红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯

毕业设计/论文

开题报告

课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文

系别城市建设学院

专业班生物工程0701班

姓名于凯

评分

指导教师

华中科技大学武昌分校

华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告

癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。

研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。

若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。

如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。

另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。

1.1.3关于MYB基因

①MYB基因

目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。

2MYB基因编码蛋白（MYB蛋白）的结构特征

作为一类转录因子，无论在动物和植物中，MYB蛋白均具有高度保守的DNA结合结构

域以及转录激活域。动物中的MYB蛋白DNA结合域通常含有3个50-55个氨基酸的不完全重复区，每个重复区折叠成一个螺旋-转角-螺旋（HTH）结构，插入到目标DNA的大沟中[8]。植物的MYB蛋白大多含两个重复区，分别与动物MYB蛋白DNA结合结构的R2、R3相似，也发现了有3个重复区及只含有1个重复区的MYB蛋白[9]。MYB蛋白的DNA结合结构域集中在氨基端(图1)，每个重复区含有3个在空间上规则排列的色氨酸残基，这3个色氨酸残基在折叠形成MYB结构域的疏水核心中起重要作用，一般在所有的MYB 蛋白中是保守的，但R3的第1个色氨酸残基可被芳香族氨基酸(如苯丙氨酸)或其他疏水氨基酸所代替[10]。

③MYB基因的功能

通过转录因子在转录水平上调控目的基因的表达是植物对其生长发育及生理代谢调控的一种重要方式。MYB转录因子是最大的植物转录因子家族成员之一，几乎参与了植物发育和代谢的各个方面[11]。MYB类转录因子可与其它转录因子家族成员尤其是bHLH类转录因子相互作用，通过组合调控的方式调节植物细胞的形成与模式建成，调节植物次生代谢特别是苯丙氨酸代谢，并对外界环境、激素及病虫害等做出应答[12]。

④MYB基因的研究进展

自Paz-Ares等从单子叶植物玉米中克隆出与色素合成相关的ZmMYBC1基因以来，大量MYB类基因从各种植物中得以分离鉴定[12]。其中在拟南芥中已发现超过198个Myb 家族基因，玉米有超过80个MYB转录因子，而棉花中发现大约有200个MYB转录因子[13]。

大量的研究表明，MYB基因，特别是R2R3-MYB基因在参与调控植物次生代谢途径中的作用至关重要。详细的调控情况见下表[14]

1.2研究的目的和意义

先从红豆杉细胞中克隆MYB基因，探索这种基因表达的转录因子与红豆杉细胞中次级代谢产物紫杉醇的表达量的关系。从而为构建基因工程植株，工业化生产紫杉醇提供依据。

探索红豆杉细胞中转录因子对其次级代谢产物紫杉醇的调控作用，有利于了解紫杉醇的生物合成途径，能够给构建高产紫杉醇的转基因工业化菌种或植物提供方向。如果MYB基因的表达确实在调控紫杉醇的合成过程中起到促进作用，接下来就可以建立转基因植株，以及建立更为期待的转基因工程菌种，为紫杉醇的工业化生产提供思路。这一方面有利于满足当今社会人们对这种抗癌特效药的需求，也在另一方面保护了红豆杉物种，维持了生态平衡，实现了生态的可持续发展。

2课题研究的主要内容

2.1本课题研究的切入点

MYB转录因子在多种植物中参与了次生代谢产物的调控，如在苯丙素代谢途径中的关键调控作用[15]，以及对于花色素苷的产生起着关键作用[16]，而且能够有效增强类黄酮生物合成基因的表达[17]，等等。目前，许多研究表明，作为代谢途径的关键基因的转录因子，MYB基因的表达产物对于萜类次级代谢产物的合成至关重要[18]。紫杉醇就是一种四环二萜类化合物[19]，它在红豆杉中的生物合成是否也受到MYB转录因子的调节，参与紫杉醇生物合成途径的关键酶基因的启动子是否能够被MYB转录因子所识别，从而调控这些基因的表达。因此，本课题从转录调控的角度，探索红豆杉MYB转录因子在其次级代谢产物合成过程中的作用，尤其是对于代谢产物紫杉醇的调节作用。

3.研究方法

3.1研究方案

（1）提取红豆杉总RNA

①Trizol法提取总RNA

②浓度和纯度检测：用紫外分光光度计测定样品OD260、OD280和OD230的值

以及

OD260/OD280和OD260/OD230的比值。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA纯度、完整性。

（2）逆转录合成第一链

按照反转录试剂盒说明书的方法合成cDNA第一链。

（3）利用特异引物扩增cDNA

PCR扩增程序：95℃预变性6min，94℃变性40s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环后降温10min，16℃保温10min。

（4）序列分析

①将（3）中的PCR产物与marker进行琼脂糖凝胶电泳，对比检验扩增产物，确定其分子量大小。

②回收DNA。

（5）基因表达分析

采用荧光定量PCR技术对回收的基因进行定性和定量分析。

（6）构建原核表达载体，进行原核表达

构建的原核表达载体pET32a(+),并将MYB基因克隆入载体内，经PCR和测序鉴定正确的重组质粒，并在大肠杆菌中进行表达。

（7）构建亚细胞定位载体，胞内定位分析

构建亚细胞定位载体pCAMBIA1304，基因枪法转入洋葱表皮细胞，通过GFP荧光检测MYB基因在胞内定位情况。

（8）构建组成型表达载体pCAMBIA1303

构建组成型表达载体pCAMBIA1303,并将MYB基因克隆入该载体内，经PCR和测序鉴定正确的重组质粒，瞬时转化红豆杉细胞验证。

3.2可行性分析

本实验所使用的方法都是建立在分子生物学和基因工程平台上的，我们所在的实验室正是一个专门研究分子生物学和基因工程实验室，该实验室成熟度技术平台是我们实验的前提条件；况且余龙江教授所带的团队已经从事红豆杉细胞中紫杉醇合成途径及其关键基因研究多年，所以我们的目的基因相关序列已近公布，这为我们设计扩增引物提供了方便。另外，实验所要运用到基因工程常用技术，如反转录构合成cDNA、目的基因的PCR扩增、目的基因的检测等已经非常成熟。然后，载体构建和原、真核细胞转化技术也已经非常成熟，不会存在困难。最后，目的基因在转化细胞中的表达及功能分析，也能够在实验室顺利地进行。

4实施计划

1-4周，熟悉研究任务、查阅资料、进行开题报告撰写、开题答辩及外文文献翻译5-6周，查阅资料，确定实验方案，准备相关的原料、设备等

6-7周，MYB家族基因克隆和序列分析

8-10周，构建表达载体

11-12周，表达模式研究

13-14周，整理数据，分析结论，完成各种数据的分析，完成论文初稿

15周，根据指导教师修改意见对论文初稿进行修改，并按格式规范定稿

16周，申请和接受答辩资格审查，进行毕业设计答辩

主要参考文献

[1]隋广文、赵海涛等.东北红豆杉的发展前景与效益分析.药用植物.2010.7，40.

[2]杜亚填等.红豆杉植物和愈伤组织培养物中紫杉醇含量的检测.林产化工通迅.2005.

[3]张修前.漫谈天然抗癌药物—紫杉醇.中学生物学.2009.Vo1.25No.9：3-4.

[4]蒋丽秀.关于紫杉醇研究进展及药学研究的讨论.中国中医药咨.2009.Vo1.2

No.14：266

[5]史清文等.抗癌药物紫杉醇研发历程的思考与分析.医学与哲学.2010.Vo1.31No.6：

6-14

[6]Lin-Wang.et.al.An R2R3MYB transcription factor associated with regulation of the

anthocyanin biosynthetic pathway in Rosaceae.BMC Plant Biology.2010.

[7]Ralf Stracke.et.al.Differential regulation of closely related R2R3-MYB transcription

factors controls flavonol accumulation in different parts of the Arabidopsis thaliana seedling.The Plant Journal.2007.50，660–677.

[8]AH Alm-Kristiansen.et.al.FLASH acts as a co-activator of the transcription factor c-Myb

andlocalizes to active RNA polymerase II foci.Oncogene.2008.27，4644–4656

[9]AR Thorner.et.al.Kui Lin-Wang.et.al.An R2R3MYB transcription factor associated with

regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway in Rosaceae.Plant Biology.2010.

10:50，1471-2229/10/50.

[10]吴春霞.植物MYB基因的研究进展.安徽农业科学.2009.37：9372-9374.

[11]In vitro and in vivo analysis of B-Myb in basal-like breast cancer.Oncogene.2009.28，

742–751

[12]Qibin Ma.et al.Enhance Tolerance to Chilling Stress in OsMYBR-2Transgnic Rice Is

Mediated by Ateration in Cell Cycle and Ectopic Expression of StressGenes.2009. [13]Golay J.et.al.Regulation of hematopoietic cell proliferation and differentiation by the

myb oncogene family of Transcription https://www.wendangku.net/doc/60503996.html,b.Re.1996.

[14]陈清等.植物MYB转录因子的研究进展.基因组学与应用生物学.2009.Vo1.28，

No.2：365-372.

[15]Schulze-Lefert P,Dangl JL,Becker-Andre M,Hahlbrock K,Schulz W.nducible in vivo

DNA footprints de?ne sequences necessary for UV light activation of the parsley chalcone synthase gene.EMBO.1989.

[16]Judith Bender and Gerald R.Fink.A Myb homologue,ATR1,activates trytophan gene

expression in Arabidopsis.Science.1998.

[17]Stefan Czemmel.et.al.The Grapevine R2R3-MYB Transcription Factor VvMYBF1

Regulates Flavonol Synthesis in Developing Grape Berries.Plant Physiology.2009.

Vol.151：1513-1530.

[18]Downey MO,Mazza M,Krstic MP.Development of a stable extract for anthocyanins

and?avonols from grape skin.Am J Enol Vitic.2007.

[19]朱英杰等.RP—HPLC测定曼地亚红豆杉中紫杉醇的含量.天然产物研究与开

发.2009.21：425-427.

指导教师意见

指导教师签字：

年月日教研室审查意见：

教研室负责人签字：

年月日系审查意见：

系主任签字：

（系公章）

年月日（此表由学生填写，指导教师、教研室、系签署意见）

【高中生物】功能基因的克隆及生物信息学分析

（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多

控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸

红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯

毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校

华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告

癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。

功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。

绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析

3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒

受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果

基因克隆和表达

Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.wendangku.net/doc/60503996.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006

第五章基因克隆技术

第五章基因克隆技术 基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。 基因克隆的一般程序为： 一、获取目的基因 目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。 2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。 3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。 4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。 二、选择适当的载体 按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。理想的载体应该是：(1)分子量较小，能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子；(2)具有特异的限制性酶切位点，便于外源DNA片段的插入，且有明显的遗传筛选标志，如抗药性或插入失活等，以利于阳性克隆的筛选；(4)具有生物安全性。常用的克隆载体可分为三类，即质粒、噬菌体及病毒。由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点，现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。 1、质粒载体质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子，质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒载体具有如下特点：分子相对较小(3~10kb)；含松弛型复制子因而在

gfp基因的克隆与表达

基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L

目的基因的克隆与及表达

分子生物学大实验—目的基因的克隆与及 表达 第一节基因操作概述 (2) 一、聚合酶链式反应(PCR) (2) 二、质粒概述 (4) 三、凝胶电泳 (5) 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6) 五、重组质粒的连接 (7) 六、限制性内切酶消化 (7) 七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7) 第二节材料、设备及试剂 (7) 一、材料 (8) 二、设备 (8) 三、试剂： (9) 第三节操作步骤 (10) 一、目的基因的获得： (10) 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11) 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12) 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定

(13) 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE 电泳。 (14) 六、融合蛋白的毒力测定 (16) 第四节本实验的实验报告 (16)

第一节基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA 扩增达106倍。 （一）、PCR反应中的主要成份 1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中

L_乳酸脱氢酶基因克隆及功能分析

20卷5期2004年9月生 物 工 程 学 报Chinese Jou rnal o f Biotechnology Vol.20 No.5 September 2004 收稿日期:2004_03_08,修回日期:2004_05_31。 *通讯作者。 Tel:86_22_23505967;Fax:86_22_23505967;E_mail:meor@https://www.wendangku.net/doc/60503996.html, L_乳酸脱氢酶基因克隆及功能分析 李 剑 唐 梁凤来 张心平 刘如林 * (南开大学生命科学学院,天津 300071) 摘 要 构建了一株产D,L_乳酸的乳杆菌(Lactobacillus sp.)MD_1的基因文库。利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的Escherichia coli FMJ144作为宿主,通过互补筛选分离克隆到乳酸脱氢酶基因(ldh L )。核酸序列分析表明,该基因以ATG 为起始密码子编码316个氨基酸残基组成的蛋白质,预测的分子量为33 84kD;5 端存在典型的启动子结构,3 端的终止子是不依赖于 因子的转录终止子。ldh L 编码的蛋白质有3个保守区域,其中Gly13~Asp50保守区域是NADH 的结合位点,Asp73~Ile100和Asn123~Arg154保守区是酶的活性部位。该ldhL 和其他乳杆菌的ldhL 基因和编码的氨基酸序列相似性较低,核苷酸序列相似性最高仅为64 1%,氨基酸序列相似性最高仅为68 9%,是新的L_乳酸脱氢酶基因。 关键词 乳杆菌(Lactobacillus sp.)MD_1,L_乳酸脱氢酶基因,互补筛选,功能分析中图分类号 Q93 文献标识码 A 文章编号1000 3061(2004)05 0725 05 乳酸在食品、医药、化工、环保等领域有广泛的用途。L_乳酸的生产及其聚合物作为可降解塑料和医用材料的研究日益深入。D_乳酸的聚合物可以用于药物的缓释技术和可降解环保农药的前体物。因此,高光学纯度的D_乳酸或L_乳酸均具有广阔的应用前景[1] 。 乳酸脱氢酶(LDH )是以NAD H 为辅酶,将丙酮酸经过生化反应生成乳酸,因此LDH 是乳酸菌合成乳酸的关键酶。产D,L_乳酸的乳杆菌中存在L 和D 两种依赖NADH 的LDH,分别催化丙酮酸生成L_乳酸和D_乳酸。作者筛选到一株产DL_乳酸的乳杆菌(Lactobacillus sp.)MD_1,能在48 含200g L 葡萄糖的发酵液中快速生长并生产乳酸,72h 产量可达 140g L 以上。如果使乳杆菌的D_乳酸脱氢酶基因(ldhD )缺失,则只生产高光学纯度的L_乳酸(理论上光学纯度可达到100%),同时可以大幅提高L_乳酸产量。反之,如果使L_乳酸脱氢酶基因(ldhL )缺 失,则生产高光学纯度的D_乳酸。 本文报道了Lactobacillus sp.MD_1菌株的ldhL 序列,同时对ldhL 及编码的蛋白质的一级结构进行了初步分析。 1 材料与方法 1 1 菌株与质粒 本文所用的菌株和质粒见表1。质粒pJDC9、菌株E .coli FMJ144由Jean Delcour 教授惠赠。 表1 菌株和质粒 Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study Strain or plas mi d Characteri stic(s) Source or reference Lactobacillus .s p.MD_1 Wild_type s train this study E .coli FMJ144 ldh pfl ::Cam r t rpR his _29(Am )pro _2ary _427deo B arc ts x IN (rrnD _rrnE )lacY 2 TG1suoE hsd 5thi (lac _proAB ) F (traD 36)ProAB +lac I q lacZ M 15 3Plas mid pJDC9Em r ;l dhZ 4 pLZD3083 Em r ;pJ DC9wi th a 3 11Bam H fragment from s train MD_1 this study Em r ,Ap r and Cm r indicate resistance to erythro myci n,ampicillin,and chl oramphenicol,respectivel y