1.5mL）Immobiline DryStrip覆盖油（从两侧往中间加），盖上盖子。

网络版习题

第十六章临床电泳分析仪器 首页习题 习题名词解释选择题简答题 一、名词解释 1．电泳 2．蛋白质的等电点 3．迁移率 4．毛细管电泳技术 5．电渗 6．吸附作用 二、选择题 【A型题】在五个选项中选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。 1．瑞典科学家A．Tiselius首先利用U形管建立移界电泳法的时间是（） A．1920年 B．1930年 C．1937年 D．1940年 E．1948年 2．下列有关电泳时溶液的离子强度的描述中，错误的是（） A．溶液的离子强度对带电粒子的泳动有影响 B．离子强度越高，电泳速度越快 C．离子强度太低，缓冲液的电流下降 D．离子强度太低，扩散现象严重，使分辨力明显降低 E．离子强度太高，严重时可使琼脂板断裂而导致电泳中断 3．电泳时pH值、颗粒所带的电荷和电泳速度的关系，下列描述中正确的是（）A．pH值离等电点越远，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越慢 B．pH值离等电点越近，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越快 C．pH值离等电点越远，颗粒所带的电荷越少，电泳速度也越快 D．pH值离等电点越近，颗粒所带的电荷越少，电泳速度也越快

E．pH值离等电点越远，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越快 4．一般来说，颗粒带净电荷量、直径和泳动速度的关系是（） A．颗粒带净电荷量越大或其直径越小，在电场中的泳动速度就越快 B．颗粒带净电荷量越小或其直径越小，在电场中的泳动速度就越快 C．颗粒带净电荷量越大或其直径越大，在电场中的泳动速度就越快 D．颗粒带净电荷量越大或其直径越小，在电场中的泳动速度就越慢 E．颗粒带净电荷量越小或其直径越大，在电场中的泳动速度就越快 5．电泳时对支持物的一般要求除不溶于溶液、结构均一而稳定外，还应具备（）A．导电、不带电荷、没有电渗、热传导度小、 B．不导电、不带电荷、没有电渗、热传导度大 C．不导电、带电荷、有电渗、热传导度大 D．导电、不带电荷、有电渗、热传导度大 E．导电、带电荷、有电渗、热传导度小 6．醋酸纤维素薄膜电泳的特点是（） A．分离速度慢、电泳时间短、样品用量少 B．分离速度快、电泳时间长、样品用量少 C．分离速度快、电泳时间短、样品用量少 D．分离速度快、电泳时间短、样品用量多 E．分离速度慢、电泳时间长、样品用量少 7．20世纪60年代中期问世的等电聚焦电泳，是一种（） A．分离组分与电解质一起向前移动的同时进行分离的电泳技术 B．能够连续地在一块胶上分离数千种蛋白质的电泳技术 C．利用凝胶物质作支持物进行的电泳技术 D．利用有pH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术 E．用滤纸作为支持载体的电泳技术 8．双向凝胶电泳（二维电泳），最多可以分辨出的斑点数量是（） A．500～1000 B．1000～2000 C．2000～4000 D．4000～5000 E．5000～10 000 9．下述免疫电泳优点的描述中，错误的是（） A．加快了沉淀反应的速度 B．是将某些蛋白组分根据其带电荷的不同而分开，再与抗体起反应

毛细管电泳技术发展及应用前景

毛细管电泳技术发展及应用前景 毛细管电泳技术（Capillary Electrophoresis, CE）又称高效毛细管电泳（HPCE）或毛细管分离法（CESM），毛细管电泳方法虽新工艺，但历史悠久，它是在电泳技术的基础上发展的一种分离技术。电泳作为一种技术出现，已有近百年的历史，但真正被视为一种在生物化学中有重要意义的技术，是由1937年A. Tiselius 首先提出。传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热，1967年Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳（Capillary Zone Electro-phoresis, CZE）。但他没有完全克服传统电泳的弊端。现在所说的毛细管电泳技术（CE）是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支：胶束电动毛细管色谱（MEKC）。1987年Hjerten 等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年，Cohen发表了毛细管凝胶电泳的工作。近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。 当电泳从凝胶板上移到毛细管中以后，发生了奇迹般的变化：分析灵敏度提高到能检测一个碱基的变化，分离效率达百万理论塔片数；分析片段能大能小，小到分辨单个核苷酸的序列，大到分离Mb到DNA；分析时间由原来的以小时计算缩减到以分、秒计算。CE可以说是经典电泳技术与现代微柱分离技术完美结合的产物。它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。 毛细管电泳技术是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术，迅速发展于80年代中后期，它实际上包含电泳技术和色谱技术及其交叉内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使细胞分析，乃至单分子分析成为可能。是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，是近几年来分析化学中发展最为迅速的领域之一。 毛细管电泳技术的基本原理是根据在电场作用下离子迁移的速度不同而对组分进行分离和分析，以两个电解槽和与之相连的内径为20～100μm的毛细管为工具，毛细管电泳所用的石英毛细管柱，在 pH>3的情况下，其内表面带负电，和缓冲液接触时形成双电层，在高压电场的作用下，形成双电层一侧的缓冲液由于带正电荷而向负极方向移动形成电渗流。同时，在缓冲液中，带电粒子在电场的作用下，以不同的速度向其所带电荷极性相反方向移动，形成电泳，电泳流速度即电泳淌度。在高压电场的作用下，根据在缓冲液中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异，带正电荷的分子、中性分子和带负电荷的分子依次流出，带电粒子在毛细管缓冲液中的迁移速度等于电泳淌度和电渗流的矢量和，各种粒子由于所带电荷多少、质量、体积以及形状不同等因素引起迁移速度不同而实现分离；在毛细管靠负极的一端开一个视窗，可用各种检测器。目前已有多种灵敏度很高的检测器为毛细管电泳提供质量保证，如紫外检测器（UV）、激光诱导荧光检测器（LIF）、能提供三维图谱的二极管阵列检测器（DAD）以及电化学检测器（ECD）。由于毛细管的管径细小、散热快，即使是高的电场和温度，都不会向常规凝胶电泳那样使胶变性，影响分辨率。 毛细管电泳技术的分离模式和检测模式的发展同样也是多方面的，经典的分离模式有毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳等；新方法的发展研究难度大，但近年来却有不小的进展，其中建立新的分离模式和联用技术最为突出。比如建立了阵列毛细管电泳（CAE），亲和毛细管电泳技术（ACE），芯片毛细管电泳（CCE），非水毛细管电泳技术（NACE）；本文作者尝试将分子信标技术与毛细管电泳技术相结合进行基因检测，取得