白血病小鼠H_2全不相合微移植模型的建立及鉴定
文章编号（Article ID ）：1009－2137（2014）03－0779－06
·论著·
白血病小鼠H-2全不相合微移植模型的建立及鉴定吴惠惠，刘铁强，孙雪冬，黄晓梅，张锐，刘志强，满秋红，黄雅静，
孙琪云，左红莉，乔建辉，余长林，胡锴勋，艾辉胜，郭梅
*
军事医学科学院附属医院血液科，北京100071
摘要本研究旨在建立白血病小鼠H-2全不相合微移植模型并进行鉴定。受、供鼠分别为雌性BALB /c 和雄性
C57BL /6J ，H-2为全不相合。受鼠微移植前5d 静脉接种WEHI-3细胞约1?106
个，微移植前3d 开始给予MA 化疗（米托蒽醌+阿糖胞苷），0d 末次化疗后8h 之内回输经G-CSF 动员的供体脾单个核细胞，回输细胞数分别为
（3、6、12）?107
个。化疗对照组用等量生理盐水。所有受鼠不予GVHD 预防。比较各组早期死亡率、白细胞恢复及白血病负荷情况。ＲT-PCＲ法检测微移植后供体嵌合率。从临床表现和病理情况综合评价微移植组小鼠GVHD 情况。结果表明，化疗对照组早期死亡率为25%，
（3、6、12）?107组分别为16．67%、8．33%、8．33%。（3、6）?107组白细胞恢复明显优于化疗对照和12?107
组（P ＜0．05）。白血病负荷（3、
6、12）?107组明显低于化疗对照组（P ＜0．01），而（6、
12）?107组明显低于3?107组（P ＜0．05）。微移植后供体成分在2周之内以微嵌合形式存在。微移植组小鼠均未发生明显GVHD 证据。结论：成功建立了白血病小鼠H-2全不相合微移植模型，为后续研究及临床微移植相关研究提供了基础。
关键词
白血病小鼠；H-2全不相合；微移植；微移植模型；微嵌合中图分类号Ｒ733．7；Ｒ332文献标识码A doi ：10．7534/j．issn．1009-2137．2014．03．038Establishment and Identification of a H-2Completely Mismatched
Microtransplantation Model of Leukemia Mouse
WU Hui-Hui ，LIU Tie-Qiang ，SUN Xue-Dong ，HUANG Xiao-Mei ，ZHANG Ｒui ，LIU Zhi-Qiang ，
MAN Qiu-Hong ，HUANG Ya-Jing ，SUN Qi-Yun ，ZUO Hong-Li ，QIAO Jian-Hui ，YU Chang-Lin ，
HU Kai-Xun ，AI Hui-Sheng ，GUO Mei
*
Department of Hematology ，Affiliated Hospital ，Academy of Military Medical Sciences ，Beijing 100071，China
*
Corresponding Author ：GUO Mei ，Associate Senior Physician．E-mail ：guom 196801@aliyun．com
Abstract This study was purposed to establish and identify a H-2completely mismatched microtransplantation model of leukemia mouse．The recipients were female BALB /c mice ，while donors were male C57BL /6J mice．Ｒecipients
were inoculated intravenously with 1?106of WEHI-3cells ，a cell line of myelomonocytic leukemia．Donors received 100μg /kg G-CSF mobilization through hypodermic injection ，every 12hours ，and it last 5days．Chemotherapy regi-mens was MA （mitoxantrone +cytarabine ），and it last 4days．Ｒecipients were given chemotherapy conditioning without
GVHD prophylaxis after inoculation of leukemic cells for 2days ，and within 8hours after last chemotherapy received do-nor mobilized spleen mononuclear cells （sMNC ）．The number of sMNC was （3、6、12）?107，respectively．The early death rate ，recovery level of WBC in peripheral blood and leukemia load were compared between chemotherapy and mi-crotransplantation groups．The donor chimerism was detected by ＲT-PCＲ．From the clinical manifestation and pathologi-cal features ，the GVHD in recipients was evaluated．The results showed that the early mortality in chemothearpy group was 25%，meanwhile those in the （3、6、12）?107groups were 16．67%、8．33%、8．33%，respectively．The （3、6）?107groups has a stronger hematopoietic recovery capability than that in chemotherapy and 12?107groups （P ＜0．05）．There were more leukemic cells in chemothearpy mice than that in microtransplantation mice （P ＜0．01），and （12、6）?107groups had lower leukemia load than that in 3?107group （P ＜0．05）．No signs of GVHD were observed in microtrans-plantation mice．The donor microchimerism could be discovered at eraly 2weeks after donor cell transfusion．It is con-cluded that a H-2completely mismatched microtransplantation model of leukemia mouse has been successfully estab-lished ，and it will provide a experimental base for studing microtransplantation in clinic．Key words leukemia mouse ；H-2completely mismatched ；microtransplantation ；microtransplantation model ；mi-crochimerism J Exp Hematol 2014；22（3）：779－784
基金项目：国家自然科学基金面上项目（861739）；国家自然科学基金重点项目（81130054）；首都临床特色应用研究（Z1211070001012082）*
通讯作者：郭梅，副主任医师，
E-mail ：guom196801@aliyun．com 2014－03－11收稿；2014－03－25接受
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977·中国实验血液学杂志Journal of Experimental Hematology 2014；22（3）：779－784
造血干细胞移植是治疗恶性血液病的有效手段，但无论是经典的清髓移植还是非清髓移植，因受到供体来源、HLA配型、感染，尤其是移植后移植物抗宿主病（GVHD）等因素的影响，其发展受到了很大的限制［1－3］。微移植是一种过继性细胞免疫新型疗法［4］，它是在标准化疗基础上给予输注供者动员后的外周血造血干细胞，微移植过程中受体未接受传统移植的预处理。临床结果证实，微移植在发挥移植物抗白血病（GVL）效应同时，未发现明显GVHD证据［4－5］。
小鼠在遗传学和造血系统等方面与人类十分相似，因此常选择小鼠作为白血病的研究对象。国内外许多中心有白血病小鼠的清髓或非清髓移植模型［6－7］，但建立白血病小鼠H-2全不相合微移植模型的报道鲜见。本研究建立白血病小鼠H-2全不相合微移植模型，为后续研究提供实验条件。
材料和方法
实验动物与试剂
受鼠：雌性BALB/c小鼠（H-2K d/d），60只；供鼠：雄性C57BL/6J小鼠（H-2K b/b），70只，均为6－8周龄，SPF级，由军事医学科学院动物中心提供（合格证号：SCXK-（军）2012-0004）。小鼠粒单细胞白血病细胞株WEHI-3购自协和医科大学基础研究所细胞中心。IMDM培养液为美国Gibco公司产品，FBS 为杭州四季青产品。重组人粒细胞集落刺激因子rhG-CSF（300μg/支）为北京双鹭药业股份有限公司产品，米托蒽醌（5mg/支）及阿糖胞苷Ara-C（0．1 g/支）为美国Pfizer公司产品。小鼠淋巴细胞分离液Ficoll（密度1.082g/ml）购于天津灏洋生物技术有限公司。基因组DNA提取试剂盒为德国Qiagen 公司产品，Premix Ex Taq TM PCＲ反应体系购于大连宝生物TaKaＲa公司，小鼠β-actin及SＲY上、下游引物及小鼠β-actin及SＲY荧光探针购于北京三博远志生物有限公司，MX3005P荧光定量PCＲ仪为美国Stratagene公司产品。流式细胞检测仪为美国Beckman Coulter公司产品。
小鼠白血病模型［8－10］的建立
选取指数生长期的WEHI-3细胞，在倒置显微镜下观察判断细胞活性良好，并消化、调整细胞浓度约为5?106/ml。取受鼠，微移植前5d经尾静脉接种上述白血病细胞混合悬液0．2ml（约1?106个/只）。
化疗方案
受鼠微移植前3d开始接受MA化疗，第1天米托蒽醌4mg/kg，第2－4天阿糖胞苷200mg/kg，共持续4d。
供体细胞动员及脾单个核细胞（sMNC）悬液制备
供鼠微移植前5d开始接受皮下G-CSF动员，100μg/kg，q12h?5d。末次注射12h后，用颈椎脱臼法处死供鼠，于75%的酒精中浸泡15min，无菌超净台内分离脾脏，加入适量的IMDM培养液进行研磨，使研磨后组织细胞悬液经过200目细胞筛过滤，得到脾细胞悬液，加入含等量淋巴细胞分离液的离心管中，340?g离心25min，吸取中间白膜层即脾单个核细胞，加入IMDM进行洗涤1次（270?g，5 min），用红细胞裂解液去除红细胞（270?g，5 min），弃上清液后再次用培养液洗涤1次（270?g，5min），计数并调整细胞浓度备用。
细胞回输
受鼠于0d停末次化疗，在8h之内回输上述供体sMNC，细胞量分别为（3、6、12）?107个/只，化疗对照组给予等量生理盐水。
实验动物分组
受鼠随机分成5组，每组12只：①MA+3?107 sMNC、②MA+6?107sMNC、③MA+12?107 sMNC、④MA+生理盐水（化疗对照组）、⑤MA+目的细胞量（选取合适的回输供体细胞量之后进行第⑤组实验，进行微移植模型鉴定），所用受鼠均未给予GVHD预防。
小鼠脾细胞动员前后分类检测
分别取动员前后供鼠sMNC，加入相应流式管中，然后分别加入小鼠单克隆抗体FITC-CD4/PC5-CD3/ PE-CD8、FITC-SCA-1/PE-C-Kit、PC5-Gr1/PE-Thy1．2/FITC-B220，以及同型对照FITC-IgG/PE-IgG/PC5-IgG，4?避光孵育30min，加入红细胞裂解液去除红细胞，PBS缓冲液洗涤2遍，弃上清液并用PBS重悬后上流式细胞仪检测。
一般情况观察
在实验中观察小鼠有无精神倦怠、食欲减退、活动量减少、腹泻、皮肤溃疡等体征，并且记录体重及早期死亡情况。
外周血象的监测
各组受鼠在微移植后每天从尾静脉取血20μl，用全自动血细胞分析仪检测各组白细胞变化情况。
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087
·中国实验血液学杂志J Exp Hematol2014；22（3）
白血病负荷检测
各组小鼠接种WEHI-3后3周处死3只，分离双侧股骨，清除肌肉等组织，剪开干骺端，用1ml注射器吸取PBS缓冲液冲出小鼠骨髓，离心甩片后行Wright-Giemsa染色。在显微镜下计数200个有核细胞，计算骨髓中原始和幼稚细胞比例。
供体植入率检测
Ｒeal-time PCＲ（ＲT-PCＲ）法检测小鼠SＲY基因表达率以进行供体植入率检测，回输供体细胞后1、3、7、10d及2周等时间点各处死小鼠2只，提取各组织DNA后进行Ｒeal-time PCＲ检测。根据PCＲ扩增所得到β-actin及SＲY两种基因的ct值，与两基因标准曲线比对换算成基因的拷贝数，SＲY与β-actin基因拷贝数的比值即为SＲY相对表达率。
GVHD判断
①大体观察：体重变化、体位改变、活动能力、脱毛、大小便；②病理观察：化疗组和微移植组小鼠均在微移植后3d取肝、脾、小肠标本，并取微移植组小鼠疾病进展病理标本，以10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察。
统计学处理
采用SPSS19．0软件进行统计学处理。计量资料采用珋x?SD表示，两独立样本采用t检验。计数资料采用χ2检验。P＜0．05为差异有统计学意义，P＜0．01为差异显著。
结果
供体动员前后脾单个核细胞分类
动员后脾单个核细胞中富含C-Kit+/SCA-1+双阳性早期干祖细胞，与动员前差异显著（P＜0．01）（表1），此结果说明动员效果良好。
Table1．Comparison of cell component before and after mobilization
Cell component Before mobilization After mobilization
C-Kit+/SCA-1+（0．35?0．05）%（3．8?0．5）%＊＊
CD3+/CD4+（19．2?0．9）%（15．2?2．2）%
CD3+/CD8+（11．4?1．6）%（10．9?1．1）%
Thy1．1+（29．3?0．8）%（38．5?7）%
B220+（34．80?1．8）%（33．4?3．9）%
Gr1+（35．2?0．75）%（28．3?3．5）%
＊＊P＜0．01，compared with level before mobilization．动物一般情况
各组小鼠化疗后均出现活动量减少、体重减轻、腹泻、皱毛情况，且伴有外周血象下降。死亡的小鼠上述情况更加严重，存活小鼠停化疗3d后上述情况逐渐减轻。化疗对照组早期死亡率最高，为25%，（3、6、12）?107组明显降低，分别为16．67%、8.33%、8．33%，四组差异无统计学意义（P＞0．05），死亡原因系化疗毒性和骨髓抑制。
白细胞恢复情况
各组小鼠化疗后外周血白细胞数均出现下降，停化疗第2天降至最低，停化疗7d后基本恢复。（3、6）?107组停化疗第4、5、6天高于化疗组，其中第4、5天差异有统计学意义（P＜0．05），3?107与6?107组之间差异无统计学意义。12?107组第5天高于化疗组，差异无统计学意义（P=0．15），其余低于化疗组（图1）
。
Figure1．WBC recovery curve in conditions of different number donor cells．
白血病负荷
接种WEHI-3后3周，化疗对照组骨髓原始和幼稚细胞比例（23%）均明显高于（3、6、12）?107组（13%、7%、5%）（P＜0．01），3?107均高于（6、12）?107组（P＜0．05），6?107与12?107组间无明显差异（P＞0．05）。
从早期死亡率、白细胞恢复及白血病负荷方面综合考虑后，选取6?107个/只作为本实验最终微移植回输供体的细胞量。供体嵌合检测及GVHD 判定以此细胞量为标准。
供体嵌合检测
除肝、皮肤和肌肉组织的供体成分是回输后第3天比例最高外，其余大部分组织是回输后第1天最高，
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白血病小鼠H-2全不相合微移植模型的建立及鉴定
而后出现快速下降，在造血恢复后（7d 后），脾脏、皮肤、肌肉、胸腺、外周血及骨髓仍可检测到供体细
胞微量嵌合体存在，从（2．22E-03）%到（6．63E-02）%，在回输后10d 皮肤和胸腺组织仍可以检测
到的供体成分，
分别为（1．80E-03）%、（1．85E-03）%（表2）。各组织回输后2周未检测到供体成分。GVHD 情况
大体观察微移植组与化疗组小鼠在化疗后均有一过性活动量减少、皱毛、腹泻情况，两组相比无明显差异。两组小鼠均无弓背、皮疹或者皮肤溃疡。化疗后体重均有下降，停化疗第3天降至最低，两组均在停化疗第11天左右恢复至化疗前水平，两组差异无统计学意义（P ＞0．05）（图2）
。
Figure 2．Weight changes of mice in different groups．
病理组织学观察两组小鼠的组织病理切片无明显
差异，
肝脏：肝窦索结构完整，门静脉充血，少量淋巴细胞浸润，其中微移植组的肝细胞水肿情况较化疗组重，但无明显差异；脾脏两组相似，脾脏正常结构
存在，皮、髓质分布清楚，淋巴细胞丰富；小肠：两组无差异，小肠黏膜腺体减少，上皮细胞散在坏死，可见凋亡小体，腺窝细胞增生。微移植组小鼠疾病进展发生白血病时，各组织可见大量白血病细胞浸润，但无GVHD 病理表现（图3）。
讨论
本实验成功建立了白血病小鼠H-2全不相合微移植模型，在实验中观察到了微移植的安全性、促造血作
用、早期保护作用，供体植入率检测为微嵌合，在临床表现及病理方面均未发现明显GVHD 证据。
在促造血方面，微移植组小鼠比单纯化疗组白
细胞数恢复快，
但是动物实验效果没有临床明显［4］，分析主要的原因可能是：①小鼠造血恢复周期不同于人，小鼠化疗后造血抑制时间短、恢复快，平均抑制时间为3d －5d ；②本实验建立的微移植
模型为H-2全不相合，而临床上大部分供受体HLA
关系是半相合。受体未使用传统免疫抑制剂，保留了自身的免疫力，回输供体细胞后，在短期内有供受体细胞的消耗；③单纯化疗组小鼠早期死亡率高达25%，影响了其真实血象的记录，使化疗组存活小鼠
Table 2．Donor chimerism in different tissues of mice received microtransplantation （%）
Organ
Time after microtransplantation （d ）
1
371014Liver 5．49E-022．04E-01000Spleen 4．737．95E-032．22E-0300Lung 3．78E-011．16E-01000Intestine 1．10E-011．10E-02000Skin 3．06E-035．49E-025．22E-031．80E-030Muscle 08．05E-037．36E-0300Thymus 1．41E-023．62E-038．26E-031．85E-030BM 9．202．016．63E-0200PB
3．89
1．06E-01
4．89E-02
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287·中国实验血液学杂志J Exp Hematol 2014；22（3）
Figure3．Morphological changes of tissues in different mice．A：chemotherapy mice．B：microtransplantation mice．C：leuke-mia mice；a：liver．b：spleen．c：intestine（HE?400）．
血象最低点高于微移植组。以上原因使得微移植组较化疗组促造血优势不是十分明显，但从造血恢复的趋势和速率相比，微移植组恢复造血的优势还是较为突出的（图1）。微移植组早期死亡率比化疗组降低，提示微移植可以保护小鼠渡过早期危险时期，本课题在前期的动物实验证实微移植后小鼠骨髓较单纯化疗组造血组织旺盛，骨髓及脾脏集落数目高，提示微移植对小鼠造血组织具有保护作用。
微嵌合体最早是Starzl等［11］提出的，是指移植后受体体内供体细胞＜1%。检测微嵌合的诸多方法中以real-time PCＲ法最为快速、高效、敏感、准确［12］。ＲT-PCＲ检测Y染色体上的SＲY基因，在105个女性细胞中可监测到1个男性细胞，敏感度可达1/105－1/106［13，14］。本实验中使用ＲT-PCＲ法检测微移植后雌性受鼠体内的雄性供鼠嵌合率。结果发现，大部分组织中供鼠嵌合率是回输后第1天最高，少数组织是回输后第3天最高，而后均出现快速下降。在造血恢复后大部分组织仍可检测到供体微嵌合体存在，回输后10d皮肤和胸腺可以检测到供体微量成分存在。除脾、骨髓和外周血早期可一过性检测到供体成分＞1%外，供体基本上是以微嵌合形式存在的。各组织在回输后2周及2周后均未检测到供体成分，但本课题组前期利用小动物活体成像证实，微移植组小鼠供体成分可长期存在，本实验微移植组在2周后未检测到供体成分，分析可能与检测的敏感度有关。Ji等［15］动物实验研究指出，短期的主要组织或次要组织不相合供体的嵌合比例维持在3周以上，可能不需要长期稳定的植入就足以发挥GVL效应，尤其在残留白血病状态下的，这样即可避免GVHD的发生，又可发挥足够的GVL效应，实现了GVHD与GVL分离，微移植临床研究结果也有类似发现［4－5］。在后续的动物实验中证实，微移植组比单纯化疗组小鼠推迟2周发病，且生存期明显长于化疗组；动物水平也证实，在供体微嵌合状态下可发挥抗白血病作用。这些均提示微移植的GVL效应可能与微嵌合相关，具体机制尚待进一步研究。
微移植组小鼠与单纯化疗组相比，临床表现及病理检测均并未发现明显GVHD证据。微移植临床病例也没有发现GVHD发生［4－5］。Thomas等［16］指出，微移植很可能是分离GVL和GVHD的新模式。本课题组分析微移植组未见GVHD发生的机制，可能与微移植的理念有关，其在预处理中避免使用免疫抑制强的药物和方法，强调对受者免疫系统
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白血病小鼠H-2全不相合微移植模型的建立及鉴定
的保护，供体是以微嵌合体形式存在，但具体机制尚需深入研究。
本研究成功建立了白血病小鼠H-2全不相合微移植模型，为进一步的实验研究提供了模型基础，为临床微移植提供了动物实验基础。
参考文献
1Slavin S．Immunotherapy of cancer with alloreactive lymphocytes．N Engl J Med，2000；343（11）：802－803．
2Liungman P，Hakki M，Boeckh M．Cytomergalovirus in hematopoiet-ic stem cell transplant recipients．Hematol Oncol Clin North Am，2011；25（1）：151－169．
3傅华睿，黄河．非血缘造血干细胞移植现状与问题．中国实用内科学杂志，2011；31（2）：146－148．
4Guo M，Hu KX，Liu GX，et al．HLA-mismatched stem-cell micro-transplantation as postremission therapy for acute myeloid leukemia：long-term follow-up．J Clin Oncol，2012；30（33）：4084－4090．
5Guo M，Hu KX，Yu CL，et al．Infusion of HLA-mismatched periph-eral blood stem cells improves the outcome of chemotherapy for acute myeloid leukemia in elderly patients．Blood，2011；117（3）：936－941．
6McCormack E，Bruserud O，Gjertsen BT．Animal models of acute myelogenous leukemia-development，application and future perspec-tives．Leukemia，2005；19（5）：687－706．
7曹将，陈翀，曾令宇，等．供体Treg细胞对小鼠异基因骨髓移植后GVHD和GVL效应的影响．中国实验血液学杂志，2010；18
（1）：181－184．
8左洪莉，彭恩兰，刘铁强，等．CB6F1小鼠急性粒单核细胞白血病M4（AML-M4）模型的建立及鉴定．解放军医学杂志，2011；36（1）：53－57．
9陈静，李春．FK506和CSA对异体造血干细胞在粒单白血病小鼠存活及其血清IL-2和IL-4水平的影响．四川大学学报，2009；
40（3）：478－480．
10于明明，康白，李现军，等．小鼠粒单细胞白血病动物模型建立方法的研究。潍坊医学院学报，2005；27（6）：401－403．
11Starzl TE，Demetris AJ，Murase N，et al．Cell migration，chimerism，and graft acceptance．Lancet，1992；339（8809）：1579－1582．
12Gineikiene E，Stoskus M，Griskevicius L．Ｒecent advances in quanti-tative chimerism analysis．ExpertＲev Mol Diagn，2009；9（8）：817－832．
13Bader P，Niethammer D，Willasch A，et al．How and when should we monitor chimerism after allogeneic stem cell transplantation？Bone Marrow Transplant，2005；35（2）：107－119．
14Fehse B，Chukhlovin A，Kuhlcke K，et al．Ｒeal-time quantitative Y chromosome-specific PCＲ（QYCS-PCＲ）for monitoring hematopoietic chimerism after sex-mismatched allogeneic stem cell transplantation，J Hematother Stem CellＲes，2001；10（3）：419－425．
15Ji YH，Wiss L，Slavin S，et al．Allogeneic cell-mediated immuno-therapy of leukemia with immune donor lymphocytes to upregulate an-titumor effects and downregulate antihost responses，Bone Marrow Transplant，2003；32（5）：495－504．
16Spitzer TＲ．Microtransplantation：a New Paradigm For The Separa-tion of Graft Versus Host Disease and Garft Versus Tumor？J Clin Oncol，2012；30（33）：4051－4052．
·
487
·中国实验血液学杂志J Exp Hematol2014；22（3）
二十种常见实验动物模型
二十种常见实验动物模型 一、缺铁性贫血动物模型 缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）是体内用来合成血红蛋白（HGB）的贮存铁缺乏，HGB合成减少而导致的小细胞低色素性贫血，主要发生于以下情况：（1）铁需求增加而摄入不足，见于饮食中缺铁的婴幼儿、青少年、孕妇和哺乳期妇女。（2）铁吸收不良，见于胃酸缺乏、小肠粘膜病变、肠道功能紊乱、胃空肠吻合术后以及服用抗酸和H2受体及抗剂等药物等情况。（3）铁丢失过多，见于反复多次小量失血，如钩虫病、月经量过多等。 IDA是一种多发性疾病，据报道，在多数发展中国家，约2/3的儿童和育龄妇女缺铁，其中1/3患IDA，因此，研究IDA的预防和治疗具有重要的意义。在这些研究中，缺铁性贫血的动物模型（Animal model of IDA），又是实施研究的基础工具。常见的IDA动物模型的构建技术如下： 实验动物：一般选用SD大鼠，4周龄，雌雄不拘，体重65g左右，HGB≥130g/L。 建模方法：低铁饲料加多次少量放血法。低铁饲料一般参照AOAC 配方配制，采用EDTA浸泡处理以去除饲料中的铁，饲料中的含铁量是诱导SD大鼠形成缺铁性贫血模型的关键，现有研究表明，饲喂含铁量<15.63mg/Kg的饲料35天，SD大鼠出现典型IDA表现，而饲喂
含铁40.30mg/Kg的饲料SD大鼠出现缺铁，但并不表现贫血症状。建模时一般采用去离子水作为动物饮水，以排除饮水中铁离子的影响。少量多次放血主要用于模拟反复多次小量失血导致的铁丢失，还可以加速贫血的形成。放血一般在低铁饲料饲喂2周后进行，常用尾静脉放血法，1～1.5ml/次，2次/周。 模型指标：（1）HGB≤100g/L；（2）血象：红细胞体积较正常红细胞偏小，大小不一，中心淡染区扩大，MCV减小、MCHC降低；（3）血清铁（SI）降低，常小于10μmol/L，血清总铁结合力（TIBC）增高，常大于60μmol/L。 需要指出的是，以上模型不能用于铁吸收不良相关IDA的防治研究。根据具体的研究需要，也可以适当调整建模方法。 二、白血病动物模型 用免疫耐受性强的人类胎儿骨片植入重症联合免疫缺陷病(SCID)小鼠皮下，出于人类造血细胞与造血微环境均植入小鼠，建立具有人类造血功能的SCID小鼠模型称为SCID－hu小鼠。再将髓系白血病患者的骨髓细胞植入SCID－hu小鼠皮下的人类胎儿骨片内，植入的髓系白血病细胞选择性生长在SCID－hu小鼠体内的人类造血微环境中，即为人类髓系白血病的小鼠模型。SCID小鼠是由于其scid所致。T、B淋巴细胞功能联合缺陷，这种小鼠能接受人类器官移植物。 造模方法：
通络救脑注射液对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆及氧化应激反应的影响
2012年12月1日第12期No．12 1 Dec． 2012 中医学报 CHINA JOURNAL OF CHINESE MEDICINE 第27卷总第175期Vol．27 Serial No．175 *基金项目：北京中医药大学自主课题(编号:2011－JYBZZ － XS077) 通络救脑注射液对阿尔茨海默病模型大鼠学习 记忆及氧化应激反应的影响 * Effects of Tongluo Jiunao Injection on learning and memory and oxidative stress response for Alzheimer's Disease Rat Models 刘洋Liu Yang 1，李澎涛Li Pengtao 2，刘希伟Liu Xiwei 1，南一楠Nan Yinan 1，都文渊Du Wenyuan 1 1．北京中医药大学基础医学院中西医结合基础(病理)，北京110029 Integration of Traditional Chinese Medicine and Western Medicine Subject (Pathology )in Basic Medical College of Beijing University of Traditional Chinese Medicine ， Beijing ，China 1100292．北京中医药大学东直门医院，北京100700 Dongzhimen Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine ，Beijing ，China 100700 摘要：目的:探讨通络救脑注射液(Tong Luo Jiu Nao injection ， TLJN )对阿尔茨海默病(Alzheimer ’s Disease ，AD )模型大鼠的防治作用及其抗氧化机制。方法:采用脑内定位注射β淀粉样蛋白(βamyloid1-42)建立AD 大鼠模型，在模型建立成功的同时给予TLJN 治疗。采用Morris 水迷宫进行AD 大鼠的行为学检测，用化学比色法检测大脑皮质丙二醛(MDA )的含量。结果:与正常组比较，AD 模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P ＜0．01)，目标象限停留时间明显缩短(P ＜0．01);TLJN 治疗组大鼠逃避潜伏期明显缩短(P ＜0．05)，目标象限停留时间明显增加(P ＜0．05)。AD 模型组大鼠脑皮质中MDA 含量增加(P ＜0.01);TLJN 治疗组，脑皮质MDA 含量显著减少(P ＜0．01)。结论:TLJN 具有改善学习记忆能力，对抗大鼠神经系统的退行性病变有一定的作用，可能通过抑制AD 模型大鼠脑皮质MDA 产生发挥其保护作用。 Abstract :Objective :To explore the preventive and therapeutic effect and anti-oxidation mechanism of Tong Luo Jiu Nao injection (TLJN )in Alzheimer's Disease (AD )rat models．Methods :The AD rat model was established by injecting β-amyloid1-42into the rat brain ，and successful model rats were given TLJN injection treatment at the same time．The behavioral changes of the AD rats were test-ed with Morris water maze．Chemical colorimetry was used to measure malondialdehyde (MDA )content in the cerebral cortex．Results :Compared with the control group ，the escape latent period of AD rats was significantly longer (P ＜0．01)，retention time of the target quadrant significantly obviously reduced (P ＜0．01);After TLJN treatment ，the escape latent period of AD rats was significantly shorter (P ＜0．05)，and retention time of the target quadrant was significantly increased (P ＜0．05)．In AD model group ，the MDA content in cerebral cortex was increased significantly (P ＜0．01);while after TLJN treatment ，the MDA content in cerebral cortex was decreased obviously (P ＜0．01)．Conclusions :TLJN treatment has certain effects on improving learning and memory ability of AD rats and resisting retrogression of rats nervous system ，and plays protective role in AD rats possibly via inhibiting the production of MDA．关键词：阿尔茨海默病;通络救脑注射液;Morris 水迷宫;学习记忆;氧化应激反应;大鼠 Key words :Alzheimer's Disease (AD );Tongluo Jiunao injection ;Morris water maze ;learning-memory ;oxidative stress response ;rat 中图分类号CLC number ：R285．5 文献标识码Document code ：A 文章编号Article ID ：1674－8999（2012）12－1614－03阿尔茨海默病（Alzheimer ’ s Disease ，AD ）是一种继心血管病、癌症、脑卒中后严重威胁人类健康的高发性神经退变性疾病。但目前临床上对于AD 的病因和发病机制尚不完全清楚， 对于其治疗仍旧是一个世界性的难题。近些年来，对于AD 的发病机制研究方面取得了很多进展，主要集中在遗传因素、环境因素、免疫-炎性机制、氧化应激和细胞凋亡等方面，而氧化应激在AD 中的作用越来越受到研究者的重视。结合本研究团队多年体内外实验研究， 发现AD 的中医病机关键为“毒损脑络”［1-2］ 。因此，本实验采用大鼠双侧海 马注射A β1-42这一致毒片段以模拟“毒损脑络”病证，观察“毒损脑络”病证下AD 大鼠学习记忆变化情况及氧化应激反应的改变，采用针对该中医病机关键具有解毒通络作用的中药复方通络救脑注射液进行干预， 通过Morris 水迷宫行为学检测方法观察药物干预后大鼠学习记忆的改善情况及通络救脑注射液的作用机制，为通络救脑注射液的临床应用提供体外实验依据。 1 材料与方法 1．1 动物分组 清洁级雄性SD 大鼠32只，体质量（250?20）g ，购自北 京维通利华实验动物中心。随机分成正常对照组（正常组）、 A β海马注射组（模型组）、A β海马注射+通络救脑注· 4161·
肿瘤动物模型的构建——白血病篇
肿瘤动物模型的构建——白血病篇 导读白血病( Leukemia )是一种常见的恶性血液疾病，俗称血癌。据统计，白血病是儿童恶性肿瘤的头号原因，在儿童及35 岁以下成人中发病率位居第一[1] 。同时也是十大恶性肿瘤之一。目前，白血病具体的发病原因至今尚未研究透彻，因此建立合适的白血病动物模型，对于白血病发病机制及药物研发具有重要意义。本期为大家综述了白血病的基本情况及小鼠模型的分类、建立方法和应用。 第一章：白血病基本常识白血病是常见液体瘤白血病是常见的液体瘤，与结肠癌、肝癌等实体瘤不同的是，它是造血干细胞的异常分化和过度增殖导致，因此肿瘤细胞会遍布全身，会侵犯身体的每个脏器，造成全身衰竭。造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，具有长期自我更新和分化成各类成熟血细胞的能力。如下图为造血干细胞可分类形成各种血细胞，如红细胞、血小板和白细胞：造血干细胞分化成各类血细胞(图片来自https://www.wendangku.net/doc/354292597.html, 网站) 白血病致病因素有哪些呢？ 现阶段认为白血病的发病因素：化学因素、电离辐射、药物、毒物、病毒、遗传因素等有关。 白血病主要分为四类 根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性
和慢性两大类，临床上，白血病共分为四大类：急性髓系白 血病（AML ）、急性淋巴细胞白血病（ALL ）、慢性髓系白血病（CML ）和慢性淋巴细胞白血病（CLL ）。儿童白血病90% 以上是急性的，其中急性白血病中70% ～80%是ALL。第二章：实验研究所用白血病模型首先，来了解一下常用 的细胞株白血病中常用的小鼠品系用于建立白血病小鼠模型的小鼠可分为近交系和突变系。根据不同类型和目的选择不同的小鼠品系，具体如下图所示：最后说说常用的动物模型，主要分为三类： 一、异种移植模型异种移植模型是最常用的淋巴瘤动物模型。根据实验目的选择相应的小鼠品系和细胞株后，通常细胞的接种方式为皮下注射、腹腔注射和尾静脉注射。 皮下注射和腹腔注射操作简单，很快在接种部位形成肿瘤或 腹腔内形成多发性肿瘤，适合筛选针对白血病的药物。但该 类模型与白血病临床病人实际情况差距较大。异种移植型白 血病模型异种移植示意图[2] 尾静脉注射接种模型，可形成全身性扩散的白血病模型。符 合白血病临床过程规律，此模型以动物生存期作为评价药效 的主要指标，并对采血样本进行血细胞的形态学检测。下面以尾静脉注射模型实验步骤为例： 根据实验目的选择实验小鼠和细胞（如NOD-SCID 小鼠和人急性早幼粒细胞白血病细胞株）；荷瘤细胞量一般1-2 ×
阿尔茨海默病动物模型研究进展
阿尔茨海默病动物模型研究进展 发表时间：2019-09-23T09:21:11.433Z 来源：《医药前沿》2019年22期作者：朱恒延郭燕君（通讯作者） [导读] 阿尔茨海默病动物模型是研究人类阿尔茨海默病发病机制和寻求治疗方法的重要工具。 (嘉兴学院医学院浙江嘉兴 314001) 【摘要】阿尔茨海默病动物模型是研究人类阿尔茨海默病发病机制和寻求治疗方法的重要工具。本文在总结近年来最新研究成果的基础上系统阐述阿尔茨海默病研究中常用的动物模型，为AD的生物性特征和预防研究提供帮助。 【关键词】阿尔茨海默病; 动物模型; 研究进展 【中图分类号】R745 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）22-0010-02 Research progress of animal models of Alzheimer's disease Zhu Hengyan,Guo Yanjun (communications author) Medical College of Jiaxing University, Jiaxing, Zhejiang 314001, China 【Abstract】Animal model of Alzheimer's disease is an important tool for studying the pathogenesis of human alzheimer's disease and seeking for treatment. On the basis of summarizing the latest research achievements in recent years, this paper systematically describes the animal models commonly used in Alzheimer's disease research, providing help for the biological characteristics and prevention of AD. 【Key words】Alzheimer's disease; Animal model; Research progress 阿尔茨海默病是以进行性记忆缺失和痴呆为特征的神经退行性疾病。65岁前发病称早老性家族性痴呆；65岁后发病称迟发的老年性痴呆。典型病理变化为细胞外由β淀粉样蛋白(Amyloid-β，Aβ)形成的老年斑块，过度磷酸化的tau蛋白组成的神经元纤维缠结［1］。AD分为早发的家族性AD(Familial AD，FAD)和迟发的散发性 AD(Sporadic AD,SAD)。SAD发病机制主要与遗传和环境有关。胰岛素通路和能量代谢障碍、糖尿病，脑外伤，神经炎症反应以及Apo Eε4等位基因等都是AD的危险因素［2］。目前尚无有效安全的治疗AD的方法及药物。科学家们一直试图建立与AD发病机制接近的灵长类动物模型。本文着重探讨与AD相关的转基因动物模型和灵长类动物模型的现状及特点作一综述。 1.AD相关的转基因模型的特点 研究证实多数 FAD患者是由PSEN1突变所致［3］，PSEN1第4～12外显子之间是主要基因突变位点，近年来，研究者们建立了几种AD PSEN1基因突变的转基因模型，包括PSEN1(A246E)[4]、PSEN1(M146L)[4]、PSEN1(M146V)[4]、PSEN1(P264L)[4]、 PSEN1(P117L)[4]、PSEN1-YAC[4]等。研究者们发现携带人PSEN1突变的转基因AD小鼠不能模拟出FAD的典型特征，因此转入人PSEN1基因突变的同时加入PSEN2其他突变基因，用这种方法成功建立了十多种转基因AD小鼠，而且十多种AD转基因小鼠都能能表现出FAD部分神经病理学特征和行为学上的改变。目前AD转基因小鼠是研究阿尔茨海默病发病机理和治疗方面经典的动物模型，但是已知的这些PSEN1转基因模型小鼠同时不能模拟FAD的全部神经行为学和病理学特征。灵长类动物由于在生理结构和生物化学方面与人类高度相似。因此急需建立一种灵长类非人动物模型，探索这种模型是否能够更好的模拟FAD的多种神经行为学及病理学的特征。 2.FAD灵长类非人动物模型研究现状 近十几年来，随着转基因技术进步和灵长类动物转基因技术的发展，使得建立灵长类非人阿尔茨海默病转基因模型成为可能[5]。由于从发病机制上看FAD是由APP或PSEN1、PSEN2突变所致，专家们尝试将结合其他突变基因(PSEN2、APP和 MAPT) 和PSEN1突变来建立FAD转基因灵长类非人动物模型。上述方法在理论上能够模拟出FAD的发病原因和疾病特征，而且可以通过遗传保种，在建立模型动物群体方面表现出优势。但是灵长类非人阿尔茨海默病转基因动物模型面临严峻的问题：（1）转入AD致病基因的灵长类非人转基因动物通常需十几年才呈现AD特征性的神经病理学和行为学改变，灵长类动物模型效率低、成本高，尚未见成功模型报道；（2）短期难以开展对转基因的个体开展临床病理鉴定和行为学的评价。PSEN1在灵长类动物中非常保守。有关非人灵长类动物中AD基因突变是否与人类相似方面的研究较少。John J．Ely发现一只黑猩猩PSEN1突变[5]，其PSEN1突变的特征未知；与其他年龄及性别相匹配的未突变PSEN1黑猩猩相比，其是否出现神经退行性病理改变和行为学变化均不知道；其子代是否有PSEN1基因突变、行为学及病理变化是否出现等还没有报道。 目前AD尚未研制出安全有效的药物和方法，迫切需要能模拟AD经典病理变化的理想动物模型，以前建立在啮齿类的动物模型各有优缺点，不能全面体现AD的病例神经行为学方面的全部改变。目前被大家所认可的转基因动物模型也有待完善。利用基因筛选和基因修饰分子生物学技术建立AD灵长类非人动物模型意义重大，对于进一步明确发病机理，AD药物的治疗、开发和筛选，早期诊断有重要的应用价值和前景。 【参考文献】 [1] Grundke-Iqbal I,Iqbal K,Tung YC,et.al.Abnormal phosphorylation of the microtubule associated protein tau(tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology.Proc Natl Acad Sci U S A 83(13):4913-4917. [2] Iqbal K,Grundke-Iqbal I.Alzheimer's disease,a multifactorial disorder seeking multitherapies.Alzheimers Dement 6(5):420-424. [3] Ballard C,Gauthier S,Corbett A,et al.Alzheimer’s disease[J].Lancet 2011,377(9770):1019-1031． [4] Wen P H,Shao X,Shao Z,et al.Overexpression of wild type but not an FAD mutant presenilin-1 promotes neurogenesis in the hippocampus of adult mice[J].Neurobiol Dis,2002,10(1):8-19． [5] Chan A W.Progress and prospects for genetic modification of nonhuman primate models in biomedical research[J].ILAR J,2013,54(2):211-223． [6] Joseph M.Erwin P RH J.One Gerontology:Advancing Understanding of Aging through Studies of Great Apes and Other Primates[M].Aging in Nonhuman Primates，Erwin Jm H P,Basel:Interdiscipl Top Gerontol,Karger,2002:31,1-21. 基金项目：浙江省科技计划项目(2017C37173);嘉兴学院南湖学院重点SRT资助项目(NH85178445)；2016年度浙江省教育技术研究规划课题(JB039)
小鼠肿瘤模型
小鼠肿瘤模型 肿瘤模型我们一般常用的就是小鼠模型和人肿瘤裸小鼠移植瘤模型。其中用得最多的是皮下模型，另外还有腹水（或者尾静脉注射）以及原位模型，其他的模型很少用，就不提他们了。 小鼠模型分三大类：第一类是以S180、EAC、H22等为代表的，他们的宿主小鼠多选用KM，可产生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水传代，实验时抽取腹水，经过一定稀释后皮下接种构建模型，接踵后第二天开始给药，给药7到10天，接种10天后结束试验，剥取肿瘤称瘤重。 1. 关于构建瘤种 可以用体外细胞株培养后，用PBS悬浮至1~3×106/0.1ml/mouse，i.p接种即可，最好用6号左右的针头，就是常用的2ml一次性注射的针头。 2. 关于腹水传代 观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约8~9天左右），可以传代，传代时取1ml 注射器，用2ml注射器的针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点，还可以把老鼠拎起来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，一般抽个0.5ml就可以了，不用离心，直接用PBS3~6倍稀释后，接种到新的老鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的，但是血性腹水说明不好，需要注意调整，第二代以后，尽量6~7天的时候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易血性。三代后可用于试验。 3. 关于接种进行试验 这个时候抽取的腹水需要量比较多，一般需要处死种鼠后，小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子（最好是哪种前面有倒勾的镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开一个小口，然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。然后进过一定的稀释后，接种到小鼠的腋下。关于稀释量，各个实验室的情况都不一样，最好摸索一下，开始的时候可以适当的计数，但是要用台盼兰染色后计活细胞数。接种部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋窝里面，会给以后的操作带来麻烦。接种时的进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容易污染。有的人接种的时候喜欢针头向上用力，紧贴着表皮往里走，然后注射的时候感觉阻力较大，打出来的皮丘又紧又圆，这样的接种，会使肿瘤与皮肤严重粘连，不利于最后肿瘤的剥取。也不要紧靠肌肉，肿瘤会与肌肉严重粘连。应该在两者之间，进针的感觉轻松自如，针头很自由，虽然打出来的肿瘤不会很圆很漂亮，但是相对好剥取一些。 4. 关于观测指标 主要是按时称体重，试验结束后剥取肿瘤称瘤重。因为出瘤已经是接种后的第6天左右了，第10天就结束时间，瘤体积的数据意义就不大。小鼠肿瘤很难剥，这是没有办法的，只能耐心，没有太好的办法，剥多了以后，手上会掌握一些巧力，有一些帮助，但是我们还是很头痛小鼠肿瘤试验结束。肿瘤组织周围经常会有一些血窦的形成，弄破后会有血和黄色的液体流出，正常的，但是剥瘤子的时候不要把它弄破，会严重影响瘤重。按照SFDA的规定，平均瘤重小于1g，或
常用疾病动物模型
常用疾病动物模型 上海丰核可以为广大客户提供各种疾病动物模型定制服务，同时提供相关疾病模型的药物敏感性实验分析服务。 客户只需要提供疾病模型的用途及建模方法的选择，我们会根据客户的具体要求量身定做各种动物模型服务。
小鼠或裸 鼠 加贴近实际（八）心血管疾病模型 1. 动脉粥样硬化（高脂高胆固醇+维生素D喂养）兔高脂、高胆固醇饲喂兔造模，成 膜后血脂变化显著，为伴高血脂 症的动脉粥样硬化 4月血管组织病 理切片染色 2. 主动脉粥样硬化（高脂高胆固醇+主动脉球囊损伤）兔此模型用大球囊损伤加高脂饲 养方法成功建立兔主动脉粥样 硬化狭窄的动物模型，为相关基 础研究提供可靠模型。 2月动物实验模型病理切片展示 一、CCl4诱导的肝脏纤维化 简介：肝纤维化是肝细胞坏死或损伤后常见的反应，是诸多慢性肝脏疾病发展至肝硬化过程中的一个中间环节。肝纤维化的形成与坏死或炎症细胞释放的多种细胞因子或脂质过氧化产物密切相关。CCl4为一种选择性肝毒性药物，其进入机体后在肝内活化成自由基，如三氯甲基自由基，后者可直接损伤质膜，启动脂质过氧化作用，破坏肝细胞的模型结构等，造成肝细胞变性坏死和肝纤维化的形成。通过CCl4复制肝纤维化动物模型通常以小鼠或大鼠为对象，染毒途径主要为灌胃、腹腔注射或皮下注射。 动物模型图. 经过3个月的CCl4注射造模，小鼠的肝脏在中央静脉区形成了比较明显的肝纤维化，中央静脉之间形成了纤维桥接。（Masson染色） 二、CXCL14诱导的急性肝损伤动物模型
简述：CCl4是最经典的药物性肝损伤造模毒素之一，其在肝内主要被微粒体细胞色素P450氧化酶代谢，产生三氯甲烷自由基和三氯甲基过氧自由基，从而破坏细胞膜结构和功能的完整性，引起肝细胞膜的通透性增加，可溶性酶的大量渗出，最终导致肝细胞死亡，并引发肝脏衰竭。根据CCl4代谢和肝毒性机制可复制不同的肝损伤模型，其中给药剂量和给药方法是其技术关键。对于复制急性肝衰竭动物模型，往往采用大剂量一次性灌胃或腹腔注射给药。 图. (A) CCl4注射后0.5 d的HE染色表明CXCL14过表达增加了肝脏组织的嗜酸性变性面积(在照片中用虚线标记)(p < 0.05)。 (B) 1.5天组织样本的HE染色表明CXCL14过表达造成了比对照组更大面积的细胞坏死(p < 0.05)。 (C)同时还造成了中央静脉周围肝细胞中明显的脂肪滴积累。图中P和C分别表示动物模型的门静脉和中央静脉。KU指凯氏活性单位。 细胞凋亡检测结果 TUNEL标记没有显示CXCL14免疫中和小鼠和对照小鼠在凋亡细胞数量上的差异。C0, C1和C2分别是对照组0 d，1 d,和2 d样本，T1
肿瘤动物模型的构建——白血病篇知识讲解
肿瘤动物模型的构建——白血病篇
肿瘤动物模型的构建——白血病篇 导读白血病（Leukemia）是一种常见的恶性血液疾病，俗称血癌。据统计，白血病是儿童恶性肿瘤的头号原因，在儿童及35岁以下成人中发病率位居第一[1]。同时也是十大恶性肿瘤之一。目前，白血病具体的发病原因至今尚未研究透彻，因此建立合适的白血病动物模型，对于白血病发病机制及药物研发具有重要意义。 本期为大家综述了白血病的基本情况及小鼠模型的分类、建立方法和应用。 第一章：白血病基本常识白血病是常见液体瘤 白血病是常见的液体瘤，与结肠癌、肝癌等实体瘤不同的是，它是造血干细胞的异常分化和过度增殖导致，因此肿瘤细胞会遍布全身，会侵犯身体的每个脏器，造成全身衰竭。 造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，具有长期自我更新和分化成各类成熟血细胞的能力。如下图为造血干细胞可分类形成各种血细胞，如红细胞、血小板和白细胞： 造血干细胞分化成各类血细胞（图片来自https://www.wendangku.net/doc/354292597.html,网站）白血病致病因素有哪些呢？ 现阶段认为白血病的发病因素：化学因素、电离辐射、药物、毒物、病毒、遗传因素等有关。
白血病主要分为四类 根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类，临床上，白血病共分为四大类：急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性髓系白血病（CML）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）。儿童白血病90%以上是急性的，其中急性白血病中70%～80%是ALL。 第二章：实验研究所用白血病模型首先，来了解一下常用的细胞株白血病中常用的小鼠品系 用于建立白血病小鼠模型的小鼠可分为近交系和突变系。根据不同类型和目的选择不同的小鼠品系，具体如下图所示： 最后说说常用的动物模型，主要分为三类： 一、异种移植模型 异种移植模型是最常用的淋巴瘤动物模型。根据实验目的选择相应的小鼠品系和细胞株后，通常细胞的接种方式为皮下注射、腹腔注射和尾静脉注射。 皮下注射和腹腔注射操作简单，很快在接种部位形成肿瘤或腹腔内形成多发性肿瘤，适合筛选针对白血病的药物。但该类模型与白血病临床病人实际情况差距较大。异种移植型白血病模型异种移植示意图[2]
白血病小鼠H_2全不相合微移植模型的建立及鉴定
文章编号（Article ID ）：1009－2137（2014）03－0779－06 ·论著· 白血病小鼠H-2全不相合微移植模型的建立及鉴定吴惠惠，刘铁强，孙雪冬，黄晓梅，张锐，刘志强，满秋红，黄雅静， 孙琪云，左红莉，乔建辉，余长林，胡锴勋，艾辉胜，郭梅 * 军事医学科学院附属医院血液科，北京100071 摘要本研究旨在建立白血病小鼠H-2全不相合微移植模型并进行鉴定。受、供鼠分别为雌性BALB /c 和雄性 C57BL /6J ，H-2为全不相合。受鼠微移植前5d 静脉接种WEHI-3细胞约1?106 个，微移植前3d 开始给予MA 化疗（米托蒽醌+阿糖胞苷），0d 末次化疗后8h 之内回输经G-CSF 动员的供体脾单个核细胞，回输细胞数分别为 （3、6、12）?107 个。化疗对照组用等量生理盐水。所有受鼠不予GVHD 预防。比较各组早期死亡率、白细胞恢复及白血病负荷情况。ＲT-PCＲ法检测微移植后供体嵌合率。从临床表现和病理情况综合评价微移植组小鼠GVHD 情况。结果表明，化疗对照组早期死亡率为25%， （3、6、12）?107组分别为16．67%、8．33%、8．33%。（3、6）?107组白细胞恢复明显优于化疗对照和12?107 组（P ＜0．05）。白血病负荷（3、 6、12）?107组明显低于化疗对照组（P ＜0．01），而（6、 12）?107组明显低于3?107组（P ＜0．05）。微移植后供体成分在2周之内以微嵌合形式存在。微移植组小鼠均未发生明显GVHD 证据。结论：成功建立了白血病小鼠H-2全不相合微移植模型，为后续研究及临床微移植相关研究提供了基础。 关键词 白血病小鼠；H-2全不相合；微移植；微移植模型；微嵌合中图分类号Ｒ733．7；Ｒ332文献标识码A doi ：10．7534/j．issn．1009-2137．2014．03．038Establishment and Identification of a H-2Completely Mismatched Microtransplantation Model of Leukemia Mouse WU Hui-Hui ，LIU Tie-Qiang ，SUN Xue-Dong ，HUANG Xiao-Mei ，ZHANG Ｒui ，LIU Zhi-Qiang ， MAN Qiu-Hong ，HUANG Ya-Jing ，SUN Qi-Yun ，ZUO Hong-Li ，QIAO Jian-Hui ，YU Chang-Lin ， HU Kai-Xun ，AI Hui-Sheng ，GUO Mei * Department of Hematology ，Affiliated Hospital ，Academy of Military Medical Sciences ，Beijing 100071，China * Corresponding Author ：GUO Mei ，Associate Senior Physician．E-mail ：guom 196801@aliyun．com Abstract This study was purposed to establish and identify a H-2completely mismatched microtransplantation model of leukemia mouse．The recipients were female BALB /c mice ，while donors were male C57BL /6J mice．Ｒecipients were inoculated intravenously with 1?106of WEHI-3cells ，a cell line of myelomonocytic leukemia．Donors received 100μg /kg G-CSF mobilization through hypodermic injection ，every 12hours ，and it last 5days．Chemotherapy regi-mens was MA （mitoxantrone +cytarabine ），and it last 4days．Ｒecipients were given chemotherapy conditioning without GVHD prophylaxis after inoculation of leukemic cells for 2days ，and within 8hours after last chemotherapy received do-nor mobilized spleen mononuclear cells （sMNC ）．The number of sMNC was （3、6、12）?107，respectively．The early death rate ，recovery level of WBC in peripheral blood and leukemia load were compared between chemotherapy and mi-crotransplantation groups．The donor chimerism was detected by ＲT-PCＲ．From the clinical manifestation and pathologi-cal features ，the GVHD in recipients was evaluated．The results showed that the early mortality in chemothearpy group was 25%，meanwhile those in the （3、6、12）?107groups were 16．67%、8．33%、8．33%，respectively．The （3、6）?107groups has a stronger hematopoietic recovery capability than that in chemotherapy and 12?107groups （P ＜0．05）．There were more leukemic cells in chemothearpy mice than that in microtransplantation mice （P ＜0．01），and （12、6）?107groups had lower leukemia load than that in 3?107group （P ＜0．05）．No signs of GVHD were observed in microtrans-plantation mice．The donor microchimerism could be discovered at eraly 2weeks after donor cell transfusion．It is con-cluded that a H-2completely mismatched microtransplantation model of leukemia mouse has been successfully estab-lished ，and it will provide a experimental base for studing microtransplantation in clinic．Key words leukemia mouse ；H-2completely mismatched ；microtransplantation ；microtransplantation model ；mi-crochimerism J Exp Hematol 2014；22（3）：779－784 基金项目：国家自然科学基金面上项目（861739）；国家自然科学基金重点项目（81130054）；首都临床特色应用研究（Z1211070001012082）* 通讯作者：郭梅，副主任医师， E-mail ：guom196801@aliyun．com 2014－03－11收稿；2014－03－25接受 · 977·中国实验血液学杂志Journal of Experimental Hematology 2014；22（3）：779－784
小鼠肿瘤模型
肿瘤模型我们一般常用的就是小鼠模型和人肿瘤裸小鼠移植瘤模型。其中用得最多的是皮下模型，另外还有腹水（或者尾静脉注射）以及原位模型，其他的模型很少用，就不提他们了。 小鼠模型分三大类：第一类是以S180、EAC、H22 等为代表的，他们的宿主小鼠多选用KM可产生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹 水传代，实验时抽取腹水，经过一定稀释后皮下接种构建模型，接踵后第二天开始给药，给药7到10天，接种10天后结束试验，剥取肿 瘤称瘤重。 1.关于构建瘤种 可以用体外细胞株培养后，用PBS悬浮至1~3X 106/mouse,接种 即可，最好用6号左右的针头，就是常用的2ml 一次性注射的针头。 2.关于腹水传代 观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约8~9 天左右），可以传代，传代时取1ml注射器，用2ml注射器的针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点，还可以把老鼠拎起来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，一般抽个就可以了，不用离心，直接用P BS3~6倍稀释后，接种到新的老 鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的，但是血性腹水说明不好，需要注意调整，第二代以后，尽量6~7 天的时候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易血性。三代后可用于试验。 3.关于接种进行试验 这个时候抽取的腹水需要量比较多，一般需要处死种鼠后，小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子（最好是哪种前面有倒勾的镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开一个小口，然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。然后进过一定的稀释后，接种到小鼠的腋下。关于稀释量，各个实验室的情况都不一样，最好摸索一下，开始的
白血病小鼠模型的建立与应用现状_周晓燕
白血病是造血组织的恶性增殖性疾病，其特点是骨髓及其它造血组织中大量无核细胞无限制增生，进入外周血液，临床表现以骨髓、脾、肝等造血器官中的白血病细胞恶性增生与肿大，并浸润到全身各组织脏器中，伴有不同程度的贫血、出血、感染发热以及骨骼疼痛。白血病的发病率和死亡率逐年增加，居35岁以下青少年恶性肿瘤的首位。 小鼠（mouse，musculus）属哺乳纲（Mammalia）啮齿目（Rodentia）鼠科（Muridae）动物，在遗传学与造血系统等方面和人类十分相似，因此建立小鼠白血病模型以研究人类白血病的细胞分子生物学特性、生化免疫特征、病理生理改变、发病机制以及药物治疗和预后具有重要意义，本文就白血病小鼠模型的建立与应用现状进行综述。 1 建立白血病模型的小鼠种类 目前最常用于建立白血病模型的有近交系（inbred strain）和突变系（mutant strain）小鼠。 1.1 近交系（inbred strain）小鼠 主要包括：BALB/c小鼠、C57BL小鼠、AKR 小鼠、L615小鼠等。 1.1.1 BALB/c小鼠：基因型为Aabbcc，毛白色，其特征是肝、脾等富于网状内皮细胞的器官所占与体重比值较大。BALB/c小鼠的白血病发病率雌性为12%，雄性为10%，对放射线极度敏感，常用于单克隆抗体和免疫学研究，在白血病研究中较常使用。 1.1.2 C57BL小鼠：基因型为aaBBCC，毛黑色，对Graf?白血病因子较敏感，而对化学致癌物诱导作用敏感性低，但全身经放射线照射后，淋巴瘤发生率可达90%~100%。Noren nystrm等[1]用C57BL/6小鼠建立了T淋巴细胞白血病动物模型来评价血管形成抑制因子TN P2470的抗肿瘤效应。 1.1.3 AKR和 C58自发白血病小鼠：其它近交系小鼠还有AKR和 C58自发白血病小鼠。AKR小鼠最早由洛克菲勒大学随机交配而得，后获得“淋巴瘤病”原种，继而选择培育成白血病高发品系，基因型为aaBBcc，带Thy-la基因，缺乏补体C5，容易诱发免疫耐受性，对白血病因子敏感。当AKR小鼠发育 白血病小鼠模型的建立与应用现状 周晓燕 邹琳★ [摘 要] 小鼠是白血病研究中最重要的动物模型，本文主要综述了白血病小鼠模型的建模方法和研 究进展，以及白血病小鼠模型在医学领域中的应用。 [关键词] 白血病；小鼠；动物模型 Establishment and application of leukemia mouse model ZHOU Xiaoyan，ZOU Lin★ (Center for Clinical Molecular Medicine at Children's Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400014, China) [ABSTRACT] The mouse is one of the most important animal models in the leukemia study. Here, we mainly reviewed the establishment methods, research progress, and the application of leukemia mice model in the medical ?led. [KEY WORDS] Leukemia; Mouse; Animal model 基金项目：国家自然科学基金（90919013，30871103）；重庆市自然科学基金（CSTC2008BB5072，CSTC2010BA5008）；教育部“新世纪优秀人才支持计划”（2008-CET） 作者单位：重庆医科大学附属儿童医院临床分子医学中心，重庆 400014 ★通讯作者：邹琳，E-mail: zoulin_74@https://www.wendangku.net/doc/354292597.html, ?综述?