石栗accD基因全长cDNA的克隆及序列分析

实验六 基因克隆及序列分析

实验六、基因克隆及序列分析 1.目的片段回收 取5 μl PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上检测，如果扩增产物大小与原来一致，在紫外灯管下用刀片切下目标带，然后用UNIQ-10 Column DNA Collection Kit 试剂盒（上海生工）进行回收。具体回收过程如下：从琼脂糖凝胶中精确切下包含有目标片段的胶块，放入到1.5 ml离心管中，加入500 μl Binding Buffer II，50℃~60℃水浴锅中放置10 min，使胶彻底熔化，然后将熔化的胶溶液转移到套放于2 ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2 min，8000 r/min离心1 min，倒去收集管中的废液，在UNIQ-10柱中加入500 μl Washing Solution，室温8000 r/min离心1 min，加入新鲜的Washing Solution重复一次，倒去收集管中的废液，室温12000 r/min离心15 s。在UNIQ-10柱中加入Elution Buffer 30 μl（直接滴到过滤膜上），37℃放置2 min，放到一个新的1.5 ml离心管后离心收集（12000 r/min，1 min），所得溶液用于连接反应。 2 片段连接反应 采用pGEM? -T Easy Vector试剂盒（Promega，A1360）进行目标片段的克隆。取1.5 μl PCR产物，加入0.5 μl T4 DNA ligase，0.5μl T Easy Vector，2.5 μl ligation buffer，短暂离心收集，轻轻混匀，置于室温连接1-2 h后，放于4?C冰箱过夜。 3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 取保存于-70℃的大肠杆菌菌株DH5α菌液，首先在LB固体培养基上分离单克隆，然后挑一个单克隆进行液体培养过夜。从中取1.0 ml菌液转接于装有100 ml LB液体培养基的250 ml三角瓶中，于摇床培养1.5~2 h（37℃，240 r/min），后转移至预冷的50 ml离心管中，冰浴10 min，低温离心10 min（4℃，4000 r/min）收集菌体，加入25 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬培养物，冰浴20-30 min，4℃4000r/min离心10 min，去上清液，倒立晾干，再加2 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%的甘油）重悬细胞，分装于冰浴的0.5 ml无菌离心管中，放入-70℃冰箱保存。 取2 μl连接反应物转到1.5 ml离心管中，冰上保存待用。从-70℃冰箱中取出感受态细胞置于冰上，待其刚好融化时（约5 min）小心吸取30-50 μl转入到离心管中，冰上静置20 min。42℃水浴中热激90 s（不要摇动）。迅速放回冰上2 min，然后加入LB培养基（室温）400 μl，37℃摇床培养1.5 h（150 r/min）。

【高中生物】功能基因的克隆及生物信息学分析

（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多

控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸

全长cDNA酶切和连接体系

用测序时所构建的各片段重组质粒作模板，用新合成的加有连接酶切位点的引物扩增出需要连接的各片段。LF1在扩增时，由于片段比较长，故分为两步进行扩增，第一步扩增后，连接到pMD-18T载体上，再用此作模板进行第二次扩增。得到所需的加有酶切位点和启动子序列的目的片段，再将其克隆到pMD-18T载体上。使用时每次从载体上切取目的片段进行连接。 F5、F6和F7片段的连接，F5(Not I/ Fsp I)、F6(Fsp I/Csp45 I)、F7(Csp45 I/Sal I)分别进行酶切，将载体pGEM5zf同时进行Not I/Sal I双酶切，分别将各酶切产物进行纯化回收。由于F5片段和载体pMD18-T大小相近，故无法回收酶切后的目的片段，所以F5片段直接采用 酶切buffer F5用buffer D、F6用buffer B、F7用buffer D F21和F22的连接，将F21和F22 PCR测序片段分别用Nhe I酶切后，回收目的条带，将二者用T4 DNA酶连接后，克隆到T-easy载体上。即为连接全长所用的F2片段。连接时，直接用设计时的两端酶切位点。 LF3和LF4同样用Acc III酶切后，用T4 DNA连接酶连接，再克隆到pMD-18T载体上，用于5’半长的连接。 F21、F22连接酶切体系： Nhe I 1μl；10×M buffer 2μl；DNA 17μl； F3、F4连接酶切体系： Acc III 1μl；10×F buffer 2μl；BSA 0.2μl；DNA 16.8μl。 37℃3h酶切。纯化回收时，注意各种限制性酶的灭活(65℃,10min)。 连接体系： T4 DNA连接酶buffer 2μl；T-easy(F2) or pMD-18T(F34) 2μl；回收DNA片段15μl；T4 DNA连接酶1μl。16℃6h，再4℃过夜。转化感受态JM109。

甘蔗MYB2转录因子的电子克隆和生物信息学分析

第9卷第1期2011年3月生物信息学 China Journal of Bioinformatics Vol．9No．1Mar．，2011 收稿日期：2010－04－29；修回日期：2010－09－06．基金项目：国家948项目（2010－C21）。 作者简介：李国印，男，山东菏泽，硕士研究生E －mail ：lyion029@163．com． *通讯作者：许莉萍，女，福建莆田，博士，博导、研究员，E －mail ：xlpmail@yahoo．com．cn． doi ：10.3969/j．issn．1672－5565．2011．01．006 甘蔗MYB2转录因子的电子克隆和生物信息学分析 李国印，阙友雄，许莉萍* ，郭晋隆，闫学兵，陈如凯 （福建农林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室，福建福州350002） 摘要：用电子克隆方法获得甘蔗MYB2基因，采用生物信息学方法，对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构 域、 疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明：甘蔗MYB2基因全长991bp ，包含570bp 的ORF ，编码189个氨基酸。甘蔗MYB2基因包含有MYB 功能域，在序列组成、高级结构及活性位点等方面，与玉米等其它植物的MYB2基因具有高度的相似性。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。关键词：甘蔗；MYB2基因；电子克隆；生物信息学中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：1672－5565（2011）－01－024－04 Electronic cloning and characterization of MYB 2gene from Saccharum officinarum using bioinformatics tools LI Guo-yin ，QUE You-xiong ，XU Li-ping *，GUO Jin-long ，YAN Xue-bing ，CHEN Ru-kai （Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement ，Ministry of Agriculture ，Fujian Agriculture＆Forestry University ，Fuzhou 350002，China ） Abstract ：An novel MYB2gene from Saccharum officinarum was cloned in silico based on the EST seqences from Unigene of NCBI．Some characters of the MYB2encodes amino acid were analyzed and predicted by the tools of bioinformatics in the following aspects ，including the compositon of amino acid sequence ，hydrophobicity or hydro-philicity ，secondary and tertiary structure of protein and funcion．Bioinformatical analysis showed that the full －length of MYB2gene from S．officinarum was 991bp and it contained a complete ORF which encoded 189amino acid．The MYB2gene contained an typical MYB domain and was highly conservative compared with MYB2from several different plant species in sequence compositon ，advanced structure and activity sites．The results will pro-vide the basis for MYB2gene cloning in experiment． Key words ：Saccharum officinarum ，MYB2gene ，In silico cloning ，Bioinformatics 在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB 结构 域的转录因子C1基因［1］ ， 此后在植物中发现的MYB 相关基因的数量迅速增加。对其功能的研究表明，植物MYB 转录因子具有广泛的生理功能，几乎参与植物发育和代谢的各个方面，重点是调控环境胁迫，如干旱和病害逆境胁迫、次生代谢调节、激素调控应答及控制细胞分化等。 植物MYB2转录因子是MYB 大家族中一个小的亚族，虽然不同植物的MYB2基因具有不同的生物学功能 ［2，3］ ，但它们都是在转录水平上调控植物 各个阶段的生长发育。通过突变体及基因敲除技 术，已克隆了很多植物MYB 类基因，但在甘蔗MYB 方面研究甚少。 以NCBI 数据库为基础，电子克隆得到甘蔗中编码MYB2的cDNA 序列，利用生物信息学方法，对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、疏水性、亚细胞定位及结构功能等方面进行预测和分析，为后续通过实验手段克隆甘蔗MYB2基因和基因功能研究奠定基础。

DNA基因克隆及序列分析,英语翻译

热和酸应力条件下脂环酸芽孢杆菌Dnak基因克隆和序列分析 DNA基因克隆及序列分析。通过兼并PCR基因组扩增获得了大约1300bp的基因片段，然后子克隆到PMD-18T载体上测序。BLAST基因组数据库搜索表明，此PCR产物的序列共享原核热休克蛋白70 DNAK基因，与来自脂环酸芽孢杆菌LAA1伴侣蛋白的DNAK基因的同源性是最高的（92%）。通过基因组步移技术测定DNAK 基因（基因组数据库登录号HQ893543），包含1854bp完整的开放阅读对话框（ORF），编码617个氨基酸。推知的氨基酸序列与来自A. acidocaldarius LAA1 (86%)的DNAK基因表达的伴侣蛋白的相似性最高，与来自Bacillus tusciae,Paenibacillus sp.Y412MC10,Thermosinus carboxydivorans, Brevibacillus brevis 的 A. acidocaldarius 的相似性分别为83%, 77%, 76%,75%。没有检测到信号肽。预测分子量是(Mw)是66.2KDa，等电点（pI）是4.82. 氨基酸序列比对和主题搜索结果显示，在这个基因中有3个域：N末端核苷酸结合域(NBD, aa 1–360)类似于肌动蛋白ATP酶结构域，它包括三个保存位点(-I-D-L-G-T-T-N-S-, -V-F-D-L-G-G-G-T-F-D-V-S-I-L-,和V-I-L-V-G-G-S-T-R-I-P-A-V-Q-E) ，它可能与ATP绑定和激活有关；aa 360–517组成C-末端底物结合域(SBD);aa- 484–617组成的C-末端子域，它可能和底物的结合和释放有关。 脂环酸芽孢杆菌在不同的培养温度下DNAK基因的表达。脂环酸芽孢杆菌生长的温度范围从20°C - 60°C，最适生长温度为45-50°C。在这项研究中，脂环酸芽孢杆菌DSM 3922T在45°C中活跃培养16小时，分别在20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C和60°C繁殖生长。根据观察脂环酸芽孢杆菌在温度为30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C和55°C正常生长。在55°C和30°C生长时，分别繁殖8小时和10小时时达到对数生长期。然而，在培养温度为20°C，25°C或者60°C时，芽孢生长及其缓慢，与其他处理组像比较很难进入指数生长期。值的注意的是，在繁殖温度为20°C，25°C和60°C 时没法收集到足够的细菌ＲＮＡ用于分离和表达分析。 如图２所示，ＤｎａＫ在培养温度为30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C 和55°C的基本表达情况。在脂环酸芽孢杆菌最适生长温度(40–55°C),其表达水平相对稳定。在较低的温度下，30°C和35°C,Ｄｎａｋ的表达大幅升高。这表明Ｄｎａｋ可能参与脂环酸芽孢杆菌对不良环境的适应。 在热应力条件下脂环酸芽孢杆菌DNAK的表达。在实验中，热应力加在45°C 繁殖生长到指数生长期摇瓶菌悬液内的细菌上，然后置于温度分别为70°C, 80°C, 90°C的恒温浴内。在80°C和 90°C时，开始10分钟内，细菌正常生长，15分钟后细胞开始破裂。随着热应力的继续，有明显的细胞裂解和细胞凋亡的进一步加剧。在80°C,和90°C时仅仅热应力持续5分钟和10分钟，提取的RNA适合做进一步分析，热冲击15分钟或更长时间，提取的RNA严重退化，不能用于ＲＴ－ＰＣＲ分析。当孵育温度70°C热冲击，所有的时间范围内细菌维持正常生长，全部的RNA被分离用于ＲＴ－ＰＣＲ检测。 正如图３所示，以70°C的热冲击温度，与对照在不孵育的脂环酸芽孢杆菌相比，ＤＮＡＫ的表达水平在孵育５分钟增加了４０％，长时间的热冲击，表达水平下降，与对照的相比２５分钟孵育的细菌ＤＮＡＫ表达水平提高了３０％，当热休克在80°C和90°C时，与对照相比，在5分钟内细菌的DNAK表

红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯

毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校

华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告

癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。

功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。

小鼠GITRL基因的克隆和序列分析

第14卷第2期2004年4月 江苏大学学报(医学版) Journal of Jiangsu University(medicine) Vol.14No.2 Apr.2004 小鼠GITRL基因的克隆和序列分析 王胜军1,2,马 斌1,仝 佳1,许化溪1,杨胜利2 (1.江苏大学医学技术学院免疫学研究室;2.江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212001) [摘 要] 目的:克隆小鼠GITRL基因全长编码区的cDNA,同时对其序列分析。方法:采用RT PCR方法,从小鼠树突状细胞获得GITRL基因的cDNA,克隆至pMD18 T载体,选择阳性克隆并进行序列测定。结果:扩增得到的GITRL基因编码区cDNA的全长519bp,编码173个氨基酸残基,与GeneBank中发表的序列完全一致。结论:获得小鼠GITRL基因的克隆,为进一步研究其生物学功能提供基础。 [关键词] GITRL基因;cDNA克隆;RT PCR;调节性T细胞;小鼠 [中图分类号] R394 [文献标识码] A [文章编号] 1671-7783(2004)02-0097-04 Cloning and Sequence Analysis of Mouse Glucocorticoid induced Tumor Necrosis Factor Receptor Ligand Gene WANG Sheng jun1,2,MA Bin1,TONG Jia1,XU Hua xi1,Y ANG Sheng li2 (1.Department of Immunol ogy,School of Medical Technology,Jiangsu Universi ty,Zhenjiang Jiangs u212001,China; 2.Li fe Science Institute,Jiangs u University,Zhenjiang Jiangs u212013,China) [Abstract] Objective:To clone and analyze the cDNA enc oding mouse glucoc orticoid induced tumor necrosis fac tor receptor ligand(G ITRL)gene,a type transmembrance protein of the tumor necrosis factor(TNF)su perfamily.Methods:The c DNA of GITR L was amplified from total RNA e xtracted from mouse dendritic cells (DC)by RT PC R and inserted into pMD18 T vector,and the sequence of the DNA was analyzed.Results:The c DNA of GITRL has the length of519bp with an complete open reading frame,which encodes a product of173 a mino acid and shares100%homology with the sequence of mRNA for mouse G ITRL in GeneBank.Conclu sion:The cDNA of G ITRL was successfully cloned,which brought a founda tion for further researching on its bio logical function. [Key words] Glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor ligand;cDNA cloning;RT PCR;Dendrit ic cell;Mouse 小鼠GI TR(glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor)最初是1997年Nocentini等人[1]在地塞米松诱导T细胞杂交瘤细胞中发现的膜蛋白受体,由228个氨基酸组成,富含半胱氨酸的重复结构域,但不含DD结构域(death domain),具有许多TNF 受体超家族的特征,被命名为TNFRSF18,随后人类对应的蛋白也被发现[2]。2003年12月Tone[3]和Kime[4]等人同时发现其配体G ITRL,初步研究结果表明GI TRL具有阻断C D4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)免疫抑制功能的作用。本研究从小鼠树突状细胞(dendritic cells,DCs)中通过RT PCR扩增出G ITRL的cDNA,并进行序列分析。 1 材料和方法 1 1 材料 RPMI1640及胎牛血清为Gibc o公司产品,小鼠GM CSF、TNF 为Peprotech公司产品,PE标记抗小鼠H 2Kd单克隆抗体及FI TC标记抗小鼠CD11c单克隆抗体为BD Pharmingen公司产品,Trizol及逆转 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(30300169)和江苏省社会发展资助项目(BS2000026) [作者简介]王胜军(1969-),男,江苏镇江人,副教授,主要从事免疫调节研究。

乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析

乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析 【摘要】目的：克隆并分析保加利亚德氏乳杆菌中的乳糖酶基因。方法：利用PCR技术从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出乳糖酶基因、测序并生物信息学分析。结果：成功的从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出全长为3 024 bp的乳糖酶基因，利用生物软件分析，推测乳糖酶基因共编码1 008个氨基酸，蛋白分子量为114 KDa，等电点为4.9，氨基酸序列中共有9处潜在的糖基化位点。并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行同源性比较。结论：成功的克隆出乳糖酶基因，并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解该酶的性质特征，为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。 【关键词】乳糖酶基因；克隆；生物信息学分析 Clone and bioinformatics analysis of lactase gene WANG Zheng1, 2, MA Wen li1, ZHENG Wen ling1 (1.Institute of Gene Project, South Medical University Guangzhou 510510, China; 2.Key Laboratory of Molecular Biology, Hainan Medical College Haikou 571101, China ) ［ABSTRACT］Objective: To clone and analyze lactase gene from Lactobacillus delbrueckii bulgaricus. Methods: Cloned lactase gene from Lactobacillus delbrueckii bulgaricus with PCR, made sequencing and bioinformatics analysis. Results: Cloned lactase gene (3 024 bp) successfully. It was presumed that the lactase gene encode 1 008 amino acids, with protein molecule 114 KDa, isoelectric point 4.9, 9 potential glycosylation sites in amino acid sequence. Made homology comparison with other lacteses. Conclusion: The lactase gene is cloned successfully and the bioinformatics analysis is made by biological analysis software to investigate its character. It provides foundation for further study and colonization at low cost. ［KEY WORDS］Lactase gene; Clone; Bioinformatics analysis 乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质，还含有免疫球蛋白等抗病因子，易被人体消化吸收，是人类改善营养、增强体质的理想食品［1］。除此之外，在牛乳等制品当中还含有5%左右的乳糖,它是牛奶中主要的碳水化合物，对人体有着重要的作用。主要表现在于乳糖能促进钙质吸收及整理肠道的功效，特别是乳糖被分解后的半乳糖是婴儿脑发育的必需物质，与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。然而，人体却不能直接利用乳糖，它必须被乳糖酶分解为单糖的葡萄糖及半乳糖后才能被吸收和利用。据研究发现，世界各国人口都有不同程度的乳糖酶缺乏，东方人乳糖酶缺乏高达85%［2］，从而导致“乳糖不耐症”的发生。 乳糖酶(EC3．2．1．23，又名β 半乳糖苷酶)能将牛乳中的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，并具有半乳糖苷的转移作用［3］。利用该酶生产低乳糖制品或口服酶制剂，能够有效解决“乳糖不耐症”问题。乳糖酶广泛存在于扁桃、桃、杏、苹果和咖啡豆等植物中，大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和霉菌等微生物中，以及有效哺乳动物的小肠等器官和皮肤组织中。然而，

全长CDNA克隆方法

全长CDNA克隆方法 以MITF基因为例,简述全长CDNA克隆的方法. 方法分三步: 1.克隆中间片段 2.克隆3’片段 3. 克隆5’片段,然后再将3者重复序列删除,拼接起来. 1.中间序列克隆 提取锦鲤的皮肤组织的mRNA,然后跑胶检测。如果有2根带,则显示mRNA 提取成功. 然后反转录成CDNA，检测B-actin。 首先在NCBI上查找mitf基因,获取该基因的序列,CDS区,基因编号.并且保存,以备以后比对序列用.选取斑马鱼的mitf a 为模板. 引物合成:用Primer 5设计 a.引物长度:长度一般在18-30个碱基。一般都是18-24个左右。 b.GC含量：一般引物GC含量为40%-60%，一对引物的GC含量和TM值要协调。 如果引物存在严重的GC或者AT倾向，可以在引物最后加适当A.T.C.G尾巴c.退火温度：退火温度需要比解链温度低5度。适当提高引物退火温度可以使 PCR的特异性增加。一般设计一对引物的TM值应该要比较接近，一般在0-4度以内，不会影响PCR的产率。温度在55-75度之间。 d.避免扩增模板的二级结构区域，一对引物之间不应该存在4个连续碱基的同 源性或者互补性。选取时尽量选取分高的组合。 设计引物时，尽量增加克隆的中间片段长度，为避免5‘和3’克隆出现长片段。 引物设计好以后，根据引物的TM值，首先设计温度，做梯度PCR. 比如TM为65度，设计梯度时可以设计63,64,65,66. 4个梯度。然后根据跑胶结果确定大体系的TM值，如有目的带，直接胶回收。然后进行链接，转化。送公司测序。 测序结果出来后，用Chmas软件打开，并将其转化为TXT格式的碱基序列。 用Jellyfish里面，找特异性的正向，反向引物。找完正向后，将序列反过来再找反向引物。只有都能找到2个引物的序列才能算测序成功。将特异性引物两端的序列全部删除，（那是对应载体的序列）。保存克隆的中间序列，然后跟斑马鱼的序列对比，一般重复性在90%以上。若有几组序列满足要求，用着几组进行对比突变的地方按照重复多的碱基最为标准。尽量选2组以上序列。 2. 3‘克隆 克隆3‘的时候要重新用mRNA做反转录，在做反转录的时候要加上3‘接头。（接头由自己合成）。 设计引物：正向的外侧引物和内侧引物 反向的UPM和NUP 一般设计特异性引物的TM值为接近60度，最后60度以上。 首先用外侧引物和UPM做10ul体系的下体系。然后用其PCR产物模板稀释10-40倍。用作内侧引物+NUP的PCR反应模板。做大系统检测最适合TM值。找到以后直接进行胶回收，链接转化，测序。 第一轮的TM值需要摸索，第一轮以后通常是弥散的条带。如果多次尝试还是不

全长cDNA主要构建方法的比较

全长cDNA主要构建方法的比较 摘要全长cDNA文库的构建是进行功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径,克服了传统cDNA 文库的缺点,本文主要介绍了两种较为实用的方法，分别是SMART法和Cap trapper法。 关键词：全长cDNA构建SMART法Cap trapper法 随着测序技术和计算机科学的不断发展，大部分生物和人类的基因组全序列测定高速完成。cDNA作为基因克隆的一种重要工具，在帮助人们更好的发现新基因和研究基因功能上发挥了巨大的作用。但是，由于传统的cDNA由于反转录能力差，cDNA酶切位点保护不彻底和非cDNA片段插入导致克隆片段短、无效克隆多和全长率低等缺点,因而无法满足大规模、高通量、高效的功能基因组研究需要。而全长cDNA序列大多数拥有5’和3’端非编码区序列,因而弥补了传统cDNA文库构建方法的缺陷,成为目前基因克隆的一种重要方法。 目前主要有CAPture法，Oligo capping法，SMART法，Cap jumping法以及Cap trapper 法。本文主要介绍优点突出的两个方法，SMART法和Cap trapper法。

SMART 方法 SMART 方法是Chenchik 等1996 年提出的[3]，该方法利用PowerscriptTMRT 反转录酶的反转录、末端转移活性和内切酶sfiⅠ的特性，快速、简单地构建全长cDNA 文库。PowerscriptTMRT 反转录酶是M-MLVR点突变而来的，丧失了RnaseH 的活性，但保留着野生型聚合酶转移酶的活性，能够长距离的反转录，又可识别mR-NA5’帽子结构。原始一链合成中，转移酶的活性低，延伸效率低。用于反转录的5’端poly(A)引物和延伸模板分别含有sfiI（A）、sfiI（B）识别位点的寡聚核苷酸序列。而截短的一链cDNA，反转录酶没有识别到mRNA5’帽子结构，一链cDNA3/ 端不能被延伸、合成和扩增二链。两端含有sfiI 识别位点的全长cDNA，经两种类型（A、B）内切酶sfiI 酶切，使两端产生不同的粘性末端，而全长cDNA 内部由于sfiI 识别位点在基因组中很少见而得以保护，这样就实现了目的全长基因的高效定向克隆。与其他方法相比，此方法有其独特的优点（1）所需起始材料少，一般0.5~1μg mRNA（2）mRNA 在合成cDNA 前无需任何酶反应或化学反应处理，不会导致处理过程中mRNA 的降解和损耗。（3）实验过程快速、简单，整个过程没有对mRNA 和中间产物的复杂处理。（4）全长比例较高[13]。SMART 方法也有其自身明显的缺点（：1）PCR 扩增具有选择性，不利于长片段序列的扩增，使一些长片段的全长基因丢失，不易得到大于3kb 片段和低峰度 全长基因[13]2）dG 加尾效率低，导致文库中基因信息丢失，文库缺乏代表性。在实际应用中，该方法快速、简单的优点使之广受青睐[14~17]，尤其是在医学领域中应用较广[18~20]。 4 CAP- trapper 方法

绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析

3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒

受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果

基因克隆和表达

Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.wendangku.net/doc/513697503.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006