实验室标准操作规程SOP

实验室标准操作程序

（SOP）

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发布日期: 2007年08月08日实施日期: 2007年08月08日

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00. 目录

01. 出口食品细菌总数的检验方法1.仪器和设备

1．1恒温培养箱：36±1℃

1．2恒温水浴箱：45±1℃

1．3高压灭菌锅

1．4均质器

1. 5冰箱：0-4℃和-15～-20℃

1．6试管:18×150mm

1．7锥形瓶:500ml 250ml

1．8平皿：直径为90mm

1．9灭菌吸管

1．10灭菌均质杯

1．11酒精棉

1．12天平:感量0.1g

2．培养基的制备

2.1 生理盐水:

称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中,分装锥形瓶和试管内,每管吸9ml，121℃高压灭菌。

2.2平板计数琼脂

称平板计数琼脂23.5g加入1000.0ml蒸馏水中，煮沸溶解，分装锥形瓶内，121℃高压灭菌。

3.操作程序

3.1样品稀释

分别注入两个平皿内，

3.2培养

4.计算如下表（备注：25-250个菌落为合适范围，菌落成链状明显的计为一个菌落，不明显的不计数，平皿边缘和琼脂表面成水膜样菌落或生长过量的，即报告为蔓延菌落。）

02.出口食品大肠菌群和大肠杆菌的检验方法1．仪器和设备

1．1恒温培养箱：36±1℃

1．2恒温水浴箱：44.5±1℃

1．3高压灭菌锅

1．4均质器

1．5试管:18×150mm、18×180mm

1．6锥形瓶:500ml 250ml

1．7平皿：直径为90mm

1．8灭菌均质杯

1．9灭菌吸管

1．10酒精棉

1．11天平：感量0.1g

1.12冰箱：0-4℃和-15～-20℃ 1.13显微镜

2．培养基的制备

2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST ）肉汤

称35.6g 溶于1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18×180mm 试管中，每管10ml ，于121℃高压灭菌15min 。 2.2煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB ）

称40g 溶于1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18×180mm 试管中，每管10ml ，121℃高压灭菌15min 。

2.3EC 肉汤

称37g 溶于1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18×180mm 试管中，每管吸8ml ，121℃高压灭菌15min 。 2.4伊红美蓝琼脂（EMB ）

称37.5g 溶于1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于三角烧瓶，121℃高压灭菌15min 。摇匀冷却至45℃倾注平皿。 2.5营养琼脂

称33g 溶于1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，121℃高压灭菌15min 。制成斜面备用。 2.6生理盐水

称氯化钠8.5g 溶于1000.0ml 蒸馏水中，分装锥形瓶和18×150mm 试管内，121℃高压灭菌15min 。 2.7成品生化管

2.7.1色氨酸肉汤 2.7.2 MR-VP 2.7.3 Koser 氏枸橼酸盐琼脂 2.7.4革兰氏染色试剂盒 2.7.5 Kovacs 氏靛基质试剂2.7.6 甲基红指示剂 2.7.7 V-P 试剂甲液和乙液

3.操作步骤

3.1样品的稀释和培养

3.2大肠菌群的测定

3.3大肠杆菌的测定

3.4将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化实验。

3.4.1

3.4.3

3.4.4

3.5结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMV iC试验为＋＋－－或－＋－－，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克样品中大肠杆菌MPN值。

1g样品中最近似值(MPN)表

使用三管法,接种量分别为0.1g,0.01g,0.001g

备注： 1.上表采用3个稀释度（0.1g、0.01g和0.001g）每个稀释度3管。 2.

如检样量改用1g、0.1g和0.01g时，表内数字相应降低10倍；如改位0.01g、0.001g和0.0001g

时，表内数字相应增加10倍，其余类推。

03.出口食品金黄色葡萄球菌的检验方法仪器和设备1．1恒温培养箱：36±1℃

1．2恒温水浴箱：45±1℃

1．3高压灭菌锅

1．4均质器

1．5试管:18×150mm 18×180mm

1．6锥形瓶:500ml 250ml

1．7平皿：直径为90mm

1．8灭菌吸管

1．10酒精棉

1．11天平:感量0.1g

1．12冰箱：0-4℃和-15～-20℃

2．培养基的制备

2.1生理盐水

称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，分装锥形瓶和18×150mm试管内，每管吸9ml,121℃高压灭菌15min。

2.2胰蛋白胨大豆肉汤

称大豆肉汤30g和氯化钠95g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装18×180mm试管内，每管吸10ml,121℃高压灭菌15min。

2.3Baird-parker培养基

称6.3g溶于95ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装锥形瓶内，121℃高压灭菌15min。冷却至50℃，加入1瓶亚碲酸钾卵黄增菌液（冻干粉加5ml无菌生理盐水溶解）混匀。倾注平板备用，待平板凝固后放入冰箱0-4℃。

2.4普通肉汤培养基

称18g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装18×180mm试管，每管吸10ml，121℃高压灭菌15min。

2.5冻干血浆（凝固酶试验）

每支安瓶中加入0.5ml灭菌生理盐水至完全溶解，然后加入0.3ml待检液，于37℃6 h培养，观察判定结果。

3.操作步骤

3.1样品的稀释和培养

备注：金黄色葡萄球菌的单个菌落在Baird-Parker琼脂平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润，直径2～3mm。灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围饶以不透明圈（沉淀），其外常有一清

晰带外，其他外观基本相同，从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。

3.2报告结果

查MPN表，报告金黄色葡萄球菌MPN/g。

04.出口食品沙门氏菌属的检验方法

1．仪器和设备

1．1恒温培养箱：36±1℃

1．2恒温水浴箱：45±1℃

1．3高压灭菌锅

1．4均质器

1. 5冰箱：0-4℃和-15～-20℃

1．6试管:18×150mm 12 mm×100 mm

1．7锥形瓶:500ml 250ml

1．8平皿：直径为90mm

1．10灭菌均质杯

1．11酒精棉

1．12天平:感量0.1g

2．培养基的制备

2．1亚硒酸胱氨酸增菌液（SC）

称取23g于1升蒸馏水中在无菌容器中溶解，定量分装备用。

2．2亚硫酸铋琼脂（BS）

称取49.6g于1升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷却至55℃，摇匀，倾注灭菌平板备用。培养基不需要高压灭菌，平板为橙黄色。

2．3胆硫乳琼脂

称取64.3g于1升蒸馏水中，浸泡15分钟，煮沸至完全溶解，冷却至55℃，倾注灭菌平板备用。培养基不需要高压灭菌，新制备的培养基为玉白色不透明，

2．4三糖铁（TSI）

称取65g于1升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12 mm×100 mm，每管约2～4ml，115℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用，桔红色。

2．5尿素酶琼脂基础（U）

称取2.21g于95ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃15分钟高压灭菌，冷却至55℃灭菌加入40％尿素溶液5ml，混匀，分装灭菌试管12 mm×100 mm，每管2～3ml，制成斜面备用。

实验与判断：大量接种于37℃培养24±2h，强阳性反应为深红色，弱阳性为粉红色，阴性为黄色或不变色。

2．6赖氨酸脱羧酶培养基（LD）

称取1.9g于100ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12mm×100 mm，每管1～1.5ml，，121℃15分钟高压灭菌备用。

试验与判断：大量接种于37℃培养24±2h，阳性反应为紫色，阴性反应为黄色。

2．7吲哚培养基（I）

称取1.6g于100ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12mm×100 mm，每管1～1.5ml，121℃15分钟高压灭菌。

2．7．1试验

接种于37℃培养24±2h，滴加柯凡克试剂0.1ml。

2．7．2判断

阳性反应出现红色环；阴性为黄棕色环。

2．8V-P半固体琼脂（VP）生化管

试验：接种后于37℃培养24±2h，将甲液0.2ml(约6滴)加入试管中，摇匀，再加乙液0.1ml（约3滴），再摇匀。

判断：阳性反应立即或在15min内呈现红色，阴性为铜色。阴性结果在1h后再做一次检查。有些试管在数小时后红色会逐渐消失，此仍作阳性反应。

2．9丙二酸钠生化管（M）

试验与判断：接种大量幼嫩试菌，于37℃培养24±2h，阳性反应为普蓝色；阴性不变色。

2．10卫矛醇半固体（D）

试验与判断：穿刺接种待试菌，于37℃培养24±2h，阳性反应为黄色阴性不变色

3．操作程序

3.1分离培养

沙门氏菌落特征

注：K －产碱；＋－阳性反应；（－）－少见反应；A －产酸；－－阴性反应；＋/－－阳性或阴性反应。

TSI 和U 琼脂筛选

4．生化试验

4．1将符合可疑沙门氏菌属特征的TSI 琼脂培养物，按下表进行生化试验。

4．3生化试管结果符合沙门氏菌属特性按血清学试验进行。

4．4血清学试验

4．4．1检查培养物有无自凝性

在洁净的玻片上加一滴生理盐水，将待试培养物混合于生理盐水滴内，使成为均一性的浑浊悬液，将玻片轻轻摇动30～60s，在黑色背景下观察反应（最好用放大镜观察）。如菌体彼此相凝集成明显或比较显小颗粒状物，即认为有自凝性，反之无自凝性。

4．4．2检查“O”抗原

对无自凝性的培物，按3.4.1的程度进行试验,但以多价“O”血清代替生理盐水,在2min判断结果.如为阳性结果以单价“O”血清进行分群试验.如为阴性结果,必要时,可结合生化试验结果按“Vi”抗原进行试验,再以多价和单价“O”血清进行试验.

4．4．3检查“Vi”抗原

按3.4.1的程序进行,但以“Vi”血清代替生理盐水。

5．报告结果：

5．1报告阳性结果：发现沙门氏菌。

5．2报告阴性结果：未发现沙门氏菌。

06.出口食品霍乱弧菌的检验方法

1．仪器和设备

1．1恒温培养箱：36±1℃

1．2恒温水浴箱：45±1℃

1．3高压灭菌锅

1．4拍打式均质器

1．5菌落计数器

1．6试管:18×150mm 12 mm×100 mm

1．7锥形瓶:500ml 250ml

1．8平皿：直径为90mm

1．10灭菌袋 1．11酒精棉

1．12天平:感量0.1g

1.13冰箱：0-4℃和-15～-20℃ 2．培养基的制备 2．1碱性蛋白胨水

称取15g 干粉于1000.0ml 蒸馏水中，加热溶解，分装，121℃10min 高压灭菌。 2．2硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂（TCBS ）

称取89.1g 溶于1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷至55℃倾注平板备用。

2．3三糖铁（TSI ）

称取65g 于1升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12 mm ×100 mm ，每管约2～4ml ，115℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用，桔红色。 2．4霍乱双糖铁琼脂（KIA ）

称取64.5g 溶于1000.0ml 蒸馏水中，加热溶解，分装。121℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用。 2．5T 1N 1琼脂

称取35g 溶于1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃15分钟高压灭菌。倾注平板备用。 在上项成分中改变氯化钠的含量，去除琼脂可制成T 1N 0 和T 1N 3肉汤。 2．6精氨酸葡萄糖斜面琼脂（AGS ）

称取58g 溶于1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用。

2．7 O/F 实验用培养基（HLGB ）

称取45.5g 溶于1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，每管3ml （有的加矿物油覆盖）121℃15分钟高压灭菌备用。

2．8赖氨酸脱羧酶肉汤生化管 2．9MR-VP 肉汤生化管

3.1样品的分离培养和初步鉴定:

注：霍乱弧菌菌落特征形状大，光滑，黄色，稍平，具有不透明中心和半透明的边缘。

霍乱弧菌初步鉴定试验中的反应

2

3．2确认试验

以接种环取初步鉴定试验符合霍乱弧菌反应的T

1N

3

培养物，分别接种到以下培养基：

Hugh-Leifson葡萄糖肉汤（HLGB），36±1℃培养18~24h。

ONPG胨水，36±1℃培养1h～3h或24h。

赖氨酸脱羧酶肉汤，36±1℃培养24~96h。

阿拉伯糖肉汤，36±1℃培养24h。

O/129试验用培养基，36±1℃培养18~24h。

霍乱弧菌的生化反应表

4．1自分离培养基上挑取可疑菌落与O

1

群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。如可疑菌落在诊断血清中很快（一般在10s）出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集者判为阳性。

5报告结果

霍乱弧菌的检出，可依据以下性状报告：

革兰氏染色阴性，无芽孢或弯曲杆菌；

TSI：斜面产酸/底层产酸，不产气，不产H2S；

Hugh-Leifson 试验：葡萄糖发酵阳性；

氧化酶：阳性；

精氨酸脱羧酶试验：阴性；

赖氨酸脱羧酶试验：阳性；

42℃生长：阳性；

嗜盐性试验：0％Nacl＋(有的非O

1

群霍乱弧菌不生长) 3％Nacl＋

6％Nacl－

蔗糖发酵：阳性；

ONPG试验：阳性；

阿拉伯糖发酵：阴性

O/129抑菌试验：10ug敏感；150ug敏感；

血清学试验：O

1群、O139群、非O

1

群。

最终结果的报告，应在生化试验的基础上报告血清群别、血清型别和生物型别。

口

07.出口食品单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法1．仪器和设备

1．1恒温培养箱：36±1℃

1．2恒温水浴箱：45±1℃

1．3高压灭菌锅

1．4均质器

1. 5冰箱：0-4℃和-15～-20℃

1．6试管:18×150mm 12 mm×100 mm

1．7锥形瓶:500ml 250ml

1．8平皿：直径为90mm

1．10灭菌均质杯 1．11酒精棉

1．12天平:感量0.1g 2．培养基的制备

2．1含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆肉汤（TSB-YE ） 称取3.6g 药品溶入100ml 蒸馏水中，水浴加热30min ，分装试管，121℃高压灭菌15min ，冷却后0～4℃冰箱保存备用。

2.2含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆琼脂（TSA-YE ）

称取4.7g 药品溶入100ml 蒸馏水中，121℃高压灭菌15min ，冷却50℃左右倒平板，待琼脂凝固后，放入0～4℃冰箱保存备用。

2.3 Fraser 肉汤增菌液（FB 1 、FB 2）

FB 1 ：称取12.38g 药品溶入225ml 蒸馏水中，121℃高压灭菌15min ，冷却至50℃左右加入FB 1 添加剂1和添加剂2各1支备用。

FB 2：称取1.1g 药品溶入20ml 蒸馏水中，水浴加热30min ，分装试管，121℃高压灭菌15min ，冷却至50℃左右加入FB 2添加剂1和添加剂2各1支备用。

2.4 PALCAM 琼脂

称取6.61g 药品溶入100ml 蒸馏水中，121℃高压灭菌15min ，冷却至50℃左右加入PALCAM 添加剂1和添加剂2各0.4ml ，倒平板，待琼脂凝固后，放入0～4℃冰箱保存备用。 2.5 OXA 琼脂

称取5.85g 药品溶入100ml 蒸馏水中，121℃高压灭菌15min ，冷却至50℃左右加入吖啶黄素、放线菌酮、多粘菌素E 各1支，倒平板，待琼脂凝固后，放入0～4℃冰箱保存备用。

2.6 7％羊血琼脂 2.7 SIM 动力培养基

称取3.0g 药品溶入100ml 蒸馏水中，水浴加热30min ，分装试管，121℃高压灭菌15min ，制成高层斜面，冷却后0～4℃冰箱保存备用。 2.8硝酸盐培养基 2.9缓冲葡萄糖蛋白胨水 2.10糖发酵培养基 2.11过氧化氢酶试验 3.操作程序

3.1样品的培养和分离

3．2．2

3．2．3

3．2．4

3．2．5

3．2．5．1

3．2．5．2

3．2．5．3

3．2．5．4

3．2．5．5

3．2．5．6

李斯特菌菌种鉴别特征