成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定

昆明医学院学报2011，（6）：29～32

CN53-1049/R Journal of Kunming Medical University

成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定

李玉1），但齐琴2），习杨彦彬2）

（1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，

云南昆明650031）

［摘要］目的观察体外培养成年小鼠海马神经细胞生长情况及其形态学变化．方法获取成年海马组织，制成细胞悬液，接种于培养板，分别于1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，用神经元特异烯醇化酶抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元．结果成年海马神经元接种后1～3d，有较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少量．每隔3d半量换液后，杂质不断减少，但第1周细胞生长缓慢，第7～10d才见细胞生长良好．培养15d后，大部分细胞出现有明显的颗粒等早期退化征象．免疫组化染色证实培养细胞呈现神经元特异烯醇化酶染色阳性染色，免疫阳性产物主要分布于细胞质；证明是神经元．结论体外培养成年海马神经元早期生长缓慢，7～10d才显示良好的生长状态，2周左右细胞则开始退变．提示10d以前的细胞是供体外研究用的理想细胞．

［关键词］大鼠；神经细胞；海马；细胞培养；免疫组化

［中图分类号］Q813.1+1［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2011）06－0029－04

Cult ur e and Ident ificat ion of Hippocampus Neur ons in Adult

Rat s

LI Yu1），DAN Qi－qin1），XIYANG Yan－bin2）

（1）Dept.of Neurosurgery，The1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650032；2）Institute of Neuroscience，Kunming Medical University，Kunming Yunnan650031，China）

［Abstract］Objective To observe the morphology and characteristics of hippocampus neurons in adult rats in vitro．Method The hippocampus tissues from adult rats were collected，then digested into cell suspension by using0.125%trypsin．Cell suspension was planted into wells and observed at day1，3，7，10，13，and15 after incubation．Neurons specific Enolase（NSE）antibody，recognized specifically NSE antigen in cultured cells，was used to identify neurons by SP-two-step staining method．Results During1-3days，the extensive bodies of floating cells and tissue blocks were seen，but a few cells attached to the bottom of well．The growth of attached cells was also extensively slow，specifically within1week，while it began to grow quickly after7days，and maintained till15days．Amazingly，cells exhibited aging character with more particles in cytoplasm after15 days．NSE staining showed that cultured cells were positive staining by neuronal specific enalose antibody．Conclusion Adult hippocampus neurons grow slowly during the first week，but they are better from7day to15，then begin to degenerate after15days in vitro．This suggests that neurons from hippocampus of adult rats cultured in10days could be better for related neurobiological studies.

［Key words］Adult rats；Hippocampus neurons；NSE staining；Culture

［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.

第32卷

昆明医学院学报

30

海马神经细胞培养逐渐广泛应用在神经细胞和发育生物学研究中．建立海马神经细胞培养模型可为研究海马相关老年性疾病提供实验技术支持．而目前的研究中，大多报道的是新生大鼠或者胎鼠海马神经元培养方法[1-3]．成年海马神经元培养因难度较大，报道不多．而在海马相关性疾病中，海马的变化大多发生在成年或者老年[4-6]．因此，用成年海马神经细胞来研究海马衰老相关疾病有更为重要的科学价值．本实验获取成年小鼠海马，制备细胞悬液，接种于培养板，观察成年海马神经细胞体外生长特性，为研究衰老相关疾病提供体外细胞模型．

1实验方法

1.1所需设备及仪器

（1）实验仪器：超净工作台、培养箱、解剖显微镜、倒置显微镜、离心机；（2）实验器械：显微镊、扁平尖镊、大剪刀、小剪刀、血管钳、弯镊.（3）培养用具：培养皿、数根长玻璃吸管、离心管、橡胶吸头、1mL、200μL、20μL枪头、培养板.（4）培养试剂：消毒三蒸水、D-Hanks 液、多聚赖氨酸、层粘连蛋白、小牛血清、马血清、M EM培养基、谷氨酰氨、碳酸氢钠、葡萄糖．（5）实验动物：年龄在1岁左右的小鼠．1.2溶液的制备

（1）多聚赖氨酸-层粘连蛋白的制备：将多聚赖氨酸用无菌三蒸水配成0.01%的溶液，用无菌MS液配成0.01%的层粘连蛋白，然后按50mL 0.01%的多聚赖氨酸加2mL0.01%的层粘连蛋白溶液．将此液包被24孔培养板于每孔加入200μL，置37℃的温箱内4h或室温下过夜后吸出多余液体，再用无菌三蒸水充分漂洗4～5遍，待干备用；（2）阿糖胞苷的制备：称取0.01g的阿糖胞苷加三蒸水至25mL，过滤在-20℃储存（1.4 mM stock），再取 1.4mM stock加MS溶液（v/v=1/3）配制浓度为100μg/mL的溶液，使用时工作浓度为2.5μg/mL，即24孔培养板中，每孔400μL的培养液浓度为100μg/mL的阿糖胞苷10μL．6孔培养板中每孔3mL培养液加75μL；（3）葡萄糖-碳酸氢钠储存液（GB stock）的制备：称取碳酸氢钠26.66g、葡萄糖44.44g加三蒸水至1L．过滤除菌后分装置4℃冰箱储存；（4）培养基储存液（Media stock）的制备：在无菌条件下取已过滤10x MEM100mL，GB stock90 mL，加无菌三蒸水900mL混匀后，分装置4℃冰箱储存，若近期不用则置-20℃储存；（5）D-Hanks液的制备：称取KCL0.40g，KH2PO4 0.06g，NaCL18.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4·7H2O0.09g，酚红0.01g，加三蒸水溶解至1L，过滤除菌后分装置4℃冰箱储存.（6）神经元培养基的制备：量取FBS50mL、HS50mL、0.142%的谷氨酰胺10mL，加培养基储存液（M S）至总量为1L，分装置4℃冰箱储存，若近期不用则置-20℃储存．

1.3海马组织的分离，细胞悬液的制备与接种

成年小鼠采用颈椎脱桕处死后，放入盛有75%酒精的烧杯中浸泡消毒1～2min．剪开头部皮肤向两侧拉开，暴露整个颅骨，用小剪刀打开颅骨，完整取下全脑，置于无菌的D-Hanks液培养皿中．洗净脑表面血液，移入另一盛有D－Hanks液的培养皿中．沿背侧表面正中矢状位，用镊子向外侧小心掀开大脑皮质，即可在正中矢状位见“C”字型海马；用镊子夹住海马，向周边组织分离，即可获得整个海马；解剖显微镜下剥离覆盖在海马表面的其它组织及脉络从，将海马剪成碎组织块，用玻璃管吸入安瓶中，待组织块下沉吸去上层的D-Hanks液，加入培养液吹打40～60次，制成细胞悬液后用网筛过滤．取少量细胞悬液加等量胎盼兰混匀，加在计数板上，在100倍倒置显微镜下计数细胞密度，以2×105个细胞/mL，接种于24孔培养板，置37℃5%CO

2培养箱培养．

1.4形态学观察

分别于培养后1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，描记胞体和突起形态变化．

1.5免疫组织化学染色鉴定

用神经元特异烯醇化酶抗体染色鉴定神经元．取培养细胞按如下程序进行免疫组化染色: 0.05M PBS漂洗5min×3次，3%H2O2室温处理切片30min；5%羊血清（0.3%Triton×100，0.01 M PBS配制）37℃封闭背景30min；用含兔抗神经元特异烯醇化酶多克隆抗体（Santa Cruz，工作浓度1:500）的PBS缓冲液（含0.3%Triton×100，3%羊血清）4℃孵育48h；PBS洗5min×3次；生物素化二抗（1:200，0.05M PBS配）孵

李玉，等．成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定31

第6期育37℃1.5h ；PBS 洗5min ×3次；AB 复合物

（1:100，0.05M PBS 配制

）37℃孵育1.5h ．PBS 洗5min ×3次；0.05M Tris ．HCl 37℃孵育15min ；0.05%DAB （0.05M Tris ．HCl 配制，含0.03%H 2O 2，pH7.5）显色5min ；PBS 终止反应．裱片，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片．在光学显微镜下观察神经元免疫阳性反应情况及其亚细胞定位．

2结果

2.1

细胞形态学

培养1～3d ，可见较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少，圆而透明（见图1A ，B ）．以后每隔3d 半量换液1次．虽杂质不断减少，但

仍有杂质及一些死细胞覆盖在贴壁细胞上空至不易见生长细胞的情况．培养第7天换液后，细胞生长状况明显变好，细胞胞体丰满、胞浆透明、折光良好，部份似单极神经元，多数呈多极神经元形态，胞体一端或两端可见长出长短不一的突起，有的还呈生长锥形态（见图1C ）．培养第10天，细胞继续生长，突起长度有所增长，但不明显．能见到有的细胞突起相互间开始有接触；也能见一些多极神经细胞的突起分叉呈树枝状（见图1D ）．培养第13天时观察，可见许多多极神经元，这些神经细胞的胞体发出几个主干树突，伸向各个方向，并再发出二极和三极分支，细胞突

起形成网络状（见图1E

）．培养第15天，发现大部分神经细胞有退化早期征象，部分细胞胞体内出现明显的颗粒（见图1F ）．

图1成年海马神经元培养

Fig.1Cult ur ed hippocampus neur ons A:1d ；B:3d ；C:7d ；D:10d ；E:13d ；F :15

d.

A

B C

D E

F

2.2

免疫组织化学染色结果

神经元特异烯醇化酶抗体染色鉴定神经元结果显示，神经元胞体呈现棕色阳性染色，说明培养细胞是神经元（见图2）．

3讨论

文献报道，海马结构（Hippocampal formation ）

由海马、齿状回和下托组成，属于古皮质．胚胎时期，海马结构位于大脑半球内侧面，相当于海

马沟下方及脉络裂上方之间的区域．随着大脑颞

叶的发育，上述二裂皆被卷入颞叶的前下方，于是海马结构即相当于从室间孔处延至侧脑室下角顶部之间的一个弓状皮质区[7]．本实验中，依据解剖位置，通过掀开皮质，笔者准确获取海马，从而保证了取材的可靠性．观察发现，海马前端较宽，表面覆有室管膜，膜的深面是一层白质，白质的纤维向后内方聚集，形成纵形的海马伞，向后续于穹窿脚．齿状回是一条狭长的皮质带，除内侧面外皆为海马所包绕．在内侧的游离面上有许多横沟，形如齿列，故此而得名．齿状回的内侧面位于海马沟和海马伞之间，海马伞的游离缘直接延续于其上方的脉络层，软膜和血管就沿膜络裂凸入侧脑室内形成膜络层，覆盖于海马表面．因此，获取海马后要将海马表面的被膜剥出干净，以减少成纤维细胞成分．

按照细胞学特征和纤维联系一般将海马本部分为CA1、CA2、CA3、CA4四个区．CA1与下托（位于海马旁回皮质和海马之间的过度区域，相当于海马旁回的上部）相连，CA4与居海马与齿状回移行部．海马本部按细胞构筑学又分为五个亚层：多形细胞层、锥体细胞层、辐射层、腔隙层和分子层，但其主要细胞是锥体细胞．齿状回是海马的传入门户，主要有颗粒细胞．它接受内嗅区的传入，发出苔藓纤维到CA3区，其轴突又组成了海马的传出纤维与CA1区锥体细胞形成突触；CA1发出的纤维又回到内嗅区，这样就形

成了一个连续的四级神经元还路[8，9]

．可见，海马结构和细胞成分比较复杂，这与本实验观察到海马细胞的多形性一致．笔者观察到的细胞包括单

图2海马神经元特异烯醇化染色（×400）

Fig.2Neur al specific enolase labeled neur ons in

hippocampus （

×400

）极神经元和多极神经元．

值得注意的是，成年海马神经元培养，并不像想象的那样接种后就开始生长．其恰恰在第1周生长很缓慢，不易观察到细胞生长，但经过几次换液后效果明显变好，生长的细胞显示出来．在培养中要注意．此外，鉴于海马神经元在7～14d 生长良好，而15d 后有退变现象，故建议利用海马神经元进行体外研究选择10d 左右较好．

本实验为了解成年小鼠海马神经元体外生长特性提供了重要的实验证据，有一些新发现，研究结果为海马神经元体外培养模型建立和应用提供了重要的实验依据．

［参考文献］

［1］TANAKA H ．Culturing hippocampal neurons ［J ］.Nipp-on Yakurigaku Zasshi ，2002，119（3）：163－166.［2］李劲涛，黄桂琴，王廷华，等．GFP 转基因胚胎小鼠海

马神经元培养方法的建立［J ］．昆明医学院学报，2006，27（6）：23－26.

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养方法［J ］．南昌大学学报（医学版），2010，50（3）：1－3.

［4］DE BUNDEL D ，SCHALLIER A ，LOYENS E ，et al ．Loss

of system xformula does not induce oxidative stress but decreases extracellular glutamate in hippocampus and influences spatial working memory and limbic seizure susceptibility ［J ］．J Neurosci ，2011，31（15）：5792－5803.

［5］WEIS S ，LEUBE D ，ERB M ，et al ．Functional neuroana-tomy of sustained memory encoding performance in healthy aging and in alzheimer's disease ［J ］．Int J Neurosci ，2011，29（5）：115－117.

［6］VANGUIDER H D ，FARLEY J A ，YAN H ，et al ．Hippo-campal dysregulation of synaptic plasticity －associated proteins with age-related cognitive decline ［J ］．Neurobiol Dis ，2011，43（1）：201－212.

［7］陈玉敏．海马的解剖定位研究［J ］．立体定向和功能

性神经外科杂志，1994，7（3）：1－4.

［8］杨慧，田德润，王琨，等．国人海马结构的解剖学研究

［J ］．天津医科大学学报，2001，7（2）：1－6.

［9］唐雷，原林，黄文华，等．“虚拟中国人”（VCH ）数据采

集技术研究［J ］．中国临床解剖学杂志，2002，20（5）：1－3.

（2011－04－10收稿）

第32卷

昆明医学院学报32

小鼠皮下脂肪细胞使用说明

小鼠皮下脂肪细胞 小鼠皮下脂肪细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠皮下脂肪细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠皮下脂肪细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠皮下脂肪细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠皮下脂肪细胞产品简介： 1、产品名称：小鼠皮下脂肪细胞 2、组织来源：小鼠脂肪组织 3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠皮下脂肪细胞简介： 小鼠皮下脂肪细胞来源于小鼠脂肪组织，皮下脂肪细胞主要功能： （1）脂肪细胞能储存能量并参与身体代谢。 （2）脂肪细胞分化是一个发展的过程，它对代谢稳态和营养信号很重要。（3）前脂肪细胞存在于小鼠脂肪组织中，能根据能量的平衡增殖和分化成熟的脂肪细胞。前体细胞的增殖和分化能够增加脂肪组织的体积。 （4）前脂肪细胞与脂肪分化以及许多生理病理过程密切相关，如脂肪代谢、能量平衡、肥胖、糖尿病、高血脂和乳癌，所以小鼠皮下脂肪细胞对这些疾病的研究提供素材。

原代海马神经元细胞培养

原代海马神经元细胞培养 溶液的配制： (1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤， 室温保存。 (2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol?l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4?12H2O，1.7g；KCl， 0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。用0.2μm滤膜过滤，4℃保存。 (3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液 冻存。使用时，用解剖液稀释至0.25%。 (4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。将上述多聚赖氨酸 放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。 (5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04?7H20，0.18g； KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。 (6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。 (7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。 (8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg?ml-1的母液储存。用0.2μm滤膜过滤，-20℃ 储存。使用时，取6μl母液加入2ml培养液中，终浓度为3μg?ml-1。（根据实验情况调整浓度） 大鼠原代海马神经元细胞的培养 (1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解 剖液的培养皿中。 (2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。在分离出全 部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。 (3) 将培养皿中的海马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎 片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。

海马神经干细胞激活疗法简介

海马神经干细胞激活疗法简介世界卫生组织最新的一份统计调查报告显示，全世界86%的患有心理障碍、精神障碍疾病的患者久治不愈，其首要原因就是他们在接受治疗的初期就没能得到迅速精准的诊断，在这种病因不明、病理不合、病灶不准的情况下，该患者所接受的一切个性化诊疗都缺乏了严谨科学的准绳，以至于治疗的方向南辕北辙，治疗的最佳时机不断延误，治疗的成果微乎其微，患者们非但病情得不到有效缓解，而且还要饱经痛苦，高频率的遭受病情的恶化和反复! 国际脑组织权威机构研究发现：人体大脑海马区的功能性休眠、损伤、病患以及萎缩，都能导致各类心理障碍、精神障碍疾病的产生!而不同程度、不同位置的人体大脑海马区的病患，所诱发的疾病种类也各不相同!因此，如果能够成功精确的检测出人体大脑海马区的健康状态，并且有针对性对其进行康复性治疗，那么各种心理障碍、精神障碍类的疾病就毋庸置疑的拥有了彻底痊愈、不再反复的条件!而辽宁省精神卫生防治基地的“海马神经干细胞激活疗法”正是在这样一种需求背景下应运而生。 辽宁省精神卫生防治基地介绍该疗法体系传承自国医精华，结合现代西方医学尖端科技，利用国际先进的诊疗仪器产生电流，通过激活大脑海马区萎缩的神经干细胞产生神经递质受体，并利用中、西药的神经递质受体酶激活神经递质受体，通过药物

平衡患者体内分泌紊乱的神经递质，自神经类疾病的源头疏理，纠正脑细胞的功能元，营养大脑长期处于休眠状态的脑细胞，改善其活性，提高其自身代谢力，最终实现脑细胞的正常兴奋态，使患者的神经干细胞在平衡的神经递质环境中恢复到正常，达到彻底痊愈。 随着我国经济的高速发展和社会压力的加剧，精神疾病状况也愈发严峻。根据最新精神疾病流行病学调查，我国精神疾病总患病率高达15%，世界卫生组织(WHO)保守估计，我国各类精神疾病患者已达一亿人以上，精神病在我国疾病总负担中排名首位，约占中国疾病总负担的20%。在各类精神疾病中，抑郁症患者约有3000万。研究精神疾病、寻找战胜精神疾病的方法是全世界医学界的共同目标。 “海马神经干细胞激活疗法”是从中医学、基因学、病理学、心理学等众多学科角度科学诠释了精神疾病的发病机理以及针 对性的治疗措施，能够有效的从源头上根治精神疾病，是广大心理障碍、精神障碍疾病患者的首选技术，它的疗效值得肯定，它的出现使各种失眠、抑郁、神经衰弱、精神障碍等精神类疾病，真正实现了彻底痊愈、不再反复。

小鼠肾成纤维细胞使用说明

小鼠肾成纤维细胞 小鼠肾成纤维细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠肾成纤维细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠肾成纤维细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠肾成纤维细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠肾成纤维细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞

胎鼠海马神经元培养及其鉴定

［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究 工作. 昆明医学院学报2011，（5）：17～19Journal of Kunming Medical University CN 53-1049/R 胎鼠海马神经元培养及其鉴定 李玉1），王波1），但齐琴2 ） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，云南昆 明650031 ）［摘要］目的建立胎鼠海马神经元体外培养方法，观察细胞生长情况，免疫组织化学染色鉴定神经元特 异性．方法取胎鼠海马，分裂获得细胞悬液，接种于24孔板，经2h 差速帖壁去除成纤维细胞，将细胞液转移并继续培养，以获娶纯度较高的海马神经元．培养第5、11、15天观察细胞和突起生长情况，用NeuN 抗体以免疫组化SP 二步法染色鉴立神经细胞．结果培养头3d ．细胞生长缓慢，5d 时细胞开始生长，可见突起， 11d 时突起连成网状．经Neun 染色培养细胞呈阳性反应，证明是神经元．结论 本方法获取生长良好，纯度 较高的海马神经元． ［关键词］胎鼠；海马神经元；Neun ；培养 ［中图分类号］Q831.1+1［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2011）05－0017－03 I dent ificat ion and Cult ur e of Hippocampus Neur ons in Fet al Rat s LI Yu 1），WANG Bo 1），DAN Qi －qin 2 ） （1）Deat.of Neurosurgery ；2）Institute of Neuroscience ，Kunming Medical University ， Kunming Yunnan 650031，China ） ［Abstract ］Objective To establish the protocol for culturing hippocampus neurons in vitro and explore the neuronal growth character istics ．Methods Tissues from hippocampus of fatal rats were harvested ，then digested into cell suspension by using 0.125%trypsin ．After planted into wells for 2hours ，cell suspension was transferred into next well for continuing incubation ．The cell growth was observed at day 5，11and 15．Neurons specific Enolase （NSE ）antibody ，recognized specifically NSE antigen in cultured cells ，was used to identify neurons by SP-two-step staining method ．Results After incubated for 2hours ，transferred suspensions in wells showed some pure neurons ，which is identified by NSE staining ．However ，they grew slowly during 1～3days ，then grew well from 5th day ，with gradual increasing the neuritis outgrowth ．Conclusion Purified neurons with neurite outgrowth states can be acquired by this method. ［Key words ］Fetal rats ；Hippocampus neurons ；NSE staining ；Culture 海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用（细胞因子）的有效细胞模型，其在神经生物学，发育生物学体外实验研究中已被广泛应用[1-3]．然而，要获得纯度较高， 生长状态较好的海马神经元也不是一件易事．本实验长期从事海马神经细胞生物特性及其应用研究，故需建立该细胞模型．鉴于胚胎来源的细胞 生长状态较成年动物来源者好[4，5] ．本实验建立大

神经元细胞培养

神经元细胞培养 1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks’平衡盐液中。 2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。 3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。 4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3 次。 5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。 6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打成单细胞悬液。 7. 细胞计数，调整细胞密度按（700000个）1.5×105/cm2 种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。 (1)把细胞悬液用(DMEM＋20%FBS)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成2% B27 的neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。（+0.5mmol/L谷氨酰胺） 鉴定 1.形态学的观察，在DIC下可以很清楚的看到神经元特有的形态，轴突树突以及胞体非常 明显。 2.免疫学鉴定：正如楼上几位所说，NF（神经丝）或者tubulin 或者MAP2等都是目前 鉴定神经元的Marker,不论你好似免疫荧光还还是免疫组化，阳性表达即可！ 3.在进一步你可一做mRNA水平的实验，也就是RT-PCR了。这就更能支持2的阳性表达 了。 4.电生理学的鉴定：测定神经元特有的电生理学也是证据之一啊！ 从以上几个方面去做，应该能证明是神经元了！ 错误之处还请赐教！ TUJ1

乳鼠海马神经元细胞元代培养及AD损伤模型制备

-94- Clinical Journal of Chinese Medicine 2011 V ol.(3) No.19 家尤昭玲[3]治疗先兆流产时亦主张补肾健脾宁心，宁心之品多选用苎麻根、莲子心。苎麻根甘咸入心，能布散其光明，而不为郁热，此安胎良药也。莲子心味甘涩，性平，入心、脾、肾经，具有补脾益肾、养心安神的功效，还能收敛浮躁的心火，让人宁静且容易入睡。正如《女科集略》云：“受妊之后，宜令镇静，则血气安和。”又如《竹林寺女科秘要》所云：“胎气宜清不宜热，宜静不宜动。” 先贤所论安胎诸法，悉从其亲身实践总结而来，然如景岳所说：“胎气不安，证本非一，治亦不同。……去其所病，便是安胎之法。”同时又指出：“安胎之方不可执，当随证、随经、因其病而药之，乃为至善。”参考文献： [1]盛爱华,黄爱武.健脾补肾法配合黄体酮治疗先兆流产80例[J].浙江中医杂志,2007,42( 11):644 [2]夏桂成.中医妇科理论与实践[M].北京:人民卫生出版社,2003:308-312 [3]付灵梅,尤昭玲,陈宗光.补肾健脾宁心方治疗脾肾亏虚型先兆流产30 例中国实验方剂学杂志[J].2011,17(2):232~234 作者简介： 冯光荣（1979-），女，河南郑州人，郑州市妇幼保健院副主任中医师，博士，主要研究方向不孕症的治疗。 编号：EA-11071239（修回：2011-10-11） 乳鼠海马神经元细胞元代培养及AD损伤模型制备 Hippocampus neurons primary cultured and the AD cell model established 姜海英杨进刘涛 （南京中医药大学基础医学院，江苏南京，210029） 中图分类号：R574.62文献标识码：A 文章编号：1674-7860（2011）19-0094-02 【摘要】采用乳鼠海马做神经元细胞的原代培养和鉴定，并利用Аβ25-3损伤处理细胞，制备ＡＤ损伤细胞模型，为后继研究中药脑脊液和血清对神经元保护试验的奠定前期基础。 【关键词】乳鼠海马；神经元细胞；AD损伤模型； 【Abstract】Using the hippocampus neurons of the new born mice within 2～3 days to do the primary cell culture and do the appraisal . Using Аβ25-35 (aging treateded , final concentration 5μmol/L) on primary cultured hippocampus neurons to establish the AD cell model in order to study the protection of chinese medicine。 【Keywords】Rat hippocampus; Neurons cell; The AD cell model 通常做海马神经元原带培养，采用胎鼠细胞是最佳来源，但代价比较昂贵，取材比较繁琐困难。大鼠繁殖周期比较短，实验中，我们采取1～2天的乳鼠来培养，这样既保存了母鼠，还可以扩大海马组织来源，同时较胎鼠而言，乳鼠体积较大，可采取断颈处死的方法，取海马、剥离筋膜组织容易操作。 1 实验材料和仪器 Aβ25-35，B27、neurons培养基、胰蛋白酶（Sigama），12%胎牛血清（杭州四季青生物制品有限公司），NSE试剂盒、SW-CJ-2FD型超净工作台、CO2细胞培养箱、倒置相差显微镜。 2 细胞培养和鉴定 2.1 细胞培养 收获乳鼠后，置于75%的酒精中清洗，去除身上的垫料杂质，注意避免乳鼠呛到酒精。用酒精棉球反复擦拭后，至于灭菌的脱脂棉中，于无菌操作台中备用。同时注意保温，避免乳鼠产生过多的应激反应。 酒精棉球反复擦洗，无菌操作台断颈处死乳鼠。揭开脑壳，剥离脑膜，露出完整的脑组织。这对于完整分离海马很关键，海马的形状很容易分辨，取出海马组织，至于冷生理盐水中。全部材料取出后，在生理盐水中，小心用灭菌的吸管和镊子分离海马无关组织。反复沉淀清洗，仔细去除血管、筋膜及非海马结构（取材干净非常关键）。多次沉淀清洗的过程中，可以将渗入的血细胞和其他杂质细胞去除掉。然后置于0.125%的胰酶中消化，用弯头吸管边消化边吹打，吹打动作要轻柔。夏天可以在室外操作，消化时间大约20～30min（冬季至于37℃培养箱内消化25min）。由于脑组织细胞结构疏松，很容易将组织细胞吹散。在此过程中，用吸管将悬浮的筋膜组织去除干净，加入含血清的全培养液终止消化。 200目的尼龙筛，剪成3～5m2见方的正方形，在高温灭菌前，折叠成漏斗状，置于5ml或10ml离心管中。每只试管中可以放置多个。尼龙膜在高温灭菌的过程中，形状被固定，在过滤的过程中，由于组织粘附滤膜，会堵塞网口，导致过滤失败。该方法操作简单，有粘附组织存在时，用单陪冲洗，关键可以随时更换，经济实用。用三层尼龙网过滤时，既可以有效去除细胞和组织团块，避免其对细胞贴壁的影响，同时可以有效地降低污染。 将细胞用尼龙网滤过之后，1000转/min离心10min，用含10%血清的高糖DMEM全陪吹散细胞。计数细胞密度，接种密度在2×106。经验值为5～6只乳鼠可以接种一块6孔板。在细胞接种前，6孔板中置放涂布10%无菌多氨酸的盖玻片，紫外照射。 因为不贴壁的细胞数量较多，因而细胞至于培养箱中后，

小鼠胚胎干细胞培养

以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液

原代小鼠心肌成纤维细胞提取

原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法 1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用； 2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中； 3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）; 4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热 3min，适当振荡；[循环1] 5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2] 6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3] 7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5] 8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]； 9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。

成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定

昆明医学院学报2011，（6）：29～32 CN53-1049/R Journal of Kunming Medical University 成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定 李玉1），但齐琴2），习杨彦彬2） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所， 云南昆明650031） ［摘要］目的观察体外培养成年小鼠海马神经细胞生长情况及其形态学变化．方法获取成年海马组织，制成细胞悬液，接种于培养板，分别于1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，用神经元特异烯醇化酶抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元．结果成年海马神经元接种后1～3d，有较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少量．每隔3d半量换液后，杂质不断减少，但第1周细胞生长缓慢，第7～10d才见细胞生长良好．培养15d后，大部分细胞出现有明显的颗粒等早期退化征象．免疫组化染色证实培养细胞呈现神经元特异烯醇化酶染色阳性染色，免疫阳性产物主要分布于细胞质；证明是神经元．结论体外培养成年海马神经元早期生长缓慢，7～10d才显示良好的生长状态，2周左右细胞则开始退变．提示10d以前的细胞是供体外研究用的理想细胞． ［关键词］大鼠；神经细胞；海马；细胞培养；免疫组化 ［中图分类号］Q813.1+1［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2011）06－0029－04 Cult ur e and Ident ificat ion of Hippocampus Neur ons in Adult Rat s LI Yu1），DAN Qi－qin1），XIYANG Yan－bin2） （1）Dept.of Neurosurgery，The1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650032；2）Institute of Neuroscience，Kunming Medical University，Kunming Yunnan650031，China） ［Abstract］Objective To observe the morphology and characteristics of hippocampus neurons in adult rats in vitro．Method The hippocampus tissues from adult rats were collected，then digested into cell suspension by using0.125%trypsin．Cell suspension was planted into wells and observed at day1，3，7，10，13，and15 after incubation．Neurons specific Enolase（NSE）antibody，recognized specifically NSE antigen in cultured cells，was used to identify neurons by SP-two-step staining method．Results During1-3days，the extensive bodies of floating cells and tissue blocks were seen，but a few cells attached to the bottom of well．The growth of attached cells was also extensively slow，specifically within1week，while it began to grow quickly after7days，and maintained till15days．Amazingly，cells exhibited aging character with more particles in cytoplasm after15 days．NSE staining showed that cultured cells were positive staining by neuronal specific enalose antibody．Conclusion Adult hippocampus neurons grow slowly during the first week，but they are better from7day to15，then begin to degenerate after15days in vitro．This suggests that neurons from hippocampus of adult rats cultured in10days could be better for related neurobiological studies. ［Key words］Adult rats；Hippocampus neurons；NSE staining；Culture ［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.

各类神经元细胞的培养方法

体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能 上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下: 一、鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。 1、材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。 （3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。 （4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。 （5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。 2、结果 鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。 二、新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养 背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数

小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结

小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结 2009-08-19 18:39:07 来源:未知【大中小】评论: 条 摘要：小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛 小鼠胚胎成纤维细胞的富集 1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。 2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。 4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml 胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。 6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。 7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。 8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。 9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。 10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。 11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。 12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。

13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。 注释： 我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。 培养基成分： 88％DMEM 10％FBS 1％NEAA 1% 双抗 对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。 小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代 1、移去MEF培养基 2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。 3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。 4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。 5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。 6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。 7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。 8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。 注释： MEF培养基成分：

老化皮肤成纤维细胞的分析研究进展

老化皮肤成纤维细胞的研究进展 丛敬1，2，指导：吴景东1 <1 辽宁中医药大学，沈阳110032；2 沈阳医学院，沈阳110034 ） 【摘要】延缓皮肤老化，永葆青春是人类从未放弃的梦想。成纤维细胞作为真皮中主要细胞成分，已广泛应用于皮肤老化模型的建立和研究中。较系统的介绍了成纤维细胞的组织学结构与功能，其在细胞和分子水平影响皮肤老化的机制，对深入研究皮肤老化的机制、预防和治疗具有重要意义。 【关键词】成纤维细胞；皮肤老化；机制；中药研究 成纤维细胞是皮肤真皮中最主要的细胞成分，在合成分泌纤维和细胞外基质中扮演着重要的角色，在组织创伤修复中发挥着重要的作用。随着年龄的增长，皮肤老化突显，可以表现为皮肤干燥粗糙，皱纹增多、加深，皮肤松弛，弹性下降等。这些临床表现都与成纤维细胞数量减少，合成功能下降或异常有关。因此，在皮肤老化的研究中，人们越来越关注成纤维细胞的结构和功能的改变及其对皮肤老化产生的影响。 1 成纤维细胞的组织学结构与功能 光镜下观察[1]，成纤维细胞胞体较大，常呈多突起的扁平星状。细胞核较大，扁卵圆形，着色浅，核仁明显。细胞质较丰富，呈弱嗜碱性。胞质内有较多的核糖核酸，碱性磷酸酶的活性很强。电镜下，细胞表面有一些微绒毛和粗短的突起，胞质内富于粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。 成纤维细胞的超微结构表明，细胞合成蛋白质功能旺盛。成纤维细胞既合成和分泌胶原蛋白，弹性蛋白，生成胶原纤维、网状纤维和弹性纤维，也合成和分泌糖胺多糖和糖蛋白等基质成分[1]。在婴儿和青年人皮肤中，Ⅰ型胶原蛋白的含量约占70％，Ⅲ型胶原蛋白占30％。在衰老过程中，成纤维细胞合成Ⅲ型胶原蛋白增加，Ⅰ型胶原蛋白减少。成纤维细胞受损，还可以产生大量异常弹性蛋白，导致皮肤弹性下降，皱纹增多，且难以平复。 2 成纤维细胞致皮肤老化的作用机理 皮肤老化包括自然老化和外源性老化两种形式，其发生、发展的机制十分复杂。成纤维细胞在致皮肤老化的过程中发挥着十分重要的作用。 2.1基因调控异常 紫外线照射可导致成纤维细胞急性DNA 光损伤和突变，形成环丁烷嘧啶二聚体和6- 4 嘧啶- 嘧啶酮光产物，光老化的成纤维细胞对其修复能力下降，表达参与细胞核外切修复的蛋白及其mRNA水平亦下降[2-3]。而光老化成纤维细胞DNA修复能力的下降是由于修复合成相关因子表达下降导致核苷酸切除修复后期功能障碍造成的[4]。 人类线粒体DNA

海马细胞培养与鉴定

3.1海马原代培养操作 准备： 1、取海马：培养皿6个（3对），D-hanks（100ml，提前预冷），75%酒精，眼科镊2把， 小剪刀3把，小镊子4把（三个弯头，一个直头），冰袋3个，中号镊一把。 2、细胞室：小dish，多聚赖氨酸（1个EP），纸抽，细胞剪，胰酶（2个EP），DMEM（10% 胎牛血清+青霉素+链霉素，提前拿出），离心管2个，24孔板1个，细胞筛2个，废液缸1个, D-hanks 3、分装：胰酶：1ml、D-hanks:100ml、青霉素：500ul、链霉素：500ul、胎牛血清：10ml、 DMEM：90ml、B27：40ul、Neurobasal：1.6ml 4、玻璃器皿：移液管，培养皿，24孔板内的玻璃片，泡酸过夜，自来水清洗10遍，一蒸 10遍，三蒸3遍，烤干，高压，再烤干 步骤： 1、培养前30min包被多聚赖氨酸置于培养箱中备用； ↓ 2、75%酒精浸泡鼠，断头取脑（1把中镊，1把中剪） ↓ 3、剥离海马（D-hanks液，冰盒，4把小镊） ↓ 4、去血管、被膜（显微镊2把） ↓（进细胞间） 5、吸去多余D-hanks，剪碎，吸入15ml离心管 ↓ 6、D-hanks：胰酶=1:1，吹打20次 ↓ 7、15-20 min，37℃，期间5min震荡一次 ↓ 8、1:1比例加（DMEM+青链+胎牛血清）终止消化，吹打20次 ↓ 9、配平，1000rpm，5min ↓ 10、弃上清，得沉淀 ↓ 11、加（DMEM+青链+胎牛血清），吹打20次 ↓ 12、100目过筛， ↓ 13、放入15ml离心管，吹打

↓ 14、配平，1000rpm，5min ↓ 15、弃上清，得沉淀，加DMEM，吹打 ↓ 16、200目过筛 ↓ 17、计数（1×106） ↓ 18、500微升/孔（24孔板） ↓ 19、24孔板放入恒温培养箱中，37℃，5%CO2 ↓ 20、第二天换Neurobasal+B27（N:1.6ml，B27:40ul） ↓ 21、隔三天换液 注意事项：1、取海马的操作过程要迅速，提高神经细胞的存活率。 2、从断头处死鼠到胰酶消化前整个过程都要在冰上进行。 3、如果是胎鼠，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出 放到预冷的液体中。 4、一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。 5、吹打动作要轻柔，以免损伤细胞。 6、种板时密度很重要，过密和过稀都会影响细胞生长。 7、种板后需轻摇晃板，切记！不能圈圈摇晃。应左右平行，上下平行摇晃。 3.2 海马细胞的鉴定： 取培养7-9天的细胞 海马神经细胞特异性抗体：神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白质2（MAP2）、生长相关换蛋白43（GAP-43） NSE：神经元特异性烯醇化酶，血清NSE是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶 GAP-43：GAP-43是一种膜相关的鳞蛋白，与神经纤维生长的调节有关，主要分布于海马神经元的轴突 MAP2：MAP2是一种细胞骨架蛋白，定位于海马神经元的胞体和树突。

小鼠成纤维细胞原代培养.docx

实验-小鼠成纤维细胞的原代培养 一.实验目的 1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。 2 ?熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。 3?了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。 二.实验原理 自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物 理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。 如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。 细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传 代培养。 1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化 培养法。 组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶 中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。组织块培养法操作过程简 便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。 消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。该方法主要使用生物化学手段将 较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接 松散、相互分离，细胞失去与间质的连接，活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团的悬液，分散的细胞易与外界进行新陈代谢互动，在短时间内即可贴壁生长成片。胰蛋白酶