cellsearch循环肿瘤细胞ctc)试剂盒说明书自译中文版

7900001

16人份试剂盒

Cell Search

循环肿瘤细胞检测试剂盒

（上皮细胞）

IVD

使用须知

本试剂盒仅用于体外诊断

CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒用于外周血中循环肿瘤细胞（CTC）的计数，这些细胞来源于上皮细胞，即表现为CD45阴性（CD45-），EpCAM阳性（EpCAM+），细胞角蛋白8,18阳性（CK8,18+）和（或者）CK19阳性(CK19+)的细胞。

用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒检测的CTC，存在于外周血中，这类细胞与乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌*转移患者的无进展生存期和总生存期相关。因此，CTC可以用来监控乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的肿瘤细胞是否发生转移。CTC应该进行持续检测，并与其他临床诊断方式联合起来监控上述肿瘤细胞的转移。在肿瘤发生过程中的任何时间段，对CTC数量进行评估，可以预估肿瘤患者治疗后的无进展生存期和总生存期。

*在该研究中，转移性前列腺癌患者定义为血清标志物PSA在标准激素基准上，高于参考水平具有两次连续增加。这些患者通常描述为具有非雄激素依赖性，激素抗性，或去势抗性的前列腺癌。

摘要说明

肿瘤转移是指当肿瘤细胞从原发灶或转移灶剥落后，这些肿瘤细胞进入循环系统并在机体的远端定植生长的情况。血液循环中的肿瘤细胞源自于上皮细胞，而这

类细胞在血液循环系统中是极罕见的。基于此，本公司推出的细胞自动化捕获仪(CELLTRACKS○R AUTOPREP○R System)通过预设程序并配合使用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒(CELLSEARCH○R Kit)可以对样本进行标准化和自动化检测。用CELLTRACKS II分析仪或者CellSpotter分析仪，一种半自动荧光显微镜，可以对肿瘤细胞进行分析和计数。这种方法只计具有上皮细胞特性（EpCAM+, CK8,18+，和/或者CK19+）的细胞数量。

检测原理

CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂。磁流体试剂是一种具有磁芯的颗粒。其表面包被识别EpCAM抗原的抗体，EpCAM是CTC特异性抗原。因此，该磁微粒可以捕获CTC。经过免疫捕获和富集后，荧光试剂用来鉴定CTC和CTC计数。荧光试剂包括以下组成：抗CK-藻红蛋白（PE）的特异于细胞内蛋白质的细胞角蛋白抗体（上皮细胞特性）；DAPI，用于细胞核染色；和抗CD45-别藻蓝蛋白（APC）白细胞特异性抗体。

试剂/样品混合物被CELLTRACKS○R AUTOPREP○R系统分配到一个插入在MAGNEST?细胞呈现装置的暗盒中。所述MAGNEST?装置具有强磁场，能吸引磁微粒标记的上皮细胞在暗盒的表面上。CELLTRACKS ANALYZERII?分析仪，或者CellSpotter?分析仪自动扫描暗盒的整个表面，获取图像并向用户显示所有事件，其中CK-PE和DAPI荧光染料进行共定位。图像进行最终分类，并以画廊格式呈现给用户。所检测分析的事件当其形态学特征与肿瘤细胞一致并表现出EpCAM+，CK+，DAPI+和CD45-表型时，才被分类为肿瘤细胞。

试剂盒提供的材料

试剂说明

1. 3ml 包被抗EpCAM抗体的磁流体：含有浓度为0.022%的磁微粒，这些磁微

粒表面偶联有抗表皮细胞表面标志物EpCAM的鼠源单克隆抗体。缓冲溶液中含有0.03%的BSA和0.05% ProClin 300作为保护剂。（棕色瓶盖）

2. 3ml染色试剂：包含细胞角蛋白特异性鼠源单克隆抗体，该偶联藻红蛋白（PE），浓度为0.0006%和浓度为0.0012%的鼠源抗CD45分子的单克隆抗体，该抗体偶联别藻蓝蛋白（APC），保存在含有0.5％BSA和0.1％叠氮化钠的缓冲溶液中。（白色瓶盖）

3. 3ml核酸染料：浓度为0.005%的4'，6-二脒基-2-苯基二盐酸盐（DAPI）保存在0.05%

的Proclin?300缓冲溶液中。（蓝色瓶盖）

4. 3ml捕获增强试剂：包含浓度为0.02％的专有试剂用于限制铁磁流体聚团，保存在0.5％BSA和0.1％叠氮化钠缓冲溶液中。（透明瓶盖）

5.3ml通透试剂：含有0.011％的专有通透剂，保存在0.1％叠氮化钠缓冲液中。（绿色瓶盖）

6.3ml细胞固定液：包含25％的专有固定液成分，保存在0.1％BSA和0.1％叠氮化钠缓冲溶液中。（红色瓶盖）

7. 2 x 110ml/瓶稀释液：含有0.1％叠氮化钠的缓冲溶液。

8. 16支Cellsearch?圆锥形管（15ml圆锥形离心管）和管帽。

9. 16个暗盒和暗盒塞子。

未提供的必需材料

1. CellSave血液保护管（货号#7900005）

2. CELLTRACKS○R AUTOPREP○R系统(Catalog #9541)

3. CELLTRACKS ANALYZER II?分析仪(Catalog #9555)，或者CellSpotter?分析仪(Catalog #9525)

4. CELLSEARCH?循环肿瘤细胞质控试剂盒(Catalog #7900003)

5. CELLTRACKS? AUTOPREP?仪器缓冲液(Catalog #7901003)

6. 能提供离心力为800 X g水平离心机。

7. 试管架

8. 微量移液器和枪头

9. 旋涡混合器

警告和注意事项

1. 本产品仅用于体外诊断。

2. 在使用本产品检测样本之前请仔细阅读说明书。

3. 注意：只能用CellSave保护管收集血液。CTC非常脆弱，需要特别保护才能进行正确分析。

4. 注意：从业人员必须遵循全面防护措施，使用实验室的安全设备（例如，护目镜、安全服、安全手套等）。

5. 注意：微生物污染会造成获得结果的不正确性，实验中应避免生物污染。

6. 警告：所有的生物样本，包括暗盒和其他与生物样本接触的材料，应该认为具有生物危害。样本如果具有传播感染的能力，必须进行及时处理。同时，废弃物应根据当地和国家的规定进行正确处理。禁止用嘴吸液。

7. 警告：一些含有叠氮化钠作为防腐剂的试剂。如果食入，请立即就医。应放在小孩拿不到的地方。远离食品和饮料。使用时，佩戴合适的防护服。与酸接触会释放剧毒气体。在处理过程中，叠氮化合物应用大量的水冲洗，并避免放置在铅或铜的容器中，其可形成爆炸的条件。危险和安全术语R22表示吞咽有害，S28表示与皮肤接触后，用大量肥皂清洗。

8. 警告：所用包含Proclin?300作为防腐剂的试剂。过度暴露在Proclin?300可引起皮肤和/或眼睛刺激，以及粘膜和上呼吸道刺激的症状。

9. 操作人员在实验前应进行培训。

试剂储存和处理

1. 所以试剂在未开启使用之前，请储存在2-8度。

2. 在试剂盒开启后，试剂在2-8度储存时间不超过30天。为了更好的储存，开启的试剂必须使用相对应的盖子盖上，盖子的颜色与试剂瓶的标签相对应。这可以避免试剂之间的交叉污染。

3. 注意：在试剂盒开启后，稀释缓冲液不属于试剂盒的一部分，应当在室温下储存，且保存时间不能超过30天。

4. 避免试剂保存温度超过35度，也不要冰冻。

5. 在使用前，试剂需要平衡至室温（15-30度）。

6. 目视检查试剂盒包装，并确定试剂在正确的位置。通过匹配其特有的彩色瓶帽颜色和相应标签，检验每种试剂是否在适当的位置。请参照以下图片的安置。如果发现试剂放错了位置，或者存在重复的瓶子，不要使用该试剂盒，并通知客户技术服务进行更换。

7. 试剂需避光保存。

8. 试剂在正确的保存条件下是稳定的，直到保存到印刷在试剂容器或试剂盒上的失效日期。不要使用过期试剂。

9. 试剂盒组分经过大量的产生和测试。不同试剂盒之间的试剂不能混合使用。

检测过程

样本收集和预处理

使用CellSave保护管收集全血

1. 初始样样本应在开始治疗方案前进行设计。后续样本可以在治疗方案开始后进

行，在治疗过程中，通常在3至4周的时间间隔内检测CTC水平。如果患者用阿霉素进行治疗，至少应在用药7天后才能取血检测。

2. 只能使用CellSave保存管，通过静脉无菌的采集全血。

3. 采血应直到血流停止，以确保血液样本与抗凝剂和保护剂的正确比率。立即轻

柔的倒转采血管8次进行混匀。采血管反转防止凝血。采血管颠倒不足或延迟，可能会导致不准确的测试结果。

4. 血液样本可被存储在CellSave保护管中并进行输送。请参阅CellSave保护管

使用说明书。不要冻存样本。

警告：在使用CELLTRACKS? AUTOPREP?系统检测之前，目视检查每个样本是否凝血。凝血的样本应被丢弃。

CELLTRACKS? AUTOPREP?系统检测过程

1. 手动翻转5次保存样本血液的CellSave保护管。然后拔出橡胶塞。

2. 使用一支新的移液管从CellSave保护管中转移7.5ml血液到CELLSEARCH?

试剂盒提供的一个相应标记的15ml CELLSEARCH?锥形管中。

3. 再用一支新的移液管加入6.5ml稀释缓冲溶液到上述锥形管中。

4. 盖上管盖，颠倒5次混匀。

5. 样本离心，使用水平离心机800 X g离心10min。该10min离心时间不包括达

到800×g所需要的时间。将离心机刹车“关闭”或者，如果你的离心机提供可变制动功能，设置制动到最低刹车设置。使用能够在室温下离心的离心机在室温条件下离心。样本离心后，目视检查每个样品管中血浆和红血细胞是否分离。

6. 运行CELLTRACKS? AUTOPREP?系统之前，上述样本需要1h的准备时间。

请参阅CELLTRACKS? AUTOPREP?系统用户指南的完整说明。

使用CELLTRACKS 分析仪II? or CellSpotter?分析仪分析样本CELLTRACKS? AUTOPREP?系统使用CELLTRACKS分析仪II?或

CellSpotter?分析仪将处理好的样本分配放入到暗盒中准备进行分析。MAGNEST?装置内的放有样本的暗盒应在黑暗中至少孵育20分钟，并在24小时内进行分析。请参阅CELLTRACKS分析仪II?或CellSpotter?分析仪用户指南的样本分析和数据审查说明。

质量控制

CELLSEARCH?循环肿瘤细胞质控试剂盒（目录＃7900003）检查整个系统的性能，包括仪器，试剂和操作。在病人测试的每一天或使用大量新的CELLSEARCH?试剂盒时，CELLSEARCH?循环肿瘤细胞质控应该进行。请参阅CELLSEARCH?循环肿瘤细胞质控试剂盒使用说明书和预期值。

结果解释

结果以7.5ml血液中CTC的个数报告。

转移性的乳腺癌（MBC）

在治疗过程中的任何时期，7.5ml血液中CTC数量≥5，表示预后差。预示着短的无进展生存期和总体生存期。

转移性的结直肠癌（MCRC）

在治疗过程中的任何时期，7.5ml血液中CTC数量≥3，表示预后差。预示着短的无进展生存期和总体生存期。

转移性的前列癌（MPC）

在治疗过程中的任何时期，7.5ml血液中CTC数量≥5，表示预后差。预示着短的无进展生存期和总体生存期。

注意

如果每7.5ml的样本血液中，有500个或更多的CTC数量，样品残留可能影响CELLTRACKS? AUTOPREP?系统对随后样本包括后续批次的分析。如果细胞

被延续到后续样本中，这些样本的CTC数量可能错误地比病人的实际的CTC计数更高。请参阅CELLTRACKS?AUTOPREP?用户指南以获取更多信息。

局限

●CELLSEARCH?结果应按照合适的病人管理程序与来自于诊断测试（即影像

学，实验室检查）、体检和完整病史等所有的临床信息结合使用。

●本预后研究并没有证明任何当前治疗效果要比任何其他治疗或不治疗效果要

好或者是差。

●CELLSEARCH?计数结果和成像效果与评估无进展期到有进展期的转变不对

等。

●如果患者使用阿霉素治疗，至少应在用药7天后才能取血检测。如果用阿霉素

治疗7天内取血检测，对CELLSEARCH?检测结果的解释应谨慎。

●CELLSEARCH?不能检测不表达EpCAM的CTC。

●CELLSEARCH?不能检测表达EpCAM,但不表达细胞角蛋白8、18和19的

CTC。

●干扰物质：

用未处理的样本作为对照，将SK-BR-3细胞掺入到血液样品中，并同潜在的干扰物质进行作用。对以下癌症药物的毒性水平（5次治疗指数），包括非处方药和其它外源物质进行了测试：环磷酰胺，丝裂霉素C?，普罗克瑞?，生物素，5-氟尿嘧啶，甲氨蝶呤，他莫昔芬柠檬酸盐，紫杉醇，阿那曲唑?，对乙酰氨基酚，乙酰水杨酸，咖啡因，右美沙芬，阿可达?，人抗小鼠抗体（HAMA）1型，HAMA2型，赫赛汀，和布洛芬。检测到SK-BR-3细胞数无显着差异，这表明这些物质不与CELLSEARCH?试剂盒产生干扰。

通过对加入阿霉素毒性水平的测试，发现阿霉素能导致白细胞同时被异常染色成

种类 数量 CTC 均值 标准差 CTC>5的例数 最小值 最大值

健康志愿者 145 0.1 0.2 0 0 1 非恶性乳腺疾病者

breast disease 101 0.2 1.2 1 0 12 其他非恶性疾病者 99 0.1 0.4 0 0 3 细胞角蛋白和CD45双阳性细胞，这是由于阿霉素能作为荧光化合物嵌入到细胞核中。如果这样，所有的细胞都是CD45阳性和细胞角蛋白阳性染色，作为一个已知的干扰物质染色，这种结果容易观察，操作者也很容易识别。如果血液在阿霉素用药7天后的清除期检测，这种干扰是不可能在给定的控制治疗水平和快速的药物清除临床实践中观察到。

血脂潜在的干扰也被研究，将浓度为2.6％英脱利匹特加入到样品中，其对应于大于1000mg/dl 的甘油三酯。将样品溶解到模拟的总溶血。7.4mg/dl 的胆红素，HAMA 1 / HAMA 2和18-60％的血细胞比容也进行了研究。脂血，溶血，黄疸和广泛的血细胞比容值均不干扰CELLSEARCH?测试。 HAMA 1和HAMA 2也不会干扰，这表明通过非肠胃途径接收小鼠Ig 的个体可以用CELLSEARCH?进行成功测试。 预期值

健康志愿者，非恶性乳腺疾病者，其他非恶性疾病者

对145名健康志愿者，101名非恶性乳腺疾病妇女，和99名其他非恶性疾病妇女作为对照组进行单点CTC 分析发现：健康个体的外周血中均不存在上皮细胞。在包括345个总样本的健康志愿者和非恶性疾病妇女中，只有一个例CTC

超过5个/7.5ml 。结果列于表1中。

表1. 对照组

健康志愿者，非恶性结直肠疾病者

从35岁以上（包括35岁）的健康男性和女性采取血液。这些健康志愿者均来自于美国的三个中心。本研究的目的为：从每个受试者取2管血，并都进行CTC 水平的测定评估。总共有150个可评价受试者的血液进行了一个或两个单独的7.5ml 血液CTC 的测定。并非所有评估的受试者都有两管CTC 的结果。两组受试者的循环肿瘤细胞平均数是0.0，标准偏差为0.1?0.2。从健康志愿者（男性和女性）

良性疾病 按之前的方式采集血液 Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Total

数量 55 55 53 47 210 CTC 范围

0-1 0-1 0-1 0-1 0-1 CTC 平均值

0.1 0.0 0.0 0.1 0.0 标准差 0.2 0.1 0.2 0.3 0.2 % _> 1 CTC

3 (5%) 1 (2%) 2 (4%)

4 (9%) 10 (5%) % _> 2 CTC 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 的284个总样本中，没有一个受试者CTC 数超过3 个/7.5ml 。结果示于表2中。

表2. Cellsearch?分析对照样本中CTC 结果 健康对照 所有对照

男性 女性 Tube 1 Tube 2

Total Tube 1 Tube 2 Total Tube 1 Tube 2 Total 数量 149 135

284 68 64 132 81 71 152 CTC 范围 0-1 0-1

0-1 0-1 0-1 0-1 0-1 0-1 0-1 CTC 均值 0.0 0.0

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 CTC 标准差 0 .1 0 .2

0 .1 0 .1 0 .1 0 .1 0 .1 0 .2 0 .2 N (%) _> 1 CTC 2 (1%) 4 (3%)

6 (2%) 1 (1%) 1 (2%) 2 (2%) 1 (1%) 3 (4%) 4 (3%) N (%) _> 2

CTC 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 从接受结肠镜检查或手术为良性疾病的患者中采集大约30ml 的血液（以增加检测细胞的概率）到4个独立的CellSave 管中（每管至少7.5ml ）。依照之前的检测方法，对每个受试者总共进行了4次7.5ml 血液中CTC 数量的检测。其结果示下面的表3中。并非所有评估的受试者都有4次检测的CTC 结果。没有1例良性结

肠疾病病人在每7.5ml 血液只有超过1个CTC 的检出。

表3. Cellsearch?分析良性结直肠疾病样本中CTC 结果

图1显示了健康人（对照）、良性疾病患者（对照）、在治疗开始前和开始治疗大约1个月后的转移性乳腺癌、转移性结直肠癌、转移性前列腺癌患者中CTC 的频率。

图1. 对照组（非癌症样本）、转移性乳腺癌(MBC)、转移性结直肠癌(MCRC)、

转移性前列腺癌患者(MPC)在治疗前和治疗后2-5周CTC 检出数量

1MBC 转移性乳腺癌相关数据信息见临床IFU 的表1.

2MCRC 转移性结直肠癌相关数据信息见临床IFU 的表12.

3

MPC 转移性前列腺癌相关数据信息见临床IFU 的表22. 性能指标

回收率

采取单个健康受试者血液6管，每管7.5ml 。其中5管分别加入数量为1300，325，

81，20，和5的培养乳腺癌细胞（SK-BR-3）。第6管不加SK-BR-3细胞作为零点。这些样本用CELLSEARCH?循环肿瘤细胞试剂盒在CELLTRACKS? AUTOPREP?系统上运行并用CELLTRACKS分析仪II?对CTC进行计数。共对5名健康志愿者进行重复实验。并用所检测到的细胞数对理论细胞数作图。该结果总结于表4中。

表4回收率

以确定整体，或最小二乘拟合，对于跨所有数据所检测到的和预期的细胞数的比较中，进行线性回归分析。这30个样本的回归方程为Y = 0.93x + 3.87（R 2 = 0.999 R = 0.999）。这项研究结果表明，在测试的CTC范围内，根据回归分析，其回收率平均为93％。

肿瘤细胞数的线性关系，期望的检测值与预期曲线的斜率应为1.0。但是，实验所得斜率为0.93。这是因为与CELLSEARCH? 循环肿瘤细胞检测试剂盒配套使用的CELLTRACKS? AUTOPREP?系统涉及到捕获和荧光标记细胞，并使用CELLTRACKS分析仪II?进行随后的检测和计数。这个过程会造成细胞损失。细胞损失可以归因于以下可能性之一：

1）通过CELLTRACKS? AUTOPREP?系统，只有93％的回收肿瘤细胞投入到了7.5ml血液中，

2）只有93％的肿瘤细胞通过CELLTRACKS分析仪II?进入到样品室中，或

3）两者的这些误差源的组合。

线性/报告范围

?检查之前数据可靠性的另一种方式是将待分析样本作系列稀释，以评估测试的线性度。我们通过使用稀释系列的初始样品的检测值（即，第1管）的稀释系数划

分确定用于稀释系列的每个患者样本的预期值除去回收百分比的混淆变量。对所有检测到的肿瘤细胞与预期肿瘤细胞的数目回归分析产生了1.007的斜率，截距为3.0，R2 =0.990（R =0.995）。因此，自从回收率（细胞丢失）受每个初始样品的CTC值影响时，数据分析表明，CTC的检测线性范围为0至1238个肿瘤细胞。

检测下限

CELLTRACKS分析仪II?可检测到每7.5ml血液中仅1个CTC，即暗盒中CTC 的检测下限为1个CTC。线性回归分析显示，平均而言，使用CELLTRACKS? AUTOPREP?系统能回收7.5ml血液样本中93％的CTC（见回收率部分）。样本中大约7％的CTC损失不足以影响1个CTC的检测下限。

重复性

a. CELLSEARCH?循环肿瘤细胞质控品系统重复性

制备了三个独立的CELLSEARCH?循环肿瘤细胞的质控样品，每天进行分析处理，总共超过30天，参照NCCLS指南EP5-A2的长期运行方式。每单次使用的样本瓶含有低、高两个浓度的细胞系。这两个细胞系已经固定，并用两种不同的荧光染进行预先染色。高低浓度的质控细胞统计数据展示如下表5。

表5. 精密度分析统计结果

b. 病人样本系统重复性

转移性乳腺癌（MBC）

在临床研究的过程中，共收集47例转移性乳腺癌患者的163份重复血液样本。这些样品在多点进行处理，以测定CTC方法的重复性。对这163份重复样品进行对比的回归方程为Y=0.98x+0.67，R2=0.99。图2示出了MBC患者血液的重复样

本CTC结果在对数刻度上绘制的散点图，阈值为5个CTC，由虚线标出。

图2. 在转移性乳腺癌（MBC）样本中CTC计数，样本数163例，每7.5ml血液

中CTC均值小于5或者大于5

图2备注：可能有一个以上的点叠加在另一个点上。例如，在这个图中，有50例（31％）的两个管有0 CTC，18例（11％）的第1管有0 CTC和第2管有1 CTC，另有18例（11％）的第1管有1 CTC和第2管有0 CTC。

转移性结直肠癌（MCRC）

在临床研究的过程中，共收集430例转移性乳腺癌患者的1627份重复血液样本。这些样品在多点进行处理，以测定CTC方法的重复性。对这1627份重复样品进行对比的回归方程为Y=0.98x+0.18，R2=0.96。图3示出了MCRC患者血液的重复样本CTC结果在对数刻度上绘制的散点图，阈值为3个CTC，由虚线标出。图3. 在转移性结直肠癌（MCRC）样本中CTC计数，样本数1627例，每7.5ml

血液中CTC均值小于3或者大于3

图3备注：可能有一个以上的点叠加在另一个点上。例如，在这个图中，有975例（60％）的两个管有0 CTC，116例（7％）的第1管有0 CTC和第2管有1 CTC，另有109例（7％）的第1管有1 CTC和第2管有0 CTC。

来自转移性乳腺癌和结直肠癌患者的血液样本中，管与管之间CTC的变异计数显示于图2及3，偶发事件（如肿瘤细胞）的一个给定体积内的分布是随机的和独立的细胞或疾病类型。这个最好的特征是泊松分布- 用于建模系统的数学方法，其中发生的事件的概率非常低，但机会对于这样一个事件的发生数是较大的5。对于极少管的前列腺CTC，它合理的期望变化结果类似于在图2和3中所示。因为在MBC和MCRC患者以前的研究显示了几乎相同的结果，转移性前列腺癌患者

血液样本CTC计数管与管之间的比较，在CELLSEARCH? CTC前列腺临床试验过程中没有实施。但是，在Memorial Sloan-Kettering癌症中心使用CELLSEARCH?技术的一项独立研究的结果显示，转移性前列腺癌患者每管CTC数量在0到1192个的范围内，CTC计数在点到点或管与管之间没有系统性的变化4。

参考文献

1. Cancer Biology, 3rd edition, Ray Ruddon 1995.

2. NCCLS Approved Guideline EP5-A, “Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices”.

3. NCCLS Approved Guideline C28-A2, “How to Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory”.

4. Shaffer DR, Leversha MA, Danila DC, Lin O, Gonzalez-Espinoza R, Gu B, Anand A, Smith K, Maslak, P, Doyle GV, Terstappen LWMM, Lilja H, Heller G, Fleisher M and Scher HI. “Circulating Tumor Cell Analysis in Patients with Progressive Castration-Resistant Prostate Cancer”, Clinical Cancer Research, Vol 13 No.7: 2023-2029, (2007).

5. Tibbe A.G.J, Miller C.M and Terstappen LWMM “Statistical Considerations for Enumeration of Circulating Tumor Cells”, Cytometry Part A 71a:154-162 (2007).

关于循环肿瘤细胞(CTC)的一些认识

关于循环肿瘤细胞（CTC）的一些认识 摘要：通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞（circulating tumor cell）。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断，化疗药物的快速评估，个体化治疗包括临川筛药、耐药性的检测，肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。检测CTC 有着良好的应用前景，随着这一研究领域的不断发展，必将产生新的诊疗手段，从而使肿瘤的治疗提高到一个崭新的阶段。 关键词：循环肿瘤细胞；CTC；检测方法；临床意义 早在1896年，Ashworth曾报道1例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）的概念[1]。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。 1、概述 CTC指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。随着肿瘤细胞的不断增殖,部分细胞可以通过分泌一种抑制黏附因子表达的物质,增加其运动能力并使之与肿瘤母体脱离。这些脱落的肿瘤细胞再分泌一种蛋白溶解酶，以破坏周边宿主结缔组织并进入脉管系统。诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环。 2、检测方法 2.1免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC） 这一检测方法基于抗原抗体结合反应的原理，利用单克隆抗体（McAb）与特异的肿瘤标记物结合，并通过酶与底物反应显色来判断肿瘤细胞的存在。检测的肿瘤标志物主要分三类：①上皮细胞角蛋白（CK），如CK19；②上皮细胞膜特异性抗原，如黏蛋白类，包括EMA、HMFG、HEA125等；③肿瘤相关糖蛋白（TAG），如TAG12。1980年，Sloane等首次 采用ICC的方法检测乳腺癌患者骨髓中的肿瘤细胞。该方法可以进行形态学分析，但是检 测的细胞量少，敏感性只有10－4～10－5（即在1万~10万个单核细胞中发现一个肿瘤细胞），而且许多分化差的肿瘤不能表达目标抗原，而非上皮细胞中细胞角蛋白和上皮细胞抗原亦可能阳性,故特异性不高。Braun等[2]认为由于CTC不表达白细胞共同抗原CD45，采用CD45－/CK＋双标技术可以提高ICC检测的特异性。 2.2多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 该方法的原理是特异性扩增出肿瘤细胞中因癌基因、抑癌基因突变或染色体重排而产生 的DNA异常。这类基因的改变应满足以下条件：①该基因的突变在待检肿瘤中发生率较高，至少应达50％左右；②基因内发生碱基突变的部位应相对集中，如果过分分散，目前临床 应用有困难。这一方法检测肿瘤细胞的敏感性约1×10－6左右，比Southern印迹杂交法约提高10 000倍。应用PCR技术检测CTC受到缺乏肿瘤特异性和高表达标记的限制，该方法敏感度高，易出现假阳性，同时由于癌细胞的异质性亦可出现假阴性。目前多应用突变等位基因扩增（mutant allelie specific amplification, MASA）的PCR技术，检测大肠癌和胰 腺癌患者外周血中具有K-ras癌基因突变的肿瘤细胞。 2.3逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

循环肿瘤细胞CTC检测及临床应用

循环肿瘤细胞C T C检测及 临床应用 Prepared on 22 November 2020

循环肿瘤细胞检测及临床应用 中文摘要：循环肿瘤细胞是从原发肿瘤扩散，进入到血液或淋巴系统的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞在血液中含量稀少，一般先将循环肿瘤细胞富集，然后再进行检测，现在已经开发了多种细胞富集和检测技术。本文主要对CTCs的富集和检测技术研究进展，以及CTCs在临床分析和研究上的应用进行了综述。 关键词：循环肿瘤细胞富集检测临床 Abstract:Circulatingtumorcellscomefromtheprimarytumorproliferation,andprolife ration,癌症转移的过程是循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)从原发肿瘤分离，通过循环系统扩散，进入血液或者淋巴系统，在远处形成新的肿瘤，最终导致大多数的癌症病人死亡。1869年，Ashworth在一例癌症死亡患者的外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出了CTCs的概念。从此，越来越多的研究表明，CTCs的出现与癌症密切相关。通过上皮-间质转化(EMT)，实体瘤的上皮细胞进行细胞的变化，使他们通过增加流动性和侵袭性脱离组织，进入到血液中，附着，、发展成远端转移。由于CTCs能够代表原发肿瘤的表型和遗传组成，并能够作为任何转移性肿瘤的”液体活检”，CTCs的富集分离和特征研究，十分具有吸引力。CTCs的富集和计数技术已经建立，其中CTCs的计数可以成为预测指标，当其大于已知的阈值时，就预示着病人就患有转移性乳腺癌，、前列腺癌，、结直肠癌等。 基于临床试验，美国FDA批准了一种临床检测CTCs的CellSearch技术，用于上述癌症的CTCs的富集和计数。CellSearch技术成功的证明了CTCs确实表征了疾病的活跃，CTCs数量的增加预示着病情的恶化，可以通过CTCs了解原发性和转移性肿瘤，以CTCs为基础的分析，可以帮助人们实时诊断和预测，对病情做出决定，并取样检测耐药性。大多数常规的癌症治疗方法在治疗转移性癌症方面难以成功，CTCs的可能促进肿瘤的临床研究。 CTCs在血液中极其稀少，数十亿的外周血细胞也阻碍了对CTCs的分离和分子鉴定。现在已经开发了大量的技术用于富集和检测CTCs，其中有些已经成功的用于测试或者临床评估。本文主要综述CTCs的富集和检测技术的研究进展，以及对CTCs的在临床分析和研究上应用。 1CTCs富集技术 为了从大量血液细胞中捕获数量稀少的CTCs，富集分离技术必须足够敏感性，可重复性，可靠，、快速，、便宜，并且所需获取血液量要尽量少，方便实现过程自动化，方便下游分析。此外，富集分离的CTCs要能够保持他们的活性，在富集分离的过程受到的干扰要尽量小，因为这可能改变CTCs的状态和表型。 CTCs富集的技术有很多种，这些技术使用多个性能参数评估(即捕获效率，纯度，细胞活力，富集速度，血液样本容量等)，然后通过检测临床样本进行验证。最佳的富集分离方法可能需要之间的性能参数的折衷，而且可能依赖于下游的应用。CTCs的富集技术主要根据免疫亲和性，物理性质和直接分析分为三类。 1.1免疫亲和性(Immunoaffinity)

循环肿瘤细胞(CTC)检测

循环肿瘤细胞（CTC）检测 一、什么是循环肿瘤细胞（CTC）？ 循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，进入外周血循环的肿瘤细胞。 CTC非常稀少，每毫升血液中109血细胞只有几个CTC。大部分CTC在进入外周血后会发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者的死亡风险。 二、肿瘤的发生及检测诊断 全国肿瘤登记中心发布的2015年年报显示，2011年我国新增癌症病例约337万例，比2010年增加28万例——这相当于每分钟有6人被诊断为癌症。然而，令人担忧的是这样的情势似乎仍未到达峰顶，未来可能还会不断增加。 美国约翰-霍普金斯大学Kinmel 癌症中心的Bert-Vogelstein 等专家在2013年3月份的一篇综述文章中写道：在今年将死于癌症的一百万人里，绝大部分是因为他们的癌症没有在发生、发展的前90%的时间内被发现。因此，我们需要明确一点：癌症是一种慢性病，它只是被突然发现，并非是突然发生的。我们需要尽可能早的发现它，从而提高治愈率。 伴随肿瘤的发生过程，肿瘤细胞的大小也随之增大。传统方法诊断出癌症的时候，大部分已经是晚期。晚期癌症的治愈率极低，其五年生存率也很低。在肿瘤的发生过程中，早期到中期之间是最佳治疗期，因此，如果在早期就可以发现肿瘤的存在，必然可以提高治愈率。临床癌症研究（Clinical Cancer Research）杂志上发表的荟萃分析（Meta-analysis）证实CTC

在乳腺癌预测中的价值，结果表明早期和转移性乳腺癌患者的循环肿瘤细胞CTC检测是一个稳定的预测和预后工具。 如果将肿瘤易感性基因检测和循环肿瘤细胞检测完美结合，那么能够将肿瘤的早期发现率提高数倍。肿瘤易感性检测是对未来可能患有癌症的一种风险预测。如果风险等级高，除了改变生活方式外，还可以定期做循环肿瘤细胞检测，即CTC检测，而且检查频率可以适当增加，每2-3个月检查一次，从而达到实时监控的目的。 三、CTC 检测临床意义有哪些？ CTC 检查的临床意义主要表现在体外早期诊断，血液中肿瘤在1mm时，即可检出CTC，抓住最佳治疗期；另外还可以进行预后判断，根据治疗前后CTC个数判断预后与存活时间，制定最佳治疗方案；此外，还有肿瘤复发检测、耐药性检测、化疗药物的疗效评价以及新药的研发等。 四、哪些人需要做CTC检测？ 1. 普通健康人：通过检查血液中是否存在循环肿瘤细胞来早期检测肿瘤的发生，建议每年检测一次，以期在肿瘤萌芽阶段就能检测到，从而保证早期治愈率。 2. 肿瘤易感人群：有癌症家族史人群，患有HPV阳性、慢性肝炎、慢性胃炎、慢性肠炎等人群，长期吸烟者，经常接触有毒有害物质者，生活压力大、精神高度紧张的亚健康人群，以及基因检测肿瘤易感性风险等级高者，建议每3个月或者半年检测一次。 3. 癌症患者：已经确诊的癌症患者，通过CTC计数，用于预后判断、疗效评价、复发检测等；通过CTC单细胞基因组分析，选择精准治疗方案，实现真正的液体活检。

循环肿瘤细胞检测系统(CTC)仪器购买可行性报告

循环肿瘤细胞检测系统（CTC）设备购置 可行性报告 一、制造商基本情况 美国强生(Johnson & Johnson)成立于1886年，是世界上规模最大，产品多元化的医疗卫生保健品及消费者护理产品公司。1999年全球营业额高达275亿美元。强生在全球60个国家建立了250多家分公司，拥有约11万5千余名员工, 产品销售于175个国家和地区。 强生公司是世界上最具综合性、分布范围最广的卫生保健产品制造商、健康服务提供商，产品畅销于175个国家地区，生产及销售产品涉及护理产品、医药产品和医疗器材及诊断产品市场等多个领域。 美国强生公司研发的循环肿瘤细胞检测系统（CTC）2012年进入中国市场，立即被运用于肿瘤科研和临床检测，并受到业界好评。二、项目意义 随着循环肿瘤细胞检测技术的不断发展，循环肿瘤细胞（CTC）在肿瘤临床实践以及肿瘤基础科学研究领域得到了越来越多的重视。CTC数目已经被证实与晚期转移性乳腺癌，结直肠癌，前列腺癌等各种患者的无进展生存期和总生存期密切相关，CTC已经成为转移性乳腺癌等癌种的一种全新的，独立的预后因子，并被作为一种新的肿瘤生物标志物而广泛应用于新药开发，癌症机制研究等不同的领域。三、国内外研究 CTC是指存在于外周血循环中的肿瘤细胞，其含量非常稀少（1ml血液中可能只能检出1个CTC）。CellSearch系统是目前为止唯一获得FDA批准的可以应用于病人管理的自动化循环肿瘤细胞检测系统。检测技术的不断进步CTC越来越成为国内外癌症领域研究的热点。2004年，Cristofanilli等完成的前瞻性多中心临床研究表明治疗前

(基线期)和首次随访时的CTC水平对于转移性乳腺癌患者的无进展生存期和总生存期都是独立的预测指标。在177例转移性乳腺癌患者中，CTC水平较高者(≥5个/7.5ml全血)的平均无进展生存期只有2.7个月，总生存期只有10.1个月；CTC水平较低者则分别为7.0个月(P<0.001)和超过18个月(P<0.001)。随后又有多个研究证明治疗期间任何时间点CTC水平的升高都提示着疾病的快速进展和较差的预后。同时也出现了越来越多的不同癌种的关于CTC的研究，其结果也提示了CTC在前列腺癌，结直肠癌中也发挥了相同的预后作用。由于FDA 的批准，在美国CTC已经可以与传统肿瘤诊断检测方法相结合用于临床实践。国外也有较多的研究集中在了CTC的生物特性上，例如研究CTC表面的Her2抗体表达情况，进行CTC与原发肿瘤的抗体表达对照研究等。 此前，国内也有一些实验室开展了关于CTC的研究，但局限于手工磁珠法，PCR法等方法学问题，并没有取得国际认可的结果。不过随着CellSearch方法逐渐进入中国，越来越多的学者已经开始了关于CTC的研究。国内正在进行CellSearch的注册临床研究，将会验证CellSearch系统在中国人群中的有效性及安全性。同时一些国内的实验室也已经开始在CellSearch这一平台上进行不同的基础科学研究，包括CTC表面多重生物标志物分析，CTC分子生物学分析，CTC细胞FISH检测等，希望通过CTC这个全新的肿瘤标志物得到更多关于癌症发病机制，癌症转移机制等问题的答案。 四、国内开展现状 基于CellSearch平台的CTC检测技术是一种安全可靠的被美国FDA批准的癌症临床辅助诊断技术，随着中国注册临床试验的进行，CTC检测将会在中国得到越来越多的重视并迎来更加广阔的临床及科研应用前景。目前国内已有解放军307医院，复旦大学附属肿瘤医院，

cellsearch循环肿瘤细胞ctc)试剂盒说明书自译中文版

7900001 16人份试剂盒 Cell Search 循环肿瘤细胞检测试剂盒 （上皮细胞） IVD 使用须知 本试剂盒仅用于体外诊断 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒用于外周血中循环肿瘤细胞（CTC）的计数，这些细胞来源于上皮细胞，即表现为CD45阴性（CD45-），EpCAM阳性（EpCAM+），细胞角蛋白8,18阳性（CK8,18+）和（或者）CK19阳性(CK19+)的细胞。 用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒检测的CTC，存在于外周血中，这类细胞与乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌*转移患者的无进展生存期和总生存期相关。因此，CTC可以用来监控乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的肿瘤细胞是否发生转移。CTC应该进行持续检测，并与其他临床诊断方式联合起来监控上述肿瘤细胞的转移。在肿瘤发生过程中的任何时间段，对CTC数量进行评估，可以预估肿瘤患者治疗后的无进展生存期和总生存期。 *在该研究中，转移性前列腺癌患者定义为血清标志物PSA在标准激素基准上，高于参考水平具有两次连续增加。这些患者通常描述为具有非雄激素依赖性，激素抗性，或去势抗性的前列腺癌。 摘要说明 肿瘤转移是指当肿瘤细胞从原发灶或转移灶剥落后，这些肿瘤细胞进入循环系统并在机体的远端定植生长的情况。血液循环中的肿瘤细胞源自于上皮细胞，而这

类细胞在血液循环系统中是极罕见的。基于此，本公司推出的细胞自动化捕获仪(CELLTRACKS○R AUTOPREP○R System)通过预设程序并配合使用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒(CELLSEARCH○R Kit)可以对样本进行标准化和自动化检测。用CELLTRACKS II分析仪或者CellSpotter分析仪，一种半自动荧光显微镜，可以对肿瘤细胞进行分析和计数。这种方法只计具有上皮细胞特性（EpCAM+, CK8,18+，和/或者CK19+）的细胞数量。 检测原理 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂。磁流体试剂是一种具有磁芯的颗粒。其表面包被识别EpCAM抗原的抗体，EpCAM是CTC特异性抗原。因此，该磁微粒可以捕获CTC。经过免疫捕获和富集后，荧光试剂用来鉴定CTC和CTC计数。荧光试剂包括以下组成：抗CK-藻红蛋白（PE）的特异于细胞内蛋白质的细胞角蛋白抗体（上皮细胞特性）；DAPI，用于细胞核染色；和抗CD45-别藻蓝蛋白（APC）白细胞特异性抗体。 试剂/样品混合物被CELLTRACKS○R AUTOPREP○R系统分配到一个插入在MAGNEST?细胞呈现装置的暗盒中。所述MAGNEST?装置具有强磁场，能吸引磁微粒标记的上皮细胞在暗盒的表面上。CELLTRACKS ANALYZERII?分析仪，或者CellSpotter?分析仪自动扫描暗盒的整个表面，获取图像并向用户显示所有事件，其中CK-PE和DAPI荧光染料进行共定位。图像进行最终分类，并以画廊格式呈现给用户。所检测分析的事件当其形态学特征与肿瘤细胞一致并表现出EpCAM+，CK+，DAPI+和CD45-表型时，才被分类为肿瘤细胞。 试剂盒提供的材料 试剂说明 1. 3ml 包被抗EpCAM抗体的磁流体：含有浓度为0.022%的磁微粒，这些磁微

cellsearch循环肿瘤细胞(CTC)试剂盒说明书自译中文版

7900001 16 人份试剂盒 Cell Search 循环肿瘤细胞检测试剂盒（上皮细胞） IVD

使用须知 本试剂盒仅用于体外诊断 Cellsearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒用于外周血中循环肿瘤细胞（ CTC ）的计数，这些细 胞来源 于上皮细胞，即表现为 CD45 阴性（ CD45- ）， EpCAM 阳性（ EpCAM+ ），细胞角 蛋白 8,18 阳性（ CK8,18+ ）和（或者） CK19 阳性 （CK19+） 的细胞。 用CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒检测的 CTC ，存在于外周血中，这类细胞与乳腺癌、 结直肠癌和前列腺癌 *转移患者的无进展生存期和总生存期相关。因此， CTC 可以用来监控 乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的肿瘤细胞是否发生转移。 CTC 应该进行持续检测，并 与其他临床诊断方式联合起来监控上述肿瘤细胞的转移。在肿瘤发生过程中的任何时间段， 对 CTC 数量进行评估，可以预估肿瘤患者治疗后的无进展生存期和总生存期。 *在该研究中， 转移性前列腺癌患者定义为血清标志物 PSA 在标准激素基准上， 高于参考水 平具有 两次连续增加。 这些患者通常描述为具有非雄激素依赖性， 激素抗性， 或去势抗性的 前列腺癌。 摘要说明 肿瘤转移是指当肿瘤细胞从原发灶或转移灶剥落后， 这些肿瘤细胞进入循环系统并在机体的 远端定植生长的情况。 血液循环中的肿瘤细胞源自于上皮细胞， 而这类细胞在血液循环系统 中是极罕见的。基于此，本公司推出的细胞自动化捕获仪 （CELLTRACKS R? AUTOPREP System ） 通过预设程序并配合使用 CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒 （CELLSEARCH Kit ） 可以对样本进行标准化和自动化检测。 用 CELLTRACKS II 分析仪或者 CellSpotter 分析 仪，一种半自动荧光显微镜， 可以对肿瘤细胞进行分析和计数。 这种方法只计具有上皮细胞 特性（ EpCAM+, CK8,18+ ，和/或者 CK19+ ）的细胞数量。 检测原理 CellSearch 循环肿瘤细胞检测试剂盒 包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂。磁流体试剂是 一种具有磁芯的颗粒。其表面包被识别 因此，该磁微粒可以捕获 CTC 。经过免疫捕获和富集后，荧光试剂用来鉴定 计数。荧光试剂包 括以下组成：抗 白抗体（上皮细胞特性）； DAPI ， 胞特异性抗体。 试剂 /样品混合物被 CELLTRACKS 呈现装置的暗盒中。所述 MAGNEST ? 装置具有强磁场，能吸引磁微粒标记的上皮细胞在暗 盒的表面上。 CELLTRACKS ANALYZERII ? 分 析仪，或者 CellSpotter ? 分析仪自动扫描暗盒 的整个表面， 获取图像并向用户显示所有事件， 图像进行最终分类， 并以画廊格式呈现给用户。 胞一致并表现出 EpCAM+ ， CK+， DAPI+ 和 试剂盒提供的材料 试剂说明 1. 3ml 包被抗 EpCAM 抗体的磁流体： 含有浓度为 0.022% 的磁微粒，这些磁微粒表面偶 联有抗表 皮细胞表面标志物 EpCAM 的鼠源单克隆抗体。缓冲溶液中含有 0.03% 的 BSA 和 0.05% ProClin 300 作为保护剂。（棕色瓶盖） EpCAM 抗原的抗体， EpCAM 是 CTC 特异性抗原。 CTC 和 CTC CK-藻红蛋白（PE ）的特异于细胞内蛋白质的细胞角蛋 用于细胞核染色；和抗 CD45-别藻蓝蛋白（APC ）白细 ?AUTOPREP ?系统分配到一个插入在 MAGNEST ?细胞 其中 CK-PE 和 DAPI 荧光染料进行共定位。 所检测分析的事件当其形态学特征与肿瘤细 CD45- 表型时，才被分类为肿瘤细胞。

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16人份试剂盒 Cell Search 循环肿瘤细胞检测试剂盒（上皮细胞） IVD

本试剂盒仅用于体外诊断 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒用于外周血中循环肿瘤细胞（CTC）的计数，这些细胞来源于上皮细胞，即表现为CD45阴性（CD45-），EpCAM阳性（EpCAM+），细胞角蛋白8,18阳性（CK8,18+）和（或者）CK19阳性(CK19+)的细胞。 用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒检测的CTC，存在于外周血中，这类细胞与乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌*转移患者的无进展生存期和总生存期相关。因此，CTC可以用来监控乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者的肿瘤细胞是否发生转移。CTC应该进行持续检测，并与其他临床诊断方式联合起来监控上述肿瘤细胞的转移。在肿瘤发生过程中的任何时间段，对CTC数量进行评估，可以预估肿瘤患者治疗后的无进展生存期和总生存期。 *在该研究中，转移性前列腺癌患者定义为血清标志物PSA在标准激素基准上，高于参考水平具有两次连续增加。这些患者通常描述为具有非雄激素依赖性，激素抗性，或去势抗性的前列腺癌。 摘要说明 肿瘤转移是指当肿瘤细胞从原发灶或转移灶剥落后，这些肿瘤细胞进入循环系统并在机体的远端定植生长的情况。血液循环中的肿瘤细胞源自于上皮细胞，而这类细胞在血液循环系统中是极罕见的。基于此，本公司推出的细胞自动化捕获仪(CELLTRACKS○R AUTOPREP○R System)通过预设程序并配合使用CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒(CELLSEARCH○R Kit)可以对样本进行标准化和自动化检测。用CELLTRACKS II分析仪或者CellSpotter分析仪，一种半自动荧光显微镜，可以对肿瘤细胞进行分析和计数。这种方法只计具有上皮细胞特性（EpCAM+, CK8,18+，和/或者CK19+）的细胞数量。 检测原理 CellSearch循环肿瘤细胞检测试剂盒包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂。磁流体试剂是一种具有磁芯的颗粒。其表面包被识别EpCAM抗原的抗体，EpCAM是CTC特异性抗原。因此，该磁微粒可以捕获CTC。经过免疫捕获和富集后，荧光试剂用来鉴定CTC和CTC 计数。荧光试剂包括以下组成：抗CK-藻红蛋白（PE）的特异于细胞内蛋白质的细胞角蛋白抗体（上皮细胞特性）；DAPI，用于细胞核染色；和抗CD45-别藻蓝蛋白（APC）白细胞特异性抗体。 试剂/样品混合物被CELLTRACKS○R AUTOPREP○R系统分配到一个插入在MAGNEST?细胞呈现装置的暗盒中。所述MAGNEST?装置具有强磁场，能吸引磁微粒标记的上皮细胞在暗盒的表面上。CELLTRACKS ANALYZERII?分析仪，或者CellSpotter?分析仪自动扫描暗盒的整个表面，获取图像并向用户显示所有事件，其中CK-PE和DAPI荧光染料进行共定位。图像进行最终分类，并以画廊格式呈现给用户。所检测分析的事件当其形态学特征与肿瘤细胞一致并表现出EpCAM+，CK+，DAPI+和CD45-表型时，才被分类为肿瘤细胞。 试剂盒提供的材料 试剂说明 1. 3ml 包被抗EpCAM抗体的磁流体：含有浓度为0.022%的磁微粒，这些磁微粒表面偶联有抗表皮细胞表面标志物EpCAM的鼠源单克隆抗体。缓冲溶液中含有0.03%的BSA和0.05% ProClin 300作为保护剂。（棕色瓶盖） 2. 3ml染色试剂：包含细胞角蛋白特异性鼠源单克隆抗体，该偶联藻红蛋白（PE），浓度为0.0006%和浓度为0.0012%的鼠源抗CD45分子的单克隆抗体，该抗体偶联别藻蓝蛋白

循环肿瘤细胞,告诉你所不知道的(一)：认识CTC的真相

循环肿瘤细胞，告诉你所不知道的（一）：认识CTC的真相 今年1月份，随着CFDA刚刚批准的靶向PCR CTC检测技术应用于临床，国内CTC市场鱼龙混杂，沸反盈天。 但是，CTC 到底是个什么玩意儿？到底能解决什么临床问题，各种说法甚嚣尘上，在CTC领域深潜了11个月后，我也来谈谈我的看法。 全面了解CTC，就像把大象放进冰箱里，分三步走： 第一步：认识CTC的真相第二步：解析CTC的最佳用武之地第三步：洞察CTC的未来价值 认识CTC的真相（1）你所看到的CTC ，是逻辑上推导的肿瘤细胞 （2）天生的定量神器 （1）你所看到的CTC ，是逻辑上推导的肿瘤细胞 在血液中看到“CTC”用计数的方法尝试“定义”它，最早开始“看到”CTC，大家都会提起强生的CellSearch系统，但实际上，强生发明这套系统也许就是想要用在活体上。“捕捉”到CTC最早在1891年一个转移性肿瘤病人男性病人的血管中，它的发现者Thomas Ashworth，推论说：“那些在肿瘤病人 的血液里找到的跟肿瘤细胞一样的细胞，可能能够”映射“出 那个病人的可能存在的多种肿瘤起源”随后1990年代，CTC 被证实在肿瘤的早期就存在，应运而生了许多试图捕获这些

循环肿瘤细胞的技术。强生的Cellsearch就是其中的佼佼者。强生的Cellsearch系统“制造”了循环肿瘤细胞。我们都知道，所谓癌症诊断的金标准，就是通过HE染色观察细胞核的形态后作出的病理诊断。只有在镜下看到被染色的细胞核形态异常的细胞，我们才能说，这是肿瘤细胞。但CellSearch 系统无法对在血液中捕获的“长相异于常人”的细胞进行HE 染色，观察核形态。于是，用一个简单但是却有趣的逻辑公式，来“命名”了“循环肿瘤细胞”。 所以，我们可以说，现在，我们所知道的CTC，都是被CellSearch所定义的循环肿瘤细胞。或者说，CellSearch让我们看到了它所定义的CTC。 （2）天生的定量神器 CTC的评估标准是单位体积血液中CTC的数量（计数），CellSearch系统“检测CTC”的流程步骤是“富集+检测”，先把高危细胞用各种方法“召集”到一起，再通过PCR或者免疫荧光把CTC从高危细胞中分离出来，并且进行计数。这套流 程步骤，成为我们最终“描述”CTC的理论体系。我们用CTC>7, CTC > 5 这样的语言来描述所看到的CTC的“状态”。当我们用一种特定的语言开始描述我们看到的现象，我们才开始认识它。 但是，我们需要知道CTC 7个，8个，10个，或者3个，到底能说明什么问题，于是，人为的定义了一个cutoff 值，

人外周血循环肿瘤细胞(CTC)

人外周血循环肿瘤细胞(CTC) 检测技术的研发及临床应用开发 美国肿瘤协会于2006 年发表的年度报告指出，目前全世界范围内每3 人中就有1 人在其一生中会患有某种肿瘤，而且肿瘤发病率在发展中国家随着污染程度的增加，患病几率还会高于1/3 的比例。现今全世界用于肿瘤治疗与防治的费用每年以16.5% 的比例递增。仅用于乳腺癌，结直肠癌及前列腺癌（还不包括发病率最高的肺癌）的投资，目前世界范围内已达每年92 亿美元。 目前全世界用于肿瘤诊断的方法可归为三大类：病理学（活检切片）；影像学（超声，X光，CT, PET 等）和血清学（血清肿瘤相关蛋白，如CA-125, CA-199, CEA 等），但所有这些方法都有不可避免的缺点，例如灵敏性及特异性差，过于依赖医生判断的主观性等。因此目前临床急需一种能够为医生及病人提供准确，快速的肿瘤检测手段。经过长时间的大量研究，美国FDA 认证的人外周血循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell, CTC）检测目前已被公认为最好及最可观的检测手段之一。 目前已有越来越多的国内外医生开始应用此技术作为肿瘤检查的重要辅助手段。不仅于此，CTC 检测也被公认为是目前国外新近流行的肿瘤治疗方法-即阻断肿瘤细胞入血转移的唯一有效检测指标。除了上述CTC可作为肿瘤检测手段外，CTC还可成功应用于以下一系列其它方面的用途：(1)个体化治疗的体外肿瘤药物筛选；(2)体内化疗药物药效的快速评估: 相对于每12周一查的CT 诊断，CTC在第1-2周即可显示药效结果，这一点对临床医生和病人尤为重要； (3) 根据CTC数目，判断病人愈后状况及存活时间；（4）肿瘤病人复发的监测与及时诊断；及（5）正常人群体检普查以利于尽可能的肿瘤早期诊断。除了应用于临床外，CTC 亦可应用于众多药厂和科研机构的基础研究，包括寻找新的肿瘤标识物以及开发新的抗肿瘤药物等。 目前美国FDA已于2004年认证了美国上市公司Immunicon/Veridex的CTC检测技术及其临床应用。该公司的销售额从2004 年的1百万美元猛增到2007年的2000万美元，2008 年销售额预计为3800万美元。可见其市场接受程度之迅猛。 然而仔细分析Immunicon/Veridex的检测技术，不难发现其显而易见的缺陷。该技术分离检测肿瘤细胞主要是基于肿瘤细胞表面的一种特定标识物。但众所周知，此肿瘤细胞表面标识物随着肿瘤细胞病理性生长及肿瘤细胞的入血而异常表达。而且，此一特定标识物在细胞表面的表达量也因肿瘤不同而差异极大，包扩高表达与不表达。所有这些使得该技术在很多情况下捕获不到肿瘤细胞，从而限制了该技术的广泛普及与应用。最近临床上已有越来越多这方面的报道。 针对Immunicon/Veridex检测技术的致命缺点，我们采用了全新的思维方式，从而发明了一整套从根本上不同于Immunicon/Veridex的CTC检测方法。其基本原理就是应用特殊手段去除外周血中的绝大多数白细胞，从而将血中剩余的稀有细胞包括CTC进行富集及鉴别。与Immunicon/Veridex的方法相比，我们的优势是明显的：（1）大量的实验室及临床实验证明我们的方法流程简便，快捷，高效，即可用于手工操作，亦可使其自动化，能满足人们在不同档次的需

循环肿瘤细胞(CTC)的富集与检测

循环肿瘤细胞(CTC)的富集与检测 上海优宁维生物科技有限公司 1896年，澳大利亚学者Ashworth在一例转移性肿瘤患者血液中首次观察到从实体肿瘤中脱离并进入血液循环的肿瘤细胞，率先提出了循环肿瘤细胞（CTC）的概念。多数肿瘤几乎都会通过血液传播到身体的其他器官，癌细胞远端转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因，因此早期发现血液中的肿瘤细胞，对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗有着重要的指导作用。 随着研究的深入，研究人员鉴定出了更多的癌细胞生物标记物，如人类表皮生长因子受体2(HER2+)、表皮生长因子受体（EGFR）、类肝素酶（HPSE）和Notch1等。之前报道称这四种生物标记物与癌细胞迁移相关，结合这四种标记物就能够特异的标记扩散的癌细胞，并确定最终这些癌细胞所转移的位置。 大量实验证明循环肿瘤细胞的出现与乳腺癌患者的临床分期、及预后均密切相关。循环肿瘤细胞检测作为一种简单的血液检测，可随时捕捉并评估循环肿瘤细胞以确定转移性乳腺癌患者的预后。大量研究已经证实，CTCs检测将有助于乳腺癌复发转移监控、判断患者预后、指导术后辅助治疗等。与淋巴结、骨髓相比，外周血标本易获得、创伤性小、可反复采集，是临床上常规检测较为理想的标本来源，大大提高了这一方法的应用价值。 而且CTCs不仅是肿瘤预后和预测指标，也有可能成为药效学的生物标志物。比如在药物治疗后1-2周，通过CTC的检测，临床医师就可以观察循环细胞数量

的改变即可预测治疗效果，效果不好的以及时调整方案，不必让患者停留在无效治疗中甚至死亡。 目前，美天旎公司为您提供富集和检测CTC的多种产品，如autoMACS Pro全自动磁性细胞分选仪、手动磁珠分选设备及CTC富集磁珠，让您的CTC研究更便利和高效。 MACS分选用于肿瘤细胞的富集，有两种策略： ?阳性分选：CK/CD326、ErbB-2、CD30或其它肿瘤特异性标志优点：特异，受操作和其它非特异性颗粒影响小 缺点：不同类型的肿瘤细胞表达不同的标记物，选择某种标志时 不是所有肿瘤均表达 ?去除分选：CD45磁珠去除白细胞，富集肿瘤细胞 优点：覆盖面广，可以函概所有肿瘤 缺点：阴性成分中含有多种其它细胞和颗粒 针对不同类型的肿瘤细胞，我们提供各种肿瘤细胞富集和检测试剂盒：

循环肿瘤细胞CTC检测及临床应用

循环肿瘤细胞检测及临床应用 中文摘要：循环肿瘤细胞是从原发肿瘤扩散，进入到血液或淋巴系统的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞在血液中含量稀少，一般先将循环肿瘤细胞富集，然后再进行检测，现在已经开发了多种细胞富集和检测技术。本文主要对CTCs的富集和检测技术研究进展，以及CTCs在临床分析和研究上的应用进行了综述。 关键词：循环肿瘤细胞富集检测临床 Abstract: Circulating tumor cells come from the primary tumor proliferation,andproliferation, and then enter into the blood or lymphatic system. Circulating tumor cells are rare in the blood. Generally, circulating tumor cells should be enriched first, and then detected. A variety of cell enrichment and detection technologies have been developed. This paper reviews the research progress in CTCs enrichment and detection techniques, as well as analysis of CTCs in clinical and research. Key words: Circulating tumor cells enrichmentcells detectionenrichment detection clinical 癌症转移的过程是循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)从原发肿瘤分离，通过循环系统扩散，进入血液或者淋巴系统，在远处形成新的肿瘤，最终导致大多数的癌症病人死亡[1]。1869年，Ashworth在一例癌症死亡患者的外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出了CTCs的概念[2]。从此，越来越多的研究表明，CTCs的出现与癌症密切相关。通过上皮-间质转化(EMT)，实体瘤的上皮细胞进行细胞的变化，使他们通过增加流动性和侵袭性脱离组织，进入到血液中，附着，、发展成远端转移[3]。由于CTCs能够代表原发肿瘤的表型和遗传组成，并能够作为任何转移性肿瘤的”液体活检”，CTCs的富集分离和特征研究，十分具有吸引力。CTCs的富集和计数技术已经建立，其中CTCs的计数可以成为预测指标，当其大于已知的阈值时，就预示着病人就患有转移性乳腺癌[4]，、前列腺癌[5]，、结直肠癌等[6]。 基于临床试验，美国FDA批准了一种临床检测CTCs的Cell Search技术，用于上述癌症的CTCs的富集和计数。Cell Search技术成功的证明了CTCs确实表征了疾病的活跃，CTCs 数量的增加预示着病情的恶化，可以通过CTCs了解原发性和转移性肿瘤，以CTCs为基础的分析，可以帮助人们实时诊断和预测，对病情做出决定，并取样检测耐药性。大多数常规的癌症治疗方法在治疗转移性癌症方面难以成功，CTCs的可能促进肿瘤的临床研究。 CTCs在血液中极其稀少，数十亿的外周血细胞也阻碍了对CTCs的分离和分子鉴定。现在已经开发了大量的技术用于富集和检测CTCs，其中有些已经成功的用于测试或者临床评估。本文主要综述CTCs的富集和检测技术的研究进展，以及对CTCs的在临床分析和研究上应用。 1CTCs富集技术 为了从大量血液细胞中捕获数量稀少的CTCs，富集分离技术必须足够敏感性，可重复性，可靠，、快速，、便宜，并且所需获取血液量要尽量少，方便实现过程自动化，方便下游分析。此外，富集分离的CTCs要能够保持他们的活性，在富集分离的过程受到的干扰要尽量小，因为这可能改变CTCs的状态和表型[7]。 CTCs富集的技术有很多种，这些技术使用多个性能参数评估(即捕获效率，纯度，细胞活力，富集速度，血液样本容量等)，然后通过检测临床样本进行验证。最佳的富集分离方

循环肿瘤细胞(CTC)的基础知识

循环肿瘤细胞（CTC）的一些基础知识 摘要：通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞（circulating tumor cell）。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断，化疗药物的快速评估，个体化治疗包括临川筛药、耐药性的检测，肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。检测CTC 有着良好的应用前景，随着这一研究领域的不断发展，必将产生新的诊疗手段，从而使肿瘤的治疗提高到一个崭新的阶段。 关键词：循环肿瘤细胞；CTC；检测方法；临床意义 早在1896年，Ashworth曾报道1例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）的概念[1]。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。 1、概述 CTC指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。随着肿瘤细胞的不断增殖,部分细胞可以通过分泌一种抑制黏附因子表达的物质,增加其运动能力并使之与肿瘤母体脱离。这些脱落的肿瘤细胞再分泌一种蛋白溶解酶，以破坏周边宿主结缔组织并进入脉管系统。诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环。 2、检测方法 2.1免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC） 这一检测方法基于抗原抗体结合反应的原理，利用单克隆抗体（McAb）与特异的肿瘤标记物结合，并通过酶与底物反应显色来判断肿瘤细胞的存在。检测的肿瘤标志物主要分三类：①上皮细胞角蛋白（CK），如CK19；②上皮细胞膜特异性抗原，如黏蛋白类，包括EMA、HMFG、HEA125等；③肿瘤相关糖蛋白（TAG），如TAG12。1980年，Sloane等首次 采用ICC的方法检测乳腺癌患者骨髓中的肿瘤细胞。该方法可以进行形态学分析，但是检 测的细胞量少，敏感性只有10－4～10－5（即在1万~10万个单核细胞中发现一个肿瘤细胞），而且许多分化差的肿瘤不能表达目标抗原，而非上皮细胞中细胞角蛋白和上皮细胞抗原亦可能阳性,故特异性不高。Braun等[2]认为由于CTC不表达白细胞共同抗原CD45，采用CD45－/CK＋双标技术可以提高ICC检测的特异性。 2.2多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 该方法的原理是特异性扩增出肿瘤细胞中因癌基因、抑癌基因突变或染色体重排而产生 的DNA异常。这类基因的改变应满足以下条件：①该基因的突变在待检肿瘤中发生率较高，至少应达50％左右；②基因内发生碱基突变的部位应相对集中，如果过分分散，目前临床 应用有困难。这一方法检测肿瘤细胞的敏感性约1×10－6左右，比Southern印迹杂交法约提高10 000倍。应用PCR技术检测CTC受到缺乏肿瘤特异性和高表达标记的限制，该方法敏感度高，易出现假阳性，同时由于癌细胞的异质性亦可出现假阴性。目前多应用突变等位基因扩增（mutant allelie specific amplification, MASA）的PCR技术，检测大肠癌和胰 腺癌患者外周血中具有K-ras癌基因突变的肿瘤细胞。 2.3逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）