质粒DNA地提取、纯化和电泳检测

质粒DNA的提取、纯化和电泳检测

姓名学号同组人班级实验时间

摘要：质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA，它是基因工程中一种非常重要的载体。质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。碱变性提取法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。本次实验利用碱变法对E.coli DH5 受体菌中质粒pUC19的DNA进行提取、纯化和电泳检测，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化及琼脂糖凝胶电泳技术。通过此次实验，我们达到了预期效果。

关键词：质粒DNA、碱变性提取法、质粒DNA的纯化、DNA凝胶电泳

1.引言

质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA。细菌质粒的相对分子质量大小从1kb至200kb以上不等。一些质粒永远独立于染色体之外，另外一些质粒在一定条件下会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。

由于质粒分子小、便于分离和提取的特点，在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒可通过连接外源基因构成重组体，携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，因此质粒是基因工程中一种非常重要的载体。质粒特征的分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、毒力及同源性分析。近年来由于基因芯片技术的出现，质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速的发展，所以这就要求我们从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA。因此，质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱裂解/碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的，适用于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶pH 值不同。在pH12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；质粒DNA的大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当用pH值4.8的KAc（或NaAc）高盐缓冲溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/

氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。

凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如EB染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。

溴化乙锭（EB）是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染色条件下，荧光的强度是同DNA片段的大小（或数量）成正比。

核酸在溶液中由于磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面六个因素：

（1）样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与分子量（所含碱基）的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。

（2）DNA分子的构象：分子量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA（cccDNA）的一条链断裂，变成开环DNA（ocDNA）分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA （Liner DNA）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型（cccDNA）迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状（ocDNA）分子。

（3）琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度愈低，则凝胶孔径愈大，DNA电泳迁移速度越快，即分子量越大，选用的凝胶浓度应越小。

（4）电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比。电压愈高带电颗粒泳动愈快，但随着电场强度增加，高分子量DNA的泳动速率以不同幅度增加，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减小，为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5V/cm。

（5）电泳缓冲液: 在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常见的核酸电泳缓冲液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。电泳缓冲液的作用：①维持合适的pH。电泳时，正极发生氧化反应（4OH-+4e-→2H2O+O2），负极发生还原反应（4H++4e-→2H2），长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的pH保持基本不变；②使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01～0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化；③电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1～2mM，目的是螯合Mg2+等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。电泳缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率，当电泳液为无离子水（如不慎在凝胶中忘记加缓冲液，即误用蒸馏水配置凝胶），溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下（如错用10×电泳缓冲液），导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。

（6）温度：DNA在琼脂糖凝胶电泳中的行为受碱基组成和凝胶温度影响不明显。不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在4～30℃内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0.5％时凝胶很脆弱，最好在4℃下电泳以增加凝胶强度。

2.材料和方法

2.1 材料和试剂

实验材料：E.coli DH5α受体菌（生长在LB固体培养基）、有Amp r标记的质粒pUC19 实验试剂：LB液体培养基、氨苄青霉素（Amp）母液（储存浓度100mg/mL）、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、TE缓冲液、Tris饱和酚、氯仿/异戊醇混合液、酚/氯仿/异戊醇（PCI）（25：24：1）混合液、3M NaAc溶液、冰乙醇、70%乙醇、RNase A、灭菌双蒸水ddH2O、50×TAE 缓冲液、10mg/mL溴化乙锭（EB）溶液、6×上样缓冲液（6×loading buffer）、琼脂糖、Supercoiled DNA Ladder Marker、pUC19、pUC19/Hin dⅢ

实验仪器：接种环、三角瓶、天平、红盖瓶、酒精灯、恒温振荡培养箱、100mL离心管、1.5mL塑料离心管、4℃离心机、涡旋振荡器、微量移液器、不同型号枪头、制胶板、制胶槽、样品梳、电泳仪、紫外灯、微波炉、灭菌锅、恒温水浴锅、记号笔、盛冰的搪瓷杯、离心管架、手套

2.2 方法

2.2.1 E.coli DH5α（pUC19）菌体培养

（1）用Amp母液和LB液体培养基配制LB+Amp（Amp工作浓度为100μg/mL）液体培养基。

（2）用酒精灯灼烧且冷却后的接种环在LB固体培养基上挑取E.coli DH5α单菌落，将接种环伸至LB+Amp液体培养基中，在液体培养基与三角瓶瓶壁交界面处向液体培养基中接种E.coli DH5α（pUC19）。

（3）将培养基在37℃、200rpm下振荡培养过夜。

（4）从过夜培养基中取1%接种量接种到新的LB+Amp（Amp工作浓度为100μg/mL）培养基，将新的培养基在37℃、200rpm下振荡4～6小时，最后得到菌液。

2.2.2 碱裂解/变性法提取质粒DNA

（1）取出一支灭菌的100mL离心管，标记上组号，用天平称量其重量，并记录为W1。

（2）向100mL离心管中倒入菌液至距瓶口1/3处，每两组的两支100mL离心管配平。

（3）将菌液在4℃离心机中6000rpm离心5min，弃上清。

（4）向菌液中加入5mL溶液Ⅰ，涡旋振荡，将菌液在4℃离心机中6000rpm离心5min，弃上清。

（5）将100mL离心管称重，标记其质量为W2，计算W2-W1。

（6）每100mg菌体量，加入（按菌体量接近的重新分组，溶液Ⅰ补平）：

①1.0mL溶液Ⅰ，充分涡旋振荡，用溶液Ⅰ再次配平；

②2.0mL溶液Ⅱ，轻柔颠倒混匀，冰浴3～5min；

③1.5mL溶液Ⅲ，轻柔颠倒混匀，冰浴5min。

（7）将菌液在4℃离心机中12000rpm离心15min，小心转移上清到新的离心管内，记录体积V。

（8）加入2V冰乙醇，颠倒混匀；-20℃静置15min。

（9）将菌液在4℃离心机中12000rpm离心15min，弃上清。

（10）加入5mL 70%乙醇，12000rpm离心3min，吸弃上清。

（11）重复70%乙醇洗涤一次，37℃风干5～10min。

（12）分次加入1mL TE溶液并转移到EP管中，得质粒DNA粗提物。

（13）向质粒DNA粗提物中加入5μL RNase A（10mg/mL），终浓度为50μg/mL，37℃孵育1～2小时。

2.2.3 质粒DNA的纯化

将1mL质粒DNA粗提物分出500μL到一新EP管中，使得每组两管。每个EP管进行如

下操作：

（1）加入等体积的Tris饱和酚，涡旋振荡，12000rpm离心5min；

（2）转移上清（上清体积是V1）至新管，加入V1的酚/氯仿/异戊醇混合液，涡旋振荡，12000rpm离心5min；

（3）转移上清（上清体积是V2）至新管，加入V2的氯仿/异戊醇混合液，混匀，12000rpm 离心5min；

（4）转移上清（上清体积是V3）至新管，加入1/10V3的3M NaAc溶液（pH=5.2），再加入2V4（V4=V3+1/10V3）的冰乙醇，混匀，-20℃保存30min；

（5）12000rpm离心15min，弃上清；

（6）加入500μL 70%乙醇洗涤，12000rpm离心2min，弃上清；

（7）重复洗涤一次，吸弃上清，37℃风干5min；

（8）每管加入25μL TE溶解沉淀，合并，得50μL纯化质粒DNA。

2.2.4琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA

（1）1%琼脂糖凝胶的制备。

①配制2L1×TAE：取40mL 50×TAE，用双蒸水将其稀释至2L。

②正确组装制胶槽、制胶板、样品梳。

③取40mL 1×TAE至250mL干净红盖瓶中，称量0.4g琼脂糖，混匀，轻旋瓶盖，微波炉加热沸腾3-4次，至溶液澄清无颗粒。

④待溶液冷却至60℃左右，加入20μL 1mg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，使EB溶液终浓度为0.5mg/L，混匀后缓缓倒入架好样品梳的制胶槽中，冷却凝固待用（冷却凝固时间要在30min以上）。之后轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳槽中事先加入1×TAE电泳缓冲液），即可上样。

（2）电泳上样。

①取2.0μL纯化DNA、2μL双蒸水、1μL上样缓冲液（6×loading buffer），用微量移液器吹吸混匀。

②将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加1×TAE至高出胶面约1mm。

③将上述混合好的DNA样品，按照表1顺序，点样到凝胶中。其中第11泳道为对照组，在整个实验过程中没有用RNA酶处理粗提物，其他实验过程不变。

（3）凝胶电泳与DNA分离。

①开启电泳仪电源。

②选择合适的电压（100-120V）和时间（40min）。

③将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极，与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极，与电泳仪负极相连。

④启动电泳，待观察到负极有气泡升起方可离开。

⑤电泳结束，关闭电源，取出凝胶。

⑥紫外灯下观察电泳结果，摄片，保存，分析。

表1 DNA样品加样顺序

3.结果

在碱裂解/变性法提取质粒DNA 中，W 1为14.16g ，W 2为14.26g ，W 2-W 1为100mg 。

碱裂解法提取质粒pUC19 DNA 的琼脂糖凝胶电泳得到的条带情况如图一所示。在溶液中，由于DNA 核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。图上方是17个点样孔，DNA 条带离点样孔越远，说明DNA 在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率越快。

图1. 碱裂解法提取质粒pUC19 DNA 的琼脂糖凝胶电泳

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 bp

3,049

2,0

87

泳道1与泳道9 加的样品是Supercoiled DNA Ladder Marker 。Supercoiled DNA Ladder Marker 由 8种超螺旋的质粒DNA 构成，DNA 大小分别为：2,087 bp 、3,049 bp 、3,997 bp 、5,026 bp 、6,133 bp 、8,023 bp 、10,085 bp 、11,849 bp （如图2所示）。其中2 kbp ～6 kbp 间约以1 kbp 递增，6 kbp ～12 kbp 间约以2 kbp 递增。每次取6μL 电泳时，每条带的DNA 量约为50 ng ，其中5 kbp 条带的DNA 量约为其他条带的3倍（150ng ），显示亮带。此DNA 溶液中已含有1×Loading Buffer ，可直接上样。1×Loading Buffer 中含有色素Xylene Cyanol FF （0.01%）以及Bromophenol Blue （0.01%）。在图1中Supercoiled DNA Ladder Marker 形成的DNA 条带中，可以清晰地看清从下往上6条DNA 条带（对应的DNA 由小到大），而且从下往上数第4条DNA 条带（DNA 大小为5026bp ）最明亮，而其余2条位置靠上（DNA 较大）的DNA 条带较不明显。

泳道2与泳道17加的样品是质粒DNA ，即pUC19，可以起到对照作用。pUC19的DNA 是cccDNA ，即超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA 。在图1中，可以看到泳道2与泳道17对应的电泳图中有一条清晰明亮的DNA 条带。

泳道3与泳道16加的样品是pUC19/Hin d Ⅲ。Hin d Ⅲ是限制性核酸内切酶，可以酶切pUC19。Hin d Ⅲ酶切pUC19的结果是使超螺旋的共价闭合环状结构的pUC19质粒DNA 的链断裂，DNA 的链断裂的pUC19迁移速度变慢。但是Hin d Ⅲ没有将所有pUC19酶切，因此泳道3与泳道16电泳后会形成两条条带。在泳道3与泳道16对应的DNA 带中，图中上面那条较细较暗的条带是Hin d Ⅲ酶切后的pUC19，图中下面那条较粗较亮的条带是没有被Hin d Ⅲ酶切的pUC19。

泳道4加的样品是1组DNA 样品。其DNA 条带很明亮而且宽。这说明1组样品中DNA 含量较高。

泳道5加的样品是2组DNA 样品，可以看见一条较暗的pUC19 DNA 条带。另外泳道11对应的电泳图中也可以看到一条较暗的pUC19 DNA 条带。在pUC19对应的DNA 条带位置处全班10个组均无明显的DNA 条带。

泳道6加的样品是我们组（3组）DNA 样品。我们的DNA 带较明亮，说明提取出的DNA 较多。但DNA 条带位置没有在pUC19 DNA 对应的位置。我们组DNA 条带位置比pUC19 DNA 对应的条带位置靠下，说明我们组DNA 迁移距离比pUC19 DNA 大，我们组DNA 的相对分子质量比pUC19 DNA 小。在pUC19 DNA 对应的条带位置上可以看到模糊的DNA 条带，产生的原因是因为下面的DNA 条带中有些DNA 因为迁移速度较慢而使DNA 条带拉长。

泳道11加的样品是6组DNA 样品（对照组）。该样品在实验过程中没有用RNA 酶处理，其他实验操作不变。因此该样品中含有大量的RNA ，所以在DNA

带下方形成大片很宽很明图2. Supercoiled DNA Ladder Marker 的DNA 条带

亮的RNA区域。

泳道4～泳道8、泳道10～泳道15在电泳图中都有明显的拖尾现象，而且在电泳图泳带的的中间偏上处都有一条或亮或暗的DNA条带，这是E.coli DH5α受体菌的DNA碎片，DNA碎片相对分子质量较大，泳动得较慢，所以形成的DNA条带较靠上。

某些点样孔的边缘（尤其是下边缘）出现荧光，泳道4、泳道7、泳道10、泳道12等对应的点样孔下边缘可明显观察到此现象。该现象说明这些提取的质粒DNA中含有较多的蛋白质，蛋白质阻碍了部分DNA泳动，从而在点样孔的边缘形成荧光。另外在这些点样孔下边缘的下方还有一条宽度比点样孔下边缘宽的DNA条带，这是提取的样品中残留的E.coli DH5α受体菌染色体DNA产生的DNA条带。

4.讨论

为获得高纯度的质粒DNA，必须彻底去除杂蛋白、染色体DNA和RNA。在整个质粒提取过程中除去染色体DNA的关键步骤是加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的变性和复性环节，应控制好变性和复性的时机。

溶液Ⅰ中含有50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl（pH 8.0）、10mM EDTA。加入溶液Ⅰ后溶液变浑浊，可剧烈振荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂。葡萄糖能使菌液密度增加，使大肠杆菌重悬并使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，沉淀菌体的量适宜即可，如果菌体过多，可能会导致溶液Ⅰ无法混匀，细胞裂解不充分。加入溶液Ⅰ重悬要充分，如果细胞没有完全散开悬浮，将会影响溶液Ⅱ裂解细胞，最终导致提取产物中含较多的蛋白质，染色体DNA等杂质。另外葡萄糖可以维持细胞渗透压，防止细胞提前破裂。葡萄糖还可以防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA具有螯合Ca2+和Mg2+的作用，而Ca2+和Mg2+是DNase的辅助因子，因此EDTA可避免DNase对DNA 的降解作用。Tris-HCl可以提供适当的pH。溶液Ⅰ在离心后要尽可能去除干净溶液Ⅱ含有0.2M NaOH、1% SDS。溶液Ⅱ使用前用10M的NaOH和10%的SDS母液配制，配制时要防止NaOH吸收空气中的H2O和CO2而减弱了碱性。加入溶液Ⅱ时，菌液变黏稠、透明，无菌块残留。NaOH可以使细胞溶解。同时，强碱性使染色体DNA、质粒DNA

和蛋白质变性；SDS在加入溶液Ⅲ后起到使蛋白质变性的作用。加入溶液Ⅱ时摇匀一定要轻柔，剧烈会导致基因组DNA断裂；静置时间也不能过长，因为基因组DNA在碱性条件下会慢慢断裂。

溶液Ⅲ含有5M KAc 60mL、冰醋酸11.5mL、重蒸水28.5mL，溶液终浓度为：K+3M，Ac -5M。加入溶液Ⅲ时，会立即出现白色沉淀。溶液Ⅱ中的SDS遇到KAc后变成了十二烷基硫酸钾（PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。SDS和蛋白质结合，钾钠离子置换所产生的大量沉淀将绝大部分蛋白质沉淀了，此外大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。HAc起到中和NaOH的作用，因为长时间的碱性条件下会打断基因组DNA，基因组DNA被打断就无法被PDS共沉淀。同时加HAc可以使变性的质粒DNA复性。该步反应形成的高盐环境进一步加速了这一沉淀。冰浴使反应更充分。

加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后，应缓慢上下颠倒离心管数次，切忌在涡旋振荡器上剧烈振荡，否则，染色体DNA会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNA提纯。因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法，既要使试剂与染色体DNA充分利用，又不破坏染色体的结构。

之后的实验操作是将菌液在4℃离心机中12000rpm离心15min，小心转移上清到新的离心管内。上清液中含有大量RNA、断裂的DNA片段和质粒DNA。注意此时沉淀不实，宁愿少吸上清，也不要带入沉淀，因为带入的沉淀在之后操作中无法去除。在使用离心机时，样品放置要对称平衡，否则会严重损害离心机的使用寿命。

沉淀DNA通常使用预冷无水乙醇，在低温条件下长时间放置可使DNA沉淀完全。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA 周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。

TE溶液是pH缓冲液，含有10mM Tris-HCl（pH 8.0）、1mM EDTA，呈弱碱性，有利于保护碱基对，为DNA提供稳定的生理状态。同时TE溶液含有EDTA，EDTA可抑制DNA酶的作用。

RNase A是一种广泛应用的核糖核酸内切酶，专一性催化C-U间3’-5’磷酸二酯键的裂开形成具有2’,3’-环磷酸衍生物寡聚核苷酸，可以去除残留的RNA。寡聚核糖核苷酸会保存在质粒DNA溶液中，但不影响后续的常规操作。

质粒DNA中蛋白质的去除通常采用酚、氯仿抽提。质粒DNA纯化过程中使用酚/氯仿/异戊醇混合液。苯酚是强的蛋白阻断剂，可使蛋白变性析出。同时，Tris饱和酚的pH在8.0左右，此时DNA分布于水相而RNA分布于有机相，从而可分离上清获得DNA。pH为8.0的Tris饱和酚比重略大于水，且与水有很大的互溶性，即酚可以进入水相从而影响后续的酶反应。因此，需要使用氯仿。氯仿也是蛋白阻断剂，但强度弱于苯酚，其主要作用是将同水以极小比例互溶的苯酚萃取出来。如果不加氯仿，残留的苯酚会阻碍酶切反应等，且不利于获得含质粒的水相。加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫，使水相和有机相间的界面更清晰，从而便于回收质粒DNA。采用酚/氯仿去除蛋白质效果较单独用酚或氯仿好，但需要抽提多次。质粒DNA 溶解子在上层的水相中。在实验的时候要注意，酚有强烈的腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心并且戴手套操作。皮肤如不小心沾到酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。

应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶液将会暴沸蒸发，影响琼脂糖浓度。对于琼脂糖溶液来说，如果胶液温度过高，会使制胶板、制胶槽、样品梳变性，从而影响胶孔大小和胶形状，间接影响加样量和跑条带。如果胶液温度过低，琼脂糖凝胶会凝固，所以在胶液冷却至60℃左右倒胶。胶液冷却至60℃左右后需要加EB，EB是一种强烈的诱变剂，应戴手套进行操作。制胶的时候要除去气泡。

胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要垂直向上，不要弄坏点样。拔梳子的时候要特别小心，以防凝胶与支持物脱离。

电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳效果。配制琼脂糖凝胶的电泳缓冲液应与电泳时使用的缓冲液为同一批配制的。注意使电泳槽中1×TAE缓冲液高于琼脂糖凝胶约

1mm。

DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动，因此点样孔在负极。电泳上样时要小心操作，枪尖应恰好置于凝胶点样孔中，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。同时不要快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。跑多个样时，应依次快速点样，否则时间一久，样品会弥散。

琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA过程中使用上样缓冲液（loading buffer），其含有30%甘油、0.25%溴酚蓝（BPB）、0.25%二甲苯青FF。甘油的作用是增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内。溴酚蓝及二甲苯氰作为双色电泳指示剂，使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使加样操作更为便利，另外可以在电场中预测速率。

在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，该

法还可用于相对分子质量的测定。将未知相对分子质量的DNA样品与已知相对分子质量的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可以获得该样品的相对分子质量的大小。

紫外线对眼睛和皮肤均有危害性，对眼睛尤甚。为了最大限度避免受到辐射，要确保紫外光源得到适当遮蔽，并应戴好目镜（眼罩）或能够有效阻挡紫外线的全副完全罩，避免皮肤直接暴露在紫外线下。

参考文献

[1] 汪天虹.分子生物学实验.北京：北京大学出版社，2009年.

质粒DNA的提取和纯化实验报告

质粒DNA的提取和纯化实验报告

实验一、质粒DNA的提取和纯化 一、实验目的： 1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。 2、初步了解DNA纯化的原理。 二、实验原理 1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 三、实验步骤 1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管） 2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。 3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体） 4、重复一次第三步的过程 5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体

质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题

1．实验目的： （1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒； （2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术； 2．实验材料及用品 （1）实验仪器（apparatus）： 恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（V ortex mixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（beaker）、量筒（graduated cylinder）、玻璃棒（stir bar）、微波炉（microwave）、天平（Pan balance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electrophoresis tank）、电泳器（Electro-phoresis System）、紫外灯（Ultraviolet transilluminator ） 3）、材料与试剂（Reagents）： ①溶液I（Solution Ⅰ）： 50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）pH8.0 溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。 ②溶液Ⅱ（Solution Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合 0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 ③溶液III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀 60mL 5mol/L KAc， 11.5mL 冰醋酸， 28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L） ④TE液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0） ⑤70% 乙醇； ⑥平衡酚：氯仿1：1： 将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。 ⑦LB培养基： 胰化蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 15g pH 7.0 ⑧琼脂糖（Agarose）； ⑨1 liter（升）5×TBE备用溶液（stock solution）： 54g tris base，27.5g 硼酸（boric acid），20ml 0.5 mol/L EDTA , pH 8.0； ⑩6×凝胶加样缓冲液：

《分子生物学》质粒DNA的提取与鉴定实验报告

质粒DNA的提取与鉴定 实验日期2020年5月14日室温25°C 成绩 一、实验报告摘要 【实验题目】 质粒DNA的提取与琼脂凝胶电泳鉴定 【实验目的】 1、掌握质粒提取原理和各种试剂的作用。 2、掌握琼脂糖凝胶电泳原理和操作。 二、实验原理 1、质粒： 质粒是独立存在于染色体外，能自主复制并能稳定遗传的一种环装双链DNA，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中。细菌质粒是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内利用宿主细胞的复制机构复制质粒自身的DNA 2、琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法之一，该技术操作简便，快速。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA。此外，直接用低浓度的核酸染料进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。琼脂糖凝胶通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 三、操作要点：

（1）质粒DNA的提取 1、收取细菌：将4mL细菌培养液分为2次加入2mL的塑料离心管(子弹头)内，每次以12000r/min离心1min(注意平衡)弃去上清液。 2、加入100uL用冰预冷的溶液I，用移液枪将细菌沉淀打散成为悬浮液。(溶液I放置冰中) 3、加入200uL溶液II，盖紧盖口，翻转离心管5次，充分混合内容物，避免振荡，将离心管置于冰上。 4、加入150uL用冰预冷的溶液III，盖紧盖口，翻转离心管，温和摇匀直至粘稠状的细菌裂解物出现，置于冰上5分钟。(溶液放置冰中) 5、用微量离心机12000r/min离心5分钟。取上清液移到另一离心管。 6、加入等量的酚:氯仿(1:1)混合液，轻轻混匀，12000r/min离心7分钟，将上清液收集到新的离心管中。 7、加入2倍体积100%乙醇沉淀DNA，轻轻混匀，1200 0r/min离心5分钟，弃去上清液，倒置在滤纸上干燥，漓尽液体。 8、用1m170%乙醇洗涤DNA沉淀，按照步骤7去除上清液，空气干燥10min。 9、用50uL的无菌水溶解质粒DNA 。 （2）琼脂凝胶电泳分离鉴定 1，制胶。将电泳缓冲液和琼脂糖在微波炉中熔化，混匀，冷却至55°C，加入EB染料，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳。 2.加入10u1的6x加样缓冲液到DNA样品，混匀，然后用移液器取50u1样品加入样品孔中。(不要漫出加样孔) 3.接通电极，在120V电压下进行电泳20min-30min 。 4.当加样缓冲液中的溴酚兰迁移至足够分离DNA片段 的距离时，关闭电源。 5.已染色的凝胶可以直接在紫外透射仪上观察或照相 四、实验结果： 成功分离DNA片段，能看到超螺旋质粒和单缺口质粒的条带。

质粒DNA的提取及电泳检测

实验质粒DNA的提取及电泳检测 一实验目的 通过本实验学习掌握碱裂解法提取细菌质粒DNA。 二实验原理 1. 细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。 2. 质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法，煮沸法，去污剂（如Triton和SDS）裂解法。 3. 碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。 三实验材料：转化后的细菌(含有质粒的大肠杆菌) 四、实验用具和药品 1. 实验用具: 摇床，离心机，移液器及枪头，玻璃试管（15mL）及塞子，离心管（） 2. 实验试剂： （1）溶液I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl（） 10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（） （2）溶液II L NaOH，2%SDS，用前等体积混合 （3）溶液III 5 mol/L 乙酸钾60ml 冰乙酸 水 （4）TE 缓冲液 10 mmol/L Tris·HCl（） 1 mmol/L EDTA（） （5）70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回） （6）加样缓冲液（6X）：40%蔗糖、%溴酚兰 （7）电泳缓冲液：L Tris-硼酸 L EDTA （TBE buffer）

电泳缓冲液贮存液：5X：54g Tris碱、硼酸、20ml L EDTA（） 五实验步骤 （一）细菌繁殖 挑取白色的单菌落若干，转移到3mL液体LB培养基(附加100mg/ml Amp ),37℃过夜振荡（200r/min）培养。 （二）菌体收集 将过夜培养的菌体转入离心管，离心30sec 5000r/min；弃上清提取质粒 （三）质粒提取 方法一：碱裂解法提取质粒DNA 1．.将上述沉淀重悬于250μL冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡； 2．加入250μL溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5~10次； 3．加入350μL冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和地颠倒离心管5~10次；9000r/min 离心5min上清转移到另一新离心管中； 4．加等体积氯仿，振荡混合，静置，9000r/min离心5min，上清转移到另一新离心管中； 5．加入1/10体积3mol/L的醋酸钠和2倍体积的乙醇，充分混匀，静置5min；9000r/min离心5min； 6．弃上清，用70％ethanol洗涤； 7．加30μLTE溶解，-20 ℃保存。 方法二：试剂盒提取方法 1.离心收集的菌体中加入含RNAase的溶液Ⅰ250μL，重悬菌体，不应留有小的菌块； 2. 加溶液Ⅱ250μL，轻轻颠倒离心管4-6 次，使菌体充分裂解，至溶液澄清； 3. 加入350μL冰预冷的溶液Ⅲ，温和并充分地上下翻转混合6-8 次； 4. 12000r/min离心10min； 5. 将上清转移到DNA结合管（置于2 ml 离心管中），12000r/min离心1min，弃滤液； 6. 将制备管置回离心管，加入去蛋白试剂500μL，12000r/min离心1min，弃滤液； 7.将制备管置回离心管，加洗涤液700μL，12000r/min离心1min，弃滤液；以

(完整版)质粒DNA的提取、纯化与鉴定

分子生物学实验报告 题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定 姓名：学号：班级：时间： 一、实验目的： 1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 二、实验原理： 1.质粒DNA的提取——碱变性提取法： 提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。 碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。 2.凝胶电泳进行DNA分离纯化： 电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可

质粒DNA提取方法与原理

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl (pH 8.0）1 2.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA恢复活性 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。 3.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的 SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被

质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳 二、实验原理： 1.质粒DNA的提取： 质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。 （1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理： 碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。 （2）四种溶液作用及原理： ①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制DNA酶对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。 ②Solution II的作用：提供碱性条件，pH高达12.6，使大肠杆菌瞬间裂解，促使染色体DNA和质粒DNA变性。所含离子型表面活性剂十二烷基酸钠（SDS）可使细胞膜、核膜发生破裂，充分溶解膜蛋白。同时，磺酸基与蛋白质形成复合物而变形沉淀。 ③Solution III的作用：为KAc-HAc缓冲液。该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基磺酸钠发生反应形成十二烷基磺酸钾，从而将与之结合的绝大部分大肠杆菌蛋白质以及很长的基因组DNA一起沉淀，与质粒分离开来；另外溶液III所含有的醋酸中和溶液Ⅱ的强碱性，使pH降至中性，因为长时间的碱性条件会打断DNA；基因组DNA一旦发生断裂，只要是50-100kb大小的片段，就没有办法再被PDS共沉淀，这样就跟质粒DNA共存了。而且在整个质粒DNA 的提取过程中，沉淀DNA时用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行都是为了用化学或物理手段将基因组DNA分子和蛋白质发生变性、在体系中的溶解度降低，较充分的分离提纯出实验所需的质粒DNA

质粒DNA的微量制备及电泳检测

实验报告 课程名称：生物化学及实验 指导老师： 成绩： 同组学生姓名： 一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析 一、实验目的和要求 1、学习并掌握质粒DNA 的提取原理和方法 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作 3、学习并掌握对电泳检测结果的初步分析 二、实验内容和原理 1、质粒 质粒是一种染色体（核质体）外的寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA 分子，大小在1-200kb 之间，具有自主复制和转录功能, 能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息，但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞（细菌）基因组DNA 编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移，因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。 从细菌细胞中抽提质粒DNA 分为三个步骤： ①细菌培养使质粒大量扩增； ②收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA ； ③进一步除去蛋白、脂类、RNA 等杂质，分离和纯化质粒DNA 。 2、碱裂解法分离纯化质粒DNA 在EDTA 存在下，经过SDS 处理使细胞膜裂解，从而使菌体充分裂解，利用在碱性条件下（NaOH ），使核质体DNA 与质粒DNA 的变性；加入乙酸钾，在中性条件下，核质体DNA 与质粒DNA 又存在复性的差异，质粒DNA 很快得以复性，而细菌核质体DNA 分子难以复性，核质体DNA 会缠绕附着在细胞膜碎片上通过离心被沉淀下来，质粒DNA 则留在上清液内；上清液中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量核质体DNA 以及脂质类杂质等，可通过碱性酚-氯仿-异戊醇混合液的抽提去除；含有质粒DNA 实验名称：质粒DNA 的微量制备及电泳检测 姓名： 吴逸璇 学号：

质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定

实验题目质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定 实验目的掌握质粒提取的原理与各种试剂的作用和琼脂糖凝胶电泳原理和操作 实验原理质粒存在于细菌，线粒体等，独立于染色体之外，能够稳定遗传并自我复制，是一个双链环装DNA。对数期大肠埃希菌含有质粒。溶液一可使细菌充分重悬，溶液二使细菌裂解，释放质粒和基因组DNA.溶液三起到中和作用，使得质粒DNA迅速复性，而基因组DNA因为分子巨大，复性时间长。离心后，质粒DNA留在上清液，而基因组DNA和细胞碎片沉淀在离心管。 琼脂糖凝胶电泳蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此泳动的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50bp的DNA。此外，直接用低浓度的核酸染料进行染色，可以确定DNA 在凝胶中的位置。 实验主要步骤 质粒DNA提取 1.取4ml细菌平均分两份加入离心管，以12000r/min离心1min，去除上清液 2.加100ul用冰预冷溶液I，移液枪打散细菌沉淀使其成为悬浮液 3.加入200ul溶液II，盖紧盖口，翻转五次，充分混合，避免振荡，置于冰上 4.加入150ul冰预冷溶液III，盖紧盖口，翻转离心管5次，温和摇匀直到粘稠的细菌裂解物出现，放于冰上5min 5.离心管以12000r/min离心5min 6.取上清液加入等量的酚：氯仿混合液，轻轻摇匀，以12000r/min离心7min 7.取上清液加入2倍体积100%乙醇沉淀DNA，轻轻摇匀，12000r/min离心5min，去除上清液，倒置在滤纸上干燥 8.用1ml70%乙醇洗涤DNA沉淀，按照步骤7去除上清液，空气干燥10min 9.用50ul无菌水溶解质粒DNA 琼脂糖凝胶电泳： 1.制胶。将电泳缓冲液和琼脂糖在微波炉中熔化,混匀,冷却至55°℃,加入EB染料,倒入已封好的凝胶灌制平台上,插上样品梳。 2.加入10ul的6×加样缓冲液到DNA样品,混匀,然后用移液枪取50u1样品加入样品孔中。(不要漫出加样孔) 3.接通电极,在120V电压下进行电泳20min-30min 4.当加样缓冲液中的溴酚兰迁移至足够分离DNA片段的距离时,关闭电源。 5.已染色的凝胶可以直接在紫外透射仪上观察或照相。 实验结果

质粒DNA的提取、纯化与鉴定

姓名宿智新学院生命科学学院班级 11级生工2班科目分子生物学实验学号 201100140155 第 8 组 质粒DNA的提取、纯化与鉴定 摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌DH5α（E.coli DH5α）中提取pUC19质粒，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。同时通过对质粒DNA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DNA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。 关键词：碱变法质粒电泳 实验目的： 1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 实验原理： 1.质粒DNA的提取——碱变性提取法： 提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。 碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

质粒DNA的提取、酶切与鉴定

实验二十一质粒DNA的提取、酶切与鉴定 一、质粒DNA的提取 [原理]分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。 本实验采用碱变性法抽提质粒DNA，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 [试剂] 1.溶液I： 50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA、25mmol/L Tris-HCl pH8.0;用前加溶菌酶4mg/ml。 2.溶液II： 200mmol/L NaOH 、1% SDS。 3.溶液III： pH4.8醋酸钾缓冲液（60 ml 5mol/L 醋酸钾、11.5ml冰醋酸、28.5ml 蒸馏水） 4.TE缓冲液pH8.0 5.含RNaseA的TE缓冲液：TE缓冲液含20μg/ml RNaseA。 6.苯酚：氯仿（1：1，v/v）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使体积分数为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇为24：1（v/v）。 7.1×LB溶液 8.100μg/ml氨苄青霉素 [器材] 1.TGL-16型台式高速离心机

2.1.5ml塑料离心管 3.离心管架 4.微量移液器 5.常用玻璃器皿 [操作步骤] 1.培养细菌将带有质粒pUC19的大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的1×LB中，37℃培养过夜。 2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10 000r/min离心lmin，去掉上清液。加入150μl溶液I，充分混匀，在室温下放置10min。 3.加入200μl新配制的溶液II，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置2min。 4.加入150μl冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置10min。 5.用台式高速离心机，10 000r/min离心5min，将上清液移入干净的离心管中。 6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：1，v/v），振荡混匀，转速10 000r/min，离心2min，将上清液转移至新的离心管中。 7.向上清液加5mol/LNaCl至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，离心5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加0.5ml 70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。 9.加入50μl含RNase A 20μg/ml的TE缓冲液溶解提取物，室温放置30min以上，使DNA充分溶解待用或置-20℃备用。 二、质粒DNA 的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定 [原理]限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。 Ⅱ型限制性内切酶，具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的

质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告

质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳 一、前言 质粒 质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。然而，1984年，在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。 天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒)。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷

贝，一般在20个以上，如 Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。其自我复制能力及所携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性:⑴分子量小、多拷贝、松弛控制型;⑵具有多种常用的限制性内切酶的单切点;⑶能插入较大的外源DNA片段;⑷具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和筛选。⑸对宿主细胞无害。常用的

质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定

质粒DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定 一目的学习质粒的酶切及电泳分析。 二原理 限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。 限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。 质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。 三试剂与主要仪器 （一）试剂 1．Eco RⅠ酶 2．λ DNA 3．TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍 4．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油 5．溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。 6．琼脂糖 （二）仪器 1．电泳仪系统2．紫外灯3．恒温水浴箱 四操作步骤 （一）质粒DNA酶切 1．按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号。 管号①②③ 质粒DNA 10 10 10 Eco RⅠ/ μl 1 1 酶切Buffer（10×）/ μl 2 2 2 ddH2O/ μl8 7 6 RNA酶 1 2．加样后混匀，置于37℃水浴中，保温2小时。然后每个管中加入4 μl Loading buffer。（二）琼脂糖凝胶电泳 1 琼脂糖凝胶的制备称取0.4g琼脂糖加入40ml 0.5×TBE缓冲液中，加热熔解。冷却至65℃时加入2μl EB，混匀。 2 胶板制备将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，并在一端插好梳子。然后倒入熔好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入0.5× TBE 缓冲液），拔掉梳子。注意：缓冲液要高出胶面2毫米。 3 加样每个样品中加入1/10体积点样缓冲液，混匀后小心地加入样品槽中，要避免相互污染。1-2㎝处时，停止电泳。 5 观察及照相将胶板拿出，用自来水小心地冲洗一下。在紫外灯下观察结果，如果有条件也可用凝胶成像系统照相。

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告

质粒 DNA 的提取、定量、酶切与PCR 鉴定 一、实验目的 1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA 的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法； 3.学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。 二、实验原理 1.PCR(多聚酶链式反应 ) 在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA ，使目的 DNA 按 2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为： A. 变性：加热反应系统至95℃，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链。 B. 退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（ 35－70℃, 一般低于模板 Tm 值的 5℃ 左右），与模板DNA 互补退火形成部分双链。 C. 延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq 酶作用下，以dNTP 为原料，引物为复 制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒 DNA 的提取与制备 (1). 碱裂解法： 染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差异： A. 高碱性条件下，染色体DNA 和质粒 DNA 均变性；

B. 当以高盐缓冲液调节其pH 值至中性时，变性的质粒DNA 复性并保存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2). 离心层析柱： A. 硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA ，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质； B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C.低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。 3.质粒 DNA 的定量分析（紫外分光光度法）： A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱 : DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰 C. A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反应DNA 的纯度； A260/A280=1.8DNA 纯净 A260/A280<1.8表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质 A260/A280>1.8含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。 4.质粒 DNA 的酶切鉴定： 限制性内切酶是DNA 重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与 一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA 序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并 在结合位点切割双链DNA 。

质粒电泳图说明

质粒电泳图说明 最快的是超螺旋，其次是线性DNA，最慢的是开环DNA； 其实我们提取质粒的时候常见的是两条带：超螺旋和开环DNA，但是个人觉得线性的DNA 也是存在的，只是量很少而已，因为质粒如果变成线性的话，其就不能进行正常复制，就会慢慢降解掉。所以提取出来的量就会很少，但是我觉得是存在的。 用酚、氯仿法从工程菌中提取的质粒一般有三种构像，即超螺旋，线形和开环。（开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度最慢）三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋>线形>开环，线形的质粒在中间，而开环的质粒在最后。 判断质粒质粒好坏的一个指标就是超螺旋质粒在所以质粒中的含量。因为用质粒转染真核细胞时，超螺旋的质粒效率最高，所以要求质粒中超螺旋质粒的含量要在90％以上，这也是对作为核酸疫苗重组质粒的要求。 根据我做实验的经验，回答你的问题 1 从细菌中大量提取的质粒电泳时，不一定均出现三条带，有时会出现两条，甚至一条(一般是超螺旋的质粒)，这跟上样量也有些关系。出现不同的结果都是由抽提质粒时的操作手法造成的。如果严格按照操作步骤，超螺旋的质粒会较多。 2 酶切将质粒线性化以后，才可以用mark判断大小。如果有三种构像，可以用中间那条带与mark比较判断大小。 3 商品化的质粒我没有直接跑过电泳。我估计应该大部分是超螺旋构像。 4 酶切后线性化条带电泳时所处的位置就指示质粒的大小 首先得搞清楚，你用得内切酶在质粒序列中（包括你克隆的基因）总共有几个位点？如果2

个以上，出现上述结果就比较好解释了。 可以将酶切前后得质粒一起跑电泳，比较一下，酶切后得四条带与酶切前两条带得大小是否有差异。 部分酶切也是有可能的，原因是你的质粒量太大，酶没有作用完。或者是酶活力不够/酶量太少。 质粒提取比较好的情况下，最前面得超螺旋构像较多。假如提取质粒时，加溶液II以后，剧烈地振荡，你就会发现，在质粒电泳图中，开环构像比例很高，甚至会超过超螺旋构像的亮度，也就是说这种质粒质量很差。 1，提质粒最好用kit。现在国内、国外的提质粒kit很多，质量都不错，价格也不贵。一般提取1－5ml菌体质粒的一次反应，可能就3－5元人民币，半小时时间，一台普通台式离心机（可以不带制冷的）。提取的质粒质量很好，一般都是超螺旋的，进行常规的分子生物学反应都没有问题，且很少RNA和基因组DNA污染。一句话：省时省事质好。用酚氯仿等抽，常会影响后续的操作。 2，鉴定质粒的方法。最好是测序。其次是多采用几组酶进行双酶切分析，再电泳检测片断大小与理论值是否一致。 仅仅靠电泳质粒判断大小的方法来检测误差太大。一是因为质粒结构不均一，前面很多tx 都提到了。二是质粒太大后，其大小本身就不易从胶上判断准确。比如一个5kb和5.5kb的质粒其大小是不易从电泳胶上区分的。