核转录因子 资B在高浓度葡萄糖诱导 INS-1 细胞凋亡中的作用
收稿日期:2010-02-18
基金项目:广东省中医药局课题(2009454),广东省科技计划项目(2009B080701020)
作者简介:张巧玲(1982-9),女,在读硕士研究生,E-mail:qiaoling000@https://www.wendangku.net/doc/7412924503.html,
通讯作者:薛耀明,男,教授,博士导师,E-mail:yaomingxue@https://www.wendangku.net/doc/7412924503.html,
核转录因子-κB 在高浓度葡萄糖诱导INS-1细胞凋亡中的作用
张巧玲,薛耀明,朱波,李佳,沙建平,李圣坚(南方医科大学南方医院内分泌科,广东广州510515)
摘要:目的研究核转录因子(NF-κB )在高浓度葡萄糖诱导INS-1细胞凋亡中的作用。方法大鼠胰岛素瘤细胞系(INS-1)细胞以RPMI 1640培养基常规培养。实验分对照组(11.1mmol/l 葡萄糖组)、高糖组(33.3mmol/l 葡萄糖组)、高糖+NF-κB 抑制剂组(33.3mmol/l 葡萄糖+NF-κB 抑制剂(5μmol/l )干预组)3组。以荧光定量RT-PCR 检测IKK βmRNA 水平,Western blot 法检测细胞核内NF-κB 亚基P65蛋白表达量,Annexin V-PI 双染法检测细胞凋亡率。结果与对照组相比较,高糖组IKK βmRNA 水平显著升高(P <0.01),INS-1细胞胞核内P65蛋白表达显著增多(P <0.01),细胞凋亡率显著升高(P <0.05)。与高糖相比较,高糖+NF-κB 抑制剂组IKK βmRNA 水平显著下降(P <0.01),胞核内P65蛋白表达显著减少(P <0.01),INS-1细胞凋亡率显著下降(P <0.05)。结论高浓度葡萄糖诱导INS-1细胞NF-κB 活化,抑制NF-κB 活化可有效抑制高糖诱导的INS-1细胞凋亡。关键词:高浓度葡萄糖;INS-1细胞;NF-kaapaB ;P65中图分类号:R587.1
文献标志码:A
文章编号:1673-4254(2010)10-2307-03
High glucose induces INS -1cell apoptosis by activating nuclear factor -κB
ZHANG Qiao-ling,XUE Yao-ming,ZHU Bo,LI Jia,SHA Jian-ping,LI Sheng-jian
Department of Endocrinology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou510515,China
Abstract:Objective To study of the role of nuclear transcription factor-κB (NF-κB)in high glucose-induced apoptosis in INS-1cells.Methods Rat insulinoma (INS-1)cells cultured in RPMI 1640medium were treated with 11.1mmol/L glucose,33.3mmol/L glucose,or 33.3mmol/L glucose plus 5μmol/L NF-κB inhibitors for 48h.The expression of NF-κB subunit P65protein in the cell nuclei was detected by Western blotting,IKK βmRNA level by quantitative RT-PCR,and cell apoptosis by Annexin V-PI double staining.Results Compared with the control levels,IKK βmRNA levels of the cells significantly increased in response to 33.3mmol/L glucose exposure (P <0.01),which also resulted in significantly increased P65protein expression in the cell nuclei (P <0.01)and cell apoptosis rate (P <0.05).Compared with those in the high glucose group,the expression of IKK βmRNA and P65protein and cell apoptosis rate decreased significantly after treatment with 33.3mmol/L glucose plus 5μmol/L NF-κB inhibitors (P <0.05).Conclusion High glucose induces NF-κB activation in INS-1cells,and inhibition of NF-κB activation may protect INS-1cells from high glucose-induced cell apoptosis.Key words:high glucose;INS-1cells;nuclear factor-κB;P65
近年针对T2DM 发病机制研究表明,高浓度葡萄糖可诱导细胞发生氧化应激及细胞因子IL-1β表达[1-2]。又有研究显示活性氧簇(ROS)、细胞因子IL-1β等可激活核转录因子NF-κΒ[3-4]。因此,核转录NF-κβ在T2DM 发生发展中的作用,在高浓度葡萄糖介导
胰岛β细胞损伤中的作用值得探讨。本研究以胰岛β细胞瘤株INS-1细胞作为研究对象,观察高浓度葡萄糖处理后INS-1细胞核转录因子NF-κB 的活性改变及抑制通路NF-κB 的激活对INS-1细胞凋亡的影响。探讨核转录因子NF-κB 在高浓度葡萄糖诱导胰岛β细胞凋亡中的作用。1材料与方法1.1主要试剂及耗材
胰岛β细胞瘤株INS-1(购于武汉大学细胞库),RPMI 1640基础培养基(含11.1mol/L D-葡萄糖)、RPMI 1640基础培养基(无糖)杭州吉诺生物医药技术有限公司,胎牛血清(奥地利PAA 公司),NF-κB 抑制剂(BAY 11-7082,Calbiochem,San Diego )美国CA 公司,引物设计(日本Takara 广州分公司),Trizol (广州英伟创津公司),两步法逆转录试剂盒(Takara ),realtime PCR 试剂盒(Takara 公司),胞核蛋白与胞浆蛋白抽提试剂盒(南京凯基生物公司),P65蛋白一抗(中杉金桥),羊抗兔二抗(威佳公司),Annexin V-FITC 细胞凋亡试剂盒(南京凯基生物公司)。
1.2细胞培养
细胞培养INS-1培养于含10%FBS 的RPMI 1640培养基(1mmol/L 丙酮酸钠,50μmol/L 2-巯基乙醇,100U/ml 青霉素和100μg/ml 的链霉素),置于37℃,5%CO 2饱和湿度培养箱常规培养。实验时,将处于对数生长期贴壁生长的INS-1细胞用0.25%胰酶消化离心,用RPMI 1640培养液制成单细胞悬
2010;30(10)南方医科大学学报(J South Med Univ)
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图1高浓度葡萄糖对INS-1细胞IKK-茁mRNA 表达
水平的影响
与对照组相比,*P <0.01;与高糖组相比,#P <0.01
43.532.521.510.50
Control
高糖组高糖+NF-κB 抑制剂组
*
#
液,并调整细胞浓度至1×106/ml 。1.3细胞分组及处理
按照培养基中葡萄糖浓度以及所加干预物不同,分为3组:(1)对照组(C 组11.1mmol/L D-葡萄糖RPMI 1640全培养基);(2)高浓度葡萄糖组(HG 组33.3mmol/L D-葡萄糖RPMI 1640全培养基);(3)高浓度葡萄糖+NF-κB 抑制剂干预组(HG+NF-κB 抑制剂组该组NF-κB 抑制剂5μmol/l 预孵育1h 后换用33.3mmol/L 的RPMI 1640全培养基+NF-KB 抑制剂5μmol/l 共同培养)以上各组正式干预前均用无血清培养基培养24h 以保持细胞同步化生长,每组干预48h 。
1.4测定指标及方法
1.4.1荧光定量PCR 检测IKK-beta mRNA 表达将单细胞悬液植于6孔板中,约1×106/孔。饥饿24h 后更换高糖全培养基及分别加入干预剂(HG+NF-KB 抑制剂组换液前预孵育1h )共培养48h 。PBS 冲洗2遍,采取Trizol 一步法提取细胞总RNA 。提取RNA 后利用酶标仪检测浓度,经测定样本A260/280>1.95后采用两步法试剂盒逆转录为cDNA 。合成cDNA 反应条件:逆转录37℃变性15min ,85℃退火5s 。cDNA 配得反应体系后于ABI-7500定量PCR 仪上进行PCR 反应。PCR 反应条件:95℃启动15s ,95℃5s 、60℃30s(40个cycle)。ABI-7500定量PCR 仪利用染料法进行PCR 反应后,分别观察溶解曲线、扩增曲线及基因表达量。以同一管中目的基因产物和管家基因产物进行数据分析,以此反映其mRNA 表达程度有无变化。
RAT IKK-beta(基因库编号NM_053355),上游引物5'-GTCACAGGCACCATTCACAC-3',下游引物5'-TCCAGGATCCCTGTGTCTTC-3'管家基因GAPDH (基因库编号NM_002046),上游引物:5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3',下游引物:5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。
1.4.2免疫印迹(Western blot )检测细胞胞核内P65蛋白表达将单细胞悬液植于60mm 小皿中,约1×108/皿。饥饿24h 后更换高糖全培养基及分别加入干预剂(HG+NF-KB 抑制剂组换液前预孵育1h )共培养48h 。PBS 冲洗2遍,利用胞核蛋白与胞浆蛋白抽提试剂盒提取细胞核蛋白。BCA 法检测细胞蛋白浓度绘制标准曲线并计算出加样量。以恒压70V ,30min ;110V ,150min 条件进行电泳。以350mA 电流转膜70min 条件进行湿转。5%的脱脂奶粉/TBS-T 封闭PVDF 膜2h 。一抗(1∶150)稀释4℃孵育过夜。二抗(1∶5000)孵育2h 。显影1min 、漂洗、定影一min 、冲洗、晾干。
1.4.3Annexin V-PI 双染流式检测细胞凋亡率单细
胞悬液接种于6孔板,约5×105/孔,每孔培养基总量2ml 。饥饿24h 后更换高糖全培养基及分别加入干预剂(HG+NF-KB 抑制剂组换液前预孵育1h )共培养48h 。移除培养液,1×PBS 冲洗2次;消化细胞20~30s 后移至15ml 离心管;800g 离心5min ,1×PBS 管内洗涤2遍;分别加入200μl 的Binding Buffer 吹打均匀,各组再依次加入5μl Annexin V-FITC 、5μl Propidium Iodide (阴性对照组除外),混匀后移至专用流式管中;室温,避光,反应15min 。在488nm 激发波长,525nm 发射波长的条件下,流式细胞仪检测每管细胞的绿光及红光荧光强度(MFI ),以此检测各组细胞早期凋亡率及晚期凋亡率1.5统计学处理
数据采用平均数±标准差表示,采用SPSS13.0统计软件,多组间资料比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)检验。P <0.05为差异有统计学意义。2结果
2.1高浓度葡萄糖对INS-1细胞IKK-βmRNA 表达水平的影响
与对照组(11.1mol/L 葡萄糖)相比,高糖组(33.3mol/L 葡萄糖)IKK-βmRNA 表达水平显著升高(P <0.01)。与高糖组相比较,高糖+NF-κB 抑制剂组IKK-βmRNA 表达水平显著降低(P <0.01,图1)。
2.2高浓度葡萄糖对INS-1细胞胞核内P65蛋白表达的影响
与对照组(11.1mol/L 葡萄糖)相比,高糖组(33.3mol/L 葡萄糖)胞核内P65蛋白表达显著升高(P <0.01)。与高糖组相比较,高糖+NF-κB 抑制剂组胞核内P65蛋白表达显著降低(P <0.01,图2)。
2.3不同干预对INS-1细胞凋亡率的改变
与对照组(11.1mol/L 葡萄糖)相比,高糖组(33.3mol/L 葡萄糖)细胞凋亡率显著升高(P <0.05)。与高糖组相比较,高糖+NF-κB 抑制剂组细胞凋亡率显著降低(P <0.05,图3)。3讨论
南方医科大学学报(J South Med Univ)第30卷
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近年针对T2DM 发病机制的研究表明,葡萄糖毒性、脂毒性是造成胰岛β细胞损伤的主要机制[5-6]。其中葡萄糖毒性介导胰岛β细胞损伤可通过诱导细胞内发生氧化应激及产生细胞因子IL-1β实现[1-2]。有研究显示,无论是活性氧簇(ROS )还是细胞因子IL-1β均可激活核转录因子NF-κΒ[3-4]。而在有关葡萄糖对内皮细胞损伤研究表明,高浓度葡萄糖可直接激活核转录因子NF-κΒ介导细胞损伤[7]。因此,核转录因子NF-κΒ在T2DM 的发生发展中,高浓度葡萄糖介导胰岛β细胞损伤中发挥着怎样的作用尚未完全清楚。
核转录因子(NF)-κΒ是一种重要的二聚体核转录因子,存在于多种细胞,参与调控免疫和炎症细胞增殖等多种生理、病理过程的基因转录,具有重要的生理和病理意义。NF-κΒ由Rel 蛋白同源二聚体和异源二聚体组成,NF-κΒ通常是以和抑制物I κΒs 结合的非活化方式存在于细胞浆中。I κΒs 与NF-κΒ结合后能阻止NF-κΒ进入细胞核与核内特异的DNA 结合。I κΒs 的磷酸化导致与之结合的NF-κΒ亚单位的降解,游离的NF-κΒ亚单位才能易位到细胞核结合到靶基因的同源DNA 结合位点,从而启动靶基因转录发挥各种重要生物学功能。在本研究中,我们着重观察核转录因子NF-κΒ在高浓度葡萄糖诱导INS-1细胞凋亡过程中的作用,我们还利用该通路的特异抑制剂,观察阻断NF-κΒ通路后INS-1细胞在高糖环境中细胞凋亡的改变。
本研究结果显示,与对照组相比,高糖组INS-1细胞中的IKK-βmRNA 表达水平显著升高,胞核内P65蛋白表达显著升高。表明,高糖环境中INS-1细
胞核转录因子NF-κΒ处于激活状态。与高糖组相比较,高糖+NF-κB 抑制剂组IKK-βmRNA 表达水平显著降低,胞核内P65蛋白表达显著降低。提示,NF-κΒ抑制剂有效的阻断了高糖环境下核转录因子NF-κΒ的活化。明确了高糖可诱导核转录因子NF-κΒ激活,我们继续观察该通路在高糖诱导INS-1细胞凋亡中的作用。我们的结果显示,与对照组相比,高糖组细胞凋亡率显著升高。与高糖组相比较,高糖+NF-κΒ抑制剂组细胞凋亡率显著降低。结果表明,抑制核转录因子NF-κB 活化可有效的减少高糖环境中INS-1细胞凋亡。
有研究表明在胰岛β细胞中,活化的核转录因子NF-κB 主要通过上调Fas 介导胰岛β细胞的凋亡。在正常条件下,啮齿类动物和人的胰腺β细胞均可表达FasL ,但Fas 表达很少。当胰岛β细胞受到如氧化应激、细胞因子等刺激时NF-κB 被激活,诱导正常胰岛β细胞表达Fas ,当诱导产生的Fas 与FasL 相结合时,即可通过Fas/FasL 系统介导β细胞凋亡[8]。
总而言之,高糖诱导INS-1细胞核转录因子NF-κB 活化可能是高浓度葡萄糖对胰岛β细胞造成损伤重要介导通路之一。阻断NF-κB 通路的激活可能成为一种新的预防及治疗手段,为保护胰岛β细胞提供新的思路。参考文献院
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(编辑:陈望忠)
图3INS-1细胞凋亡率
与对照组相比,*P <0.01;与高糖组相比,#P <0.01
Control 高糖组高糖+NF-κB 抑制剂组
876543210
*
#
图2高浓度葡萄糖对INS-1细胞P65蛋白表达
水平的影响
与对照组相比,*P <0.01;与高糖组相比,#P <0.01#*
Control 高糖组高糖+NF-κB 抑制剂组
10008006004002000
6500043000
P65β-actin
Control 高糖组高糖+NF-κB 抑制剂组张巧玲,等.核转录因子-κB 在高浓度葡萄糖诱导INS-1细胞凋亡中的作用
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细胞凋亡试验常用的方法
细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法） （一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法： 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率 抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。 （二）荧光法： 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 （三）DNA琼脂糖凝胶电泳法： 1、DNA提取： 用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳： TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。 60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
核转录因子-κB在肺部炎症性疾病中的作用(一)
核转录因子-κB在肺部炎症性疾病中的作用(一) 【关键词】转录因子;炎症;肺部 急性和慢性肺泡、支气管炎症是许多肺部疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、成人呼吸窘迫综合征及特发性肺纤维化的共同病理变化.这些疾病的炎症部位和特点有所不同，但是肺部均有明显的炎症细胞浸润和免疫细胞活化，而活化的细胞可分泌一些在炎症中发挥重要作用的细胞因子、氧化剂和许多炎症介质〔1〕.近年来研究结果表明，气道上皮细胞也是一种免疫效应细胞，能够分泌前炎症因子、氧化剂和细胞因子〔2〕，而炎症的持续存在将对肺造成损害.目前认为有一些因子通过与基因特殊区域结合而提高特定基因的转录，而这些特殊区域多集中在基因启动子的上游.这些因子多为甾体类，可转导到细胞核内，与核酸上的特异性序列结合，提高基因的转录，进而提高mRNA表达和炎症因子的产生，与炎症反应有关的转录因子主要有核转录因子-κB（NF-κB）和激活蛋白1（AP-1）〔3〕，其他还有活化T细胞核因子、糖皮质激素受体、cAMP响应元件结合蛋白、GATA转录因子、E26转录因子和信号转导物与转录激活剂家族转录因子等.在肺部炎症中上述转录因子可与基因启动子的相应结合位点结合〔4〕.掌握转录因子功能和其调节转录的机制将对研究和治疗肺部炎症性疾病产生积极的作用，本文对主要核转录因子之一NF-κB的结构、活性和在肺部炎症性疾病中的作用进行了综述. 1NF-κB的结构 1986年Sen和Baltimoer首先从成熟B淋巴细胞核提取物中检测到可与免疫球蛋白K轻链基因增强子κB序列（GCGACTTTC）特异结合的核蛋白因子，称之为NF-κB〔5〕.NF-κB是多功能核转录因子，由一组结构上相关联的蛋白质家族组成，共同拥有约300bp组成的Rel同源结构区（RHD），其内含有DNA结合区和二聚体化区，主要功能为介导Rel蛋白间的二聚化作用和蛋白与DNA的特异结合，并携带有核定位信号，参与活化的NF-κB由细胞质向细胞核的迅速移动〔6〕.Rel家族成员包括P50（NF-κB1），P52（NF-κB2），P65（RelA），RelB，C-Rel.Rel蛋白之间可形成多种同源或异源二聚体，不同的组合形成功能不同的NF-κB〔6〕.由p50和p65亚基形成的二聚体是NF-κB最常见的活化形式，也是最丰富的二聚体，几乎存在于所有细胞中发挥生理作用，习惯上通常只将p50/p65异原二聚体称为NF-κB. 2NF-κB的活化 细胞处于静息状态时，NF-κB通常与抑制性蛋白IκBs结合，以无活性的形式存在于胞质中〔7〕，二者结合便掩盖了NF-κB的核定位信号.胞内外信号通过使IκBs磷酸化而解离NF-κB/IκBs复合体，游离的Rel转运至细胞核内，与特异的DNA序列结合，调节靶基因的转录〔8〕.IκBs 则由IκBα，β，γ，δ，ε，Bcl-3组成，存在5～7个锚蛋白（Ank）重复基序〔9〕.NF-κB的激活发挥作用的过程主要分为3步:1）NF-κB的诱导剂通过细胞膜激活胞浆中的IKK，使IκBα在32，36位丝氨酸的磷酸化，而磷酸化的IκB迅速被26S的蛋白酶体降解，NF-κB游离于胞浆中;2）胞浆内游离的NF-κB移位至胞核内，与DNA分子靶基因中启动子区域的NF-κB结合位点相结合;3）启动靶基因转录，生成相应的mRNA，这一过程相当迅速，无需蛋白质合成.目前发现多种因素可诱导NF-κB活化:1）前炎性细胞因子，如TNFα，IL-1;2）与细胞分裂、增殖有关的因素，如抗原及植物血凝素、刀豆素A和佛波酯等;3）细菌毒性产物，如脂多糖（LPS）、病毒及RNA等;4）物理化学因子，如紫外线及放线菌等;5）致凋亡因子，如离子射线及化学治疗药物.被活化的NF-κB通过调节靶基因的表达，产生急性期蛋白质、酶类、细胞因子、化学因子、黏附因子及生长因子等来应付环境的变化，受NF-κB调控的基因已超过100种〔10～12〕. 3NF-κB在肺部炎性疾病中的作用 NF-κB是近来发现的重要转录因子，可调控炎性蛋白质的合成，参与炎症反应.NF-κB被激活后可以调节若干个炎症反应、淋巴细胞分化及生长发育等基因的转录过程，调控其蛋白质合
缺氧诱导因子1与肿瘤
国外医学呼吸系址分册２００３年第２３卷第３期 ·１３１· 缺氧诱导因子１与肿瘤 华中科技走学同济医学院附属同济医院呼吸病研究所（武汉４３００３０）张惠兰综述张珍祥徐永健审校 摘要缺氧诱导因子（ＨＩＦ，１）是谰竹缺氧反应基因的一叶￣核转录因子ｔ现认为它在肿瘤·尤其是乏氧肿瘤如肺癌）的发病及疾病的发展过程中起着重要的作用。本文拟就这一方面作一综述。 关键词缺氧诱导吲子；肿瘤 缺氧诱导因子（ＨＩＦ１）首先是在１９９２年作为被缺氧诱导，连接在促红细胞生成素（ＥＰＯ）基因缺氧反应元件（ｈｙｐｏｘｉａｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ，ＨＲＥ）上的一个核因子被发现的。ＨＩＦ１是由ｎ、口两个亚单化形成的二聚体，其中ＨＩＦＩａ受缺氧或低精的调节，它通过与靶基因特定序列ＤＮＡ结合而调控它们的转录。这些基因包括血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）、ＥＰＯ、ＮＯ合酶（ＮＯＳ）等基因。这在肿瘤，尤其是乏氧肿瘤（如肺癌）的发病及疾病的发展中起着重要的作用。因为它们能使肿循更具有侵袭性，容易发生远处转移。 １ＨＩＦ－ｌ的结构特征 ＨＩＦ一１是乏氧诱导转录因子的原始型，存在于大部分人体绀织内。它是由ＨＩＦ一１ｑ和ＨＩＦ－１０（ａｌｙｌｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｌｏｒ，ＡＲＮＴ）各两个业单位组成的杂二聚体蛋白（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｐｒｏｔｅｉｎ）。基因定位于染色体１４ｑ２１一ｑ２４，属于Ｉ）ＨＬＨ（ｂａｓｉｃ—ｈｅｌｉｘｌｏｏｐ—ｈｅｌｉｘ）转录幽于家族”。该家族的主要结构特征是在Ｎ端有一个ｂＨＩ，Ｈ区．负责和ＤＮＡ结合，紧随其后的是‘个保守的ＰＡＳ（Ｐｅｒ、ＡＮＲＴ、Ｓｉｒｅ）区，其职责主要为与另一个亚单位形成二聚体，而【：末端的变化变大，与其转录活性密切相关“ｌ。ＰＡＳ区首先在果蝇属的转录因子Ｐｅｒ和Ｓｉｍ中发现，其特征为内部有Ａ和Ｂ两个重复片段，大小约为５０～６ｃ）个氨基酸。 ＨＩＦ一１Ⅱ是一个新发现的含Ｂ２６个氨摹酸的多肽，而ＨｌＦ—ＩＢ则与ＡＲＮＴ基因编码的含７７４和７８９个氨基酸的产物一致。最近的研究证实，在ＨＩＦ１ｄ位于４０１—６０３区域，有一个氧依赖降解区（ｏｘｙｇｅｎｄｅｐｅｎ（１【Ｉｎｔｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ，（ＪＩ）ｒ））…。当环境氧的浓度超过５％时，通过激活ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ—ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ途径，作州于ＨＩ卜、－１ｄ的ＯＤＤ区．使其迅速降解，半衰期＜５分钟。如果截去ＯＤＤ区，可以使ＦＩＩＦ一１ａ在有氧状态Ｆ保持稳定，并且仍具备与ＡＲＮ３、形成二聚体及与ＤＮＡ结合的能力，此时即使环境不缺氧，它也具有完整的转录活性。亚单 按＋您Ａ 位ＨＩＦ一１Ｄ对氧的依赖性较弱．但在ＨＩＦ１中也必不可少，因为只有在两个亚单位聚台，并且发生适形性变化，再与其要调节下游因子或酶（如ＶＥＧＦ、Ｐ５３和ＥＰ（））的ＨＲＥ结合后，才能发挥调节作用。ＨＲＥ是受Ｈ１Ｆ１调节的因子或酶所共有的且必须具有的一段基困序列，即５０ＴＡＣ（；ＴＧＣＴ一３‘。“。 ２ＨＩＦ－Ｉ的调节 对于Ｈ１Ｆ一１的凋节，最初的研究认为在缺氧状态Ｆ，ＨＩＦ一１ａ和ＡＲＮＴ在ｍＲＮＡ和篮白水平上均被上润。但随后大量的实验证实，在明显缺氧状态下，虽然ＨＩＦ１ａ和ＡＲＮＴ在蛋白水平增加以及与ＤＮＡ结合活性增强，但并未观察到明显的ＨＩＦ一１。和ＡＲＮＴ在ｍＲＡＮ水平的升高。”。实际上，调节细胞内ＨＩＦ－ｌ的机制非常复杂，它与氧依赖的信号传递机制密切相关，Ｈ１Ｆ一１是其中最重要和最后的一个环节。ＨＩＦ一１的两个亚单位中，ＡＲＮＴ与细胞的多种功能有关而不仅限十氧代谢，ＨＩＦ１ａｊｌ！ｌ｜仅与氧代谢有关。目前认为蒯节Ｈ１Ｆ１的可能机制有：①转录水平的ｒ调和蛋白稳定；②蛋白的磷酸化；③氧依赖的ＨＩＦ—ｌａ降解；④配体的结合能力和在细胞内的定位。 Ｈ１Ｆ一１ｎ的转录足由其羧基端的两个转录活性区（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｌｏｎｄｏｍａｉｎ，ＴＡＤ）和它们之间的一个转录抑制区所凋控，这两个转录活性区分别位于５３１—５７６和７８６—８２６。缺氧时ＨＩＦ一１介导的转录活性增加，不仅Ｈ１Ｆ一１ａ的蛋白水平升高，而且Ｈ１Ｆ１“转录激活区域的活陛也增加…。研究表明，ＣＢＰ（ＣＡＭＰｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｉｎｅ）和Ｐ３００是ＨＩＦｌ的辅激活蛋白（ｃｏａｃｔ［ｖａｔｏｒ），通过募集Ｐ３００／ＣＢＰ町加速ＨＩＦ一１ａ的转录。上Ｅ常氧分压时．内生性Ｐ３５ｓｒｊ与Ｐ３００／｛２ＢＰ结合从而导致ＨＩＦ一１ａ不能转录“。缺氧可以上调Ｈ１Ｆｌｎ的转录与表达，但在某些细胞如平滑肌内皮细胞，ＨＩＦ１ｎ的产生可不依赖于缺氧条件．常氧状态下，血管紧张素Ⅱ，凝血酶，和一些激素亦可刺激产生”ｌ。 除乏氧外，彩响ＨＩＦ－１表达的因子还有很多， 万方数据
转录因子活化T细胞核因子抑制剂研究进展
转录因子活化Ｔ细胞核因子抑制剂研究进展 陈妹红宋宁张聪敏 【摘要】活化Ｔ细胞核因子（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄＴｃｅｌｌｓ，ＮＦＡＴ）家族分布广泛，生物学功能多样，通过抑制ＮＦＡＴ治疗疾病是目前的研究热点，对ＮＦＡＴ抑制剂的研究取得了丰硕的成果，有些成果已用于临床治疗，如环孢霉素Ａ和他克莫司，随着对ＮＦＡＴ活化及其发挥功能各个环节的研究日渐深入，使多位点、多环节抑制ＮＦＡＴ活性，提高免疫抑制的特异性，减少不良反应成为可能，为研制新型免疫抑制剂带来希望。 【关键词】活化Ｔ细胞核因子；抑制剂；钙调神经磷酸酶 Ｒｅ钾ａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓ豁ｏｆｎｕｄｅａｒｆａｃｔｏｒｏｆａｃｔｉＶａｔｅｄＴｃｅＩＩｓｉｎｈｉｂｉｔｏ隅ＣＨＥＮＭＰｉ一＾Ｄ，２９。，Ｓ［）ＮＧＮｉ咒ｇ，ＺＨＡＮＧｃｏ行ｇ—ｍｉ玑。眈以ｒ￡优ｅ行≠ｏ厂Ｆ“聍“ｉｏ以，＆ｏｄｉ，ｚｇｎ坶ｆ＆砌位ＺＨＤｓ户ｉ￡ｎＺ，＆Ｄｄ讯量０７１０００，ａｌｉ咒４【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＮｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｓｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄＴｃｅｌｌｓ（ＮＦＡＴ）ｆａｍｉｌｙａｒｅｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔ“ｂｕｔｅｄ，ａｎｄｈａｖｅｄｉｖｅｒｓｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｄｉｓｅａｓｅｔｈｒｏｕｇｈｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＮＦＡＴｉｓａｈｏｔｓｐｏｔｉｎｃｕｒｒｅｎｔｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ．ＴｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆＮＦＡＴｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｈａｓｖｉｅｌｄｅｄｆｒｕｉｔｆｕｌｒｅｓｕｌｔｓ。ａｎｄｓｏｍｅｒｅｓｕｌｔｓｈａｖｅｂｅｅｎｕｓｅｄｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｓｕｃｈａｓｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＡａｎｄｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ．Ａ１０ｎｇｗｉｔｈｔｈｅｇｒａｄｕａｌｉｎ－ｄｅｐｔｈｓｔｕｄｙｏｆＮＦＡＴａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｍｏｒｅａｎｄｍｏｒｅＮＦＡＴｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓａｒｅｆｏｕｎｄｅｄ，ａｎｄｍａｙｈｅｌｐｕｓｔｏｄｅｖｅｌｏｐｎｅｗｔｙｐｅｓｏｆｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔｓ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ＮｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｓｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄＴｃｅｌｌｓ；Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ；Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ 活化Ｔ细胞核因子（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｓｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄＴｃｅｌｌｓ，ＮＦＡＴ）最初被鉴定于Ｔ细胞内， 是一种可迅速诱导的与人ＩＩ。一２启动子末端抗原受 体反应元件相结合的核转录因子【１Ｊ。ＮＦＡＴ家族 蛋白参与多种免疫功能调节，抑制ＮＦＡＴ·活性已成 为免疫抑制剂研究的重要靶点，传统ＮＦＡＴ抑制剂 环孢霉素Ａ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＡ，ＣｓＡ）和他克莫司 （Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ，ＦＫ５０６）已成功用于临床多年，对治疗 器官移植后的排斥反应做出重大贡献，但由于具有 严重的毒副作用，限制了其临床应用。随着对 ＮＦＡＴ活化及其发挥功能各个环节研究的日渐深 入，使多位点多环节抑制ＮＦＡＴ活性，提高其特异 性，减少不良反应成为可能，并为研制新型免疫抑制 剂带来希望，现将ＮＦＡＴ抑制剂的研究进展作一 介绍。 １ＮＦＡＴ简介 基金项目：河北省卫生厅科研基金资助项目（０７０５１） 作者单位；０７１０００保定市第一中心医院功能科（陈妹红）； ０５００００石家庄，河北医科大学第二医院呼吸内科（宋宁、张聪敏）．综述． ＮＦＡＴ家族包括５种不同的蛋白，其中４种分 另０是ＮＦＡＴｌ（ＮＦＡＴｐ，ＮＦＡＴｃ２），ＮＦＡＴ２ （ＮＦＡＴｃ，ＮＦＡＴｃｌ），ＮＦＡＴ３（ＮＦＡＴｃ４），和 ＮＦＡＴ４（ＮＦＡＴｘ，ＮＦＡＴｃ３），它们的合成主要由 钙／钙调神经磷酸酶（ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ，Ｃａ／ＣａＮ） 信号通路调节；另一种为ＮＦＡＴ５（弹性增强结合蛋 白，ｔｏｎｉｃｉｔｙｅｎｈａｎｃｅｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＴｏｎＥＢＰ，又 称ＮＦＡＴｚ或ＮＦＡＴＬｌ），是目前已知的惟一的哺乳 动物对高渗透压反应的转录因子，由高渗透压调 节［２］。目前ＮＦＡＴ抑制剂的研究主要集中于 Ｃａ／ＣａＮ—ＮＦＡＴ信号通路。 ２ＮＦＡＴ活化及转录活性 静息状态下，ＮＦＡＴ以磷酸化的形式存在于细 胞浆中，活化状态下其去磷酸化，核内转位并诱导靶 基因转录。ＮＦＡＴ活化首先需要刺激信号诱导细 胞内自由钙水平增高，细胞内增高的自由钙可激活 ＣａＮ，发挥其磷酸酶活性活化ＮＦＡＴ，一旦ＣａＮ失 活，会引起ＮＦＡＴ复磷酸化，并返回胞浆内［２］。 ２．１ＮＦＡＴ与ＣａＮ的相互作用ＮＦＡＴ与ＣａＮ 的交互作用发生于ＮＦＡＴＮ一末端调节区，这里含有万方数据
细胞凋亡实验步骤及注意事项
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着
核转录因子NFKB通路
哺乳动物的转录因子NF-kB家族由P50（P105的处理产物，两者都被称为NF-kB1）,P52(p100的处理产物,两者都被称为NF-kB2)，REL(也被称为cREL)，REL-A(也被称为P65)和REL-B。这些蛋白质二聚化去形成功能的NF-kB。除了REL-B只能与P50或者P52有效的结合外，存在所有的同源或异源二聚体组合的可能性，并且都具有NF-kB 的活性。每一个NF-kB家族的成员都有一个保守的REL同源区（RHD），它包含三种类型的基序：结合特异性DNA序列的基序；二聚化的基序；和一个核定位的基序，也被称为核定位信号（NLS）。P50型的NF-kB1及P52型的NF-kB2 包含仅仅一个RHD，而REL、REL-A、和REL-B除包含一个RHD外，还包含一个转录活化区。在没有刺激的细胞中，大部分的NF-kB 二聚体通过与细胞质中三个抑制因子（IkBa、IkBβ、IkBε）中的一个结合而以无活性的状态存在。这些抑制因子通过它们的锚蛋白区与NF-kB二聚体结合，掩盖至少一个NLSs。原型抑制因子IkBa，也阻止其结合的二聚体与DNA的结合，并且通过其末端的一个氨基末端输出序列促进二聚体的出核作用。 各种信号通过降解IkBs的方式来活化NF-kB，活化的NF-kB然后进入细胞核内与DNA结合。IkBs首先是在IkBs激酶（IKK）催化下使其的两个保守的丝氨酸残基磷酸化。IKK是由一个调节亚单位，IKK-γ(也被称为NEMO)和两个催化亚单位IKK-a，IKKβ组成。接着IkBs在SCF-E3泛素化酶复合体的催化作用下多泛素化而被蛋白酶降解。活化的NF-kB转位到核内与与其相关的DNA基序结合以诱导靶基因的转录。包括多种之病原的组分例如脂多糖，前炎性细胞因子，如TNF、IL-1及丝裂原等在内的多种信号活化这种途径。依赖Ikk-和IKK-降解IkBs的NF-kB活化途径被称为经典的NF-kB活化途径。其他的不被人所熟知的途径也能从IkBs中活化部分的NF-kB。这些途径包括氨酸磷酸化诱导的IkBs解离途径途径和蛋白激酶-2诱导的IkBs的流动加快的方式。释放后的NF-kB可以通过例如修饰自身的亚单位的方式来影响自身的转录激活效能。活化的NF-kB快速的诱导编码IkBa的基因的转录，因此产生高水平的自身抑制剂。新合成的自由的IkBa进入细胞核内，然后使DNA 上NF-kB解离并且将NF-kB排出细胞核，因而恢复到静息状态。 广泛的IkBs家族也包括P50和P52前体形式的NF-kB1和NF-kB2，分别是P105和P100。除了P50和P52序列外，这些前体还包括IkB样的锚蛋白区，它抑制与其相关的NF-kB亚单位的活性。从前体产生P50和P52的过程还没有被人完全的理解，但他需要翻译时和翻译后的蛋白酶的加工处理活动。在翻译的同时有就会组成性的产生约等量的P50和P105，虽然这时P50还没有加工完成。P52的产生主要但不完全是由于信号诱导的P100的加工完成的。不像是IkBa、IkBβ、Ik Bε的降解，信号诱导的磷酸化及加工P100 成P52不需要经典的IKK-γ依赖的信号途径。IKK-a和NF-kB诱导激酶（NIK）是必不可少的，但IKK-β和IKK-γ是不需要的。因而这个途径又被称为非经典的，替代的或者新的NF-kB活化途径。虽然非经典的途径并不作用于未经处理的P105，但经典的途径可以有时可以像降解IkBs那样被完全的降解，因此释放被结合的NF-kB家族成员。 REL-B很少与小IkBs结合，而P100是其主要的抑制子。非传统的途径加工处理P100产生
缺氧诱导因子-1信号转导通路的研究进展
·８４·困讣压学呼吸系统分册２００３年第２＝｛卷第２期缺氧诱导因子一１信号转导通路的研究进展 南华大学附属第三医院呼吸病研究室（衡阳４２１９００）李炽观综述载爱国审校 摘要缺氧诱导因子１（ＨＩＦ１）是机体细胞在低氧环境中产牛的一种结合ＤＮＡ蛋山质因子．枉低氧信号转导中起刮一个咀曼的中介作Ⅲ．通过转录水平参与对低氧反应基因的调控，从Ｉｆｉｊ使机体刘低氧刺激作出复朵的病 理生理反Ｊ矗。但其洋细的信号转导通路机制还未完全清楚关键词缺氧诱导因子１；信号转导通路；低氧 低氰环境中，机体及细胞对缺氧的反应极其复杂。细胞适应低氧环境足通过对一些特殊基因的凋 甘来文现的，象血管内发细胞生长因子（ＶＥＧＦ）、红 细胞生成素（ＥＰ（））和ＨＩＦ一１。其巾，Ｉ¨Ｆ１足一个 蕈要的中介物质。通过它进而对一系列的低氧反应 基凶（ｂｙｐｏｘ［ａｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｓ．ＨＲＧ）进行转录调节．从而产牛·系列的生理适应，如红细胞生成增多．使携氧能力增强；血管再生和重建；糖酵解能力 增强．使尤氧条什下ＡＴＰ乍成增多，以满足组织细 胞的能星代谢。但低氧环境下，细胞是通过何种信 号转导通路产生Ｈ１Ｆ一１还未完全清楚。本文就其 可能的信号转导通路作一综述。 １缺氧诱导园子－ｌ ＨＩＦ一１是在缺氧诱导的细胞核抽取物中发现的 一种Ｉ）ＮＡ结台挫蜇自质分了，被认为足信号转导 通路中晌一个关键成分。结构分析表明ＨＩＦ１丰 要以异源二聚体形式存在。由分子质量为１２０ｋｕ的 ｄ亚基（１１１Ｆ１ｎ）和由９１／９３／９４ｋｉｉ＿种１３亚基（Ｈ１Ｆ—１０）绀成。在活性的ＨＩＦ一１中。ＨＩＦ１以双亚 基形式和ＩＩｌＦｌ结合位点ＤＮＡ相互作用，进行转 求调控。ＨＩＦ一１“为ＨＩＦｌ所特有，仅在缺氧细胞 孩中存存。常氧环境中，ＨＩＦ—ｌｅｔ的含量甚微，很难 检测到．『『『『存低氧环境中．ＨＩＦ一１ａ却大量集聚并转 移至细胞核中，此过程称作核转位。其可能机制是 常氧ｒＪ“生的ＨＩＦ一１Ｑ被ｖｏｒｌ—ｈｉｐｐｅｌ—ｌｉｎｄａｕ蛋白结 台而被修饰，从而成为Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ蛋白酶降解的靶 ＬＩ标。这种酶解呈氧依赖陛，因此缺氧条件下降解 受阻…。Ｈ１Ｆ一１ｎ既是ＨＩＦ－ｌ的调节亚基，又是活 性亚基，低氧对ＨＩ卜＿１活性的调节主要通过该亚基。ＨＩＦ一１日义称芳香烃受体核转运蛋白（ＡＲＮＴ）”．为哺乳动物芳香烃受体复合物的亚基， 除与ＨＩＦ—ｌ“形成二聚体外，还可与其他ｂａｓｉｃ ｈｅｌｉｘｌｏ（，Ｐｈｅｌｉｘ／ＰＡＳ（ｂＨＩ。Ｈ／ＰＡＳ）蛋白形成二聚体．如芳香烃受体（ＡＨＲｌ。Ｈ１Ｆ１０在正常细胞和 缺氧细胞的细胞核和细胞质中均有表达。据研究 渺｛、 ｙｏｎｈｉｐｐｃｌ—ｌｉｒｌｄａｕ蛋白对Ｉ｛１Ｆ１Ｂ无结合修饰作用“。。ＨＩＦｌ“和ＨＩＦ一１０都属于ｂＨＩ。Ｈ／ＰＡＳ蛋白超家族。结构分析证明，ＨＩ。｝ｉ和ＰＡＳ结构域是形 成ＨＩＦ】异源■聚体所必需的部位．ＨＩＦｌＤＮＡ结合就是由此Ⅸ域介导…。ＨＩＦ—ｌ的干１：用尚不很清楚，可能与ＩｔｌＦｌ的稳定性及二聚化引起的活性构 象改变彳丁关。 ２低氧信号转导通路的调节机制 ２．１转录后或翻译后机制低氧信号对Ｈ１Ｆｌ“的凋节足发生在转录后或翮详后水平。Ｗｅｎｇｅｒ 等“１将人类ｔｔｅｐ６Ｂ细胞暴露于０．５％氧巾发现 ＶＥＧＦｍＲＮＡ水平和ＨＩＦｌＤＮＡ结合活性显若地提高ｒ，但ＨｌＦｌａｍＲＮＡ水平却没有多大变化．说明ＨＩＦＩＤＮＡ的结合不是ＨｌＦ１ｃｃｍＲＮＡ活动的结果。他们再将Ｈｅｌａｓ细胞在低氧和常氧中培养也发现ＨＩＦｌａｍＲＮＡ水平没有变化．充分说明ＨＩＦ一１“没有被转录凋节。这些结果同Ｋｉｍｕｒａ等”。的研究结果相符．ＨＩＦｌａ蛋白在低氧环境中显著升高，这个反应依赖干Ｈ１Ｆ一１“的稳定性而不足ＨＩＦ１ａｍＲＮＡ水平的升高。故认为ＨＩＦ１ｏｔ蛋白集聚是转录后或翻译后机制的结果”］。 ２．２信号转导通路 ２．２．Ｊ低氧感受机制埘哺乳动物机体来说，低氧的感受主要是通过颈动脉体的外周化学感受器和中枢的化学感受器来感受氧分压的下降，通过神经体液反射来增加向流和通气。『ｆ｜ｉ组织细胞的低氧感受就复杂的多．目前有４种研究结果”】。①血红素矗接感受低氧。血红索在氧合的情况下无活忡，而在低氧环境中处于还原状态下具有活性产生低氧信号，如Ｆｉｘ！．，一种血红素蛋白激酶，在还原状态下具有活性，它能磷酸化一种转录因子Ｆ１ｘｊ而使它活化，增强转录功能。②铁／硫簇（Ｆｅ／ＳＣｌｕｓｔｅｒ）感受低氧。在有氧的情况下，通过Ｆｅ／７ｓ的形成而使铁橱节蛋白１降解。而在低氧下，Ｆｅ／ｓ形成受阻而产生低氧信号。③ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ氧化酶产生低氧信号。在 万方数据
肝细胞核因子3β的研究进展
肝细胞核因子３』３的研究进展 罗维贵牛黎明 【摘要】肝细胞核因子３８（ｈｅｐａｔｏｅｙｔｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－３ｐ，ＨＮＦ－３［３）是目前分子生物学研究领域的新亮点，ＨＮＦ－３０参与许多脏器重要功能基因的调控。它不仅在肝细胞的成熟、分化中起重要的调控作用，还参与胚胎的发育过程和胰岛素作用的调节。ＨＮＦ－３１３及其家族成员（如ＨＮＦ－３ａ）与肺呼吸有关，它们是气道上皮细胞分化所必需的成份，可能与肺癌的发生、发展和预后密切相关。本文就ＨＮＦ－３１３对脏器基因的调控作一综述。 【关键词】肝细胞核因子３６，肺癌 Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－３ｐＬＵＯＷｅｉ—ｇｕｉ，ＮＩＵＬｉ—ｍｉｎｇ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅＡ｝ｆｔｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＹｏｕｊｆａｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｆｏｒＮａｔｉｏｎａｌｉｔｙ，Ｂａｉｓｅ５３３０００，Ｃ五ｉｎａ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－３１３（ＨＮＦ－３１９）ｉｓａｎｅｗｂｒｉｇｈｔｓｐｏｔｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄｉｔｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｕｍｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｎｍａｎｙｖｉｓｃｅｒａ．Ｉｔｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｎｏｔｏｎｌｙｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｍａｔｕｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ，ｂｕｔａｌｓｏｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｐｒｏｃｅｓｓｏｆｅｍｂｒｙｏａｎｄｉｎｓｕｌｉｎａｃｔｉｏｎ．ＨＮＦ－３ｐａｎｄｉｔｓｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓ（ＨＮＦ－３ａ）ａｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎａｉｒｗａｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ，ｗｈｉｃｈａｒｅｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔＯｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｇｎｏｓｉｓｏｆｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ．ＴｈｅｐａｐｅｒｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆＨＮＦ－３／３ｏｎｇｅｎｅｓｉｎｍｕｌｔｉｐｌｅｏｒｇａｎｓ．ＩＫｅｙｗｏｒｄｓ］Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｎｕｃｌｅａｒｈｃｔｏｒ－３０，Ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ 肝细胞核因子３８（ｈｅｐａｔｏｅｙｔｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－３＃， ＨＮＦ－３＃）参与许多脏器重要功能基因的调控。 ＨＮＦ－３＃及其家族成员（如ＨＮＦ－３ａ）与肺呼吸有 关，它们是气道上皮细胞分化所必需的成份，可能与 肺癌的发生、发展和预后密切相关。肺癌的发生是 多因素参与的复杂生物学过程。多数学者认为根本 原因在于细胞基因组ＤＮＡ的损伤致细胞癌基因的 激活或过度表达、抑癌基因的丢失或其产物失活，使 细胞无限制性生长，形成恶性肿瘤［１］。人体内多种 因子的表达与肿瘤存在相关性，ＨＮＦ－３１３及其家族 成员（如ＨＮＦ一３ａ），对肺癌的早期诊断与治疗有重 要作用，有望成为肺癌的标志物。目前对ＨＮＦ一３ｐ 的研究仍相当少，主要研究集中在ＨＮＦ一３８与肝脏 疾病及糖尿病领域，其他方面的研究较少，现将其进 展综述如下。 １ＨＮＦ－３ｐ的结构 ＨＮＦ一３８是ＨＮＦ一３家族的３个成员之一， ＨＮＦ－３家族包括ＨＮＦ－３ａ、ＨＮＦ一３６和ＨＮＦ一３７，具 有高度保守的ＤＮＡ结合区即翼旋区，并以单体形 式与靶基因ＤＮＡ序列结合。由于该ＤＮＡ结合区 作者单位：５３３０００百色，右江民族医学院附属医院呼吸内科．综述． 与果蝇叉脑基因相应区域高度同源，因此新的命名 系统［２］将ＨＮＦ一３ａ、ＨＮＦ一３Ｂ和ＨＮＦ－３７的编码基 因称为Ｆｏｘａｌ、Ｆｏｘａ２和Ｆｏｘａ３。ＨＮＦ－３＃基因位于 染色体２０ｐｌｌ，共２２４２ｂｐ。ＨＮＦ－３＃氨基末端和羧 基末端有长约１００个氨基酸的高度保守，参与转录 激活作用。ＨＮＦ一３ｐ以不同的亲和性与相同ＤＮＡ 序列结合，不仅在肝细胞的成熟、分化中起重要的调 控作用，还参与胚胎的发育过程。 ２ＨＮＦ－３ｐ的功能 ＨＮＦ－３＃首先发现于甲状腺转运蛋白基因启动 子区域，此后的研究表明ＨＮＦ一３Ｂ参与许多脏器重 要功能基因的调控。国内有学者发现人体各组织中 ＨＮＦ一３ｐ的表达水平不同，ＨＮＦ一３ｐ在肝、肾、心和 胰腺中呈高水平表达，在脾、肺、甲状腺和肠中呈低 水平表达；此外，ＨＮＦ一３在喉和肌肉中也检测到少 量表达。ＨＮＦ一３口对于节点和脊索轴的形成以及内 胚层的分化是必需的。在小鼠胚胎发育过程中［３］， ＨＮＦ一３家族成员的ＨＮＦ－３＃表达最早。ＨＮＦ一３６ 的表达促发了神经节原肠胚、脊索中胚层、神经上皮 以及内脏内胚层的发育，Ｆｏｘａ２基因敲除小鼠在胚 胎期即由于不能形成正常的神经节、脊索和内脏内 胚层而致死［４］。有研究发现，ＨＮＦ一３／ＦＫＨ在人和 万方数据
细胞凋亡实验技术总结
细胞凋亡实验技术总结 一形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜观察法 未染色细胞:凋亡细胞体积变小、变形，膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩，变圆，脱落。染色细胞:姬姆萨染色，瑞氏染色等。凋亡细胞染色质浓缩，边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状，形成凋亡小体。 2、荧光显微镜检测法-荧光染料 例如，碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。选用536nm 激发光，细胞核呈红色荧光。 3、电子显微镜 收集细胞，2.5%戊二醛4°C 固定24h，1%四氧化锇后固定，丙酮梯度脱水，经包埋剂浸透后环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 4、激光扫描共焦显微镜技术 FITC-AnnexinV+PI双染，观察凋亡过程中细胞膜PS表面的变化，并区分正常细胞(An-PI-)，早期凋亡细胞(An+PI-)，晚期凋亡细胞及坏死细胞(An+PI+)，细胞收集过程中出现的损伤细胞(An-PI+)。 二、细胞凋亡的生化及分子生物学检测 1、DNA 断裂检测法 如使用琼脂糖凝胶电泳检测，细胞凋亡时，核染色质凝聚，染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂。凋亡早期可形成50~300kbp 的DNA 大片段，晚期核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180~200bp 整数倍的寡核苷酸片段。 2、膜联蛋白V 法 磷脂酰丝氨酸(PS)位于正常细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜表面。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD 的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，与PS高亲和力。将Annexin-Ⅴ进行荧光素或生物素标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。 3、细胞凋亡的酶Caspase检测 检测Caspase活力可用免疫杂交技术分析酶原的加工和底物水解的产物，或用人工底物检测酶活力，也可对活化的Caspase做亲和标记。例如分析底物的水解产物，PARP(多聚ADP-核糖聚合酶)第一个被认识的caspase-3底物，它的相对分子质量为116000，水解后形成相对分子质量为85000 及相对分子质量为25000 的两个片段，用抗相对分子质量为85000 片段的抗体检测细胞是否发生凋亡。 4、线粒体膜势能变化的检测 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱反映了线粒体内膜电负性的增高或降低流式细胞仪检测细胞的荧光强度或荧光显微镜观察，拍照正常细胞中, Rh123 能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，荧光强度减弱或消失。而凋亡时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位的崩溃, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光。
核转录因子NF-KB在脑缺血再灌注中的作用机制的研究
核转录因子NF-KB对脑缺血再灌注干预机制的研究进展 于凌志1贾孟辉2,3付慧玲2王佩佩2 左艳丽1刘丽2 李占涛1苏丹1 （1．宁夏医科大学中医学院宁夏银川750004; 2.宁夏医科大学第二附属医院宁夏银川750001；3. 回医药现代化省部共建教育部重点实验室宁夏银川750004） 【摘要】核转录因子NF- KB是存在于脑组织多种细胞内的一种具有多项转录作用的调节因子，在脑缺血再灌注损伤时被激活，进而启动相关靶基因的转录,参与炎症反应、免疫反应、细胞凋亡和自由基损伤等生理病理过程。因此,对NF-KB作用机制的深入研究,对于缺血性脑血管疾病的临床防治具有重要意义。 【关键词】核转录因子NF- KB；脑缺血再灌注；炎症反应；细胞凋亡；自由基损伤 NF-KB(nuclear factor of kappa B)是一种核转录因子[1]。是B淋巴细胞前体细胞中发现的一种核蛋白,是细胞内信号转导的中间枢纽,参与机体的生长发育过程及组织病变的病理过程。作为一种多向性转录调节蛋白,其主要作用是调控编码多种细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞豁附分子、免疫受体、氧化应激相关酶、转录因子、急性时相蛋白等,参与免疫、炎症、细胞凋亡等生理和病理过程中的基因表达调控。近年来，NF-KB对脑缺血再灌注的干预研究方兴未艾、进展顺利。兹综述之，谨供同道参考。 1 NF-KB的结构、特征和生物学特点 1986年,Sen和Baltimore[2]首次报道从成熟B淋巴细胞的核抽提物中,检测到了一种能与免疫球蛋白K轻链基因增强子上一段10bp的核苷酸序列(GGGACTTTCC)特异结合的核蛋白,称为NF-KB。NF -KB属于Rel蛋白家族,有5种亚单位:RelA(p65)、RelB、c-Rel、pl05 /P50(NF-KBl)和P100/p52(NF-KB2)。NF-KB所有的亚单位N端有一段相同的结构域,具备形成二聚体、核转移、结合特定DNA的特性。生理状态下,NF-kB的五个亚单位两两结合,以同源或异源二聚体形式存在,各自发挥不同的生理功能。P50/65 二聚体生物体生理和病理过程中发挥着重要的作用,是所有二聚体中最常见的蛋白质。 NF-KB几乎存在于所有类型细胞中。在神经系统中,NF-KB广泛分布于神经细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。NF-KB受多个水平的调节,主要在其抑制剂IKB蛋白水平接受调节。在静息细胞中,p50/65 二聚体与其抑制剂IKB结合形成三聚体,IKB可以遮盖p50/65 二聚体的核转移位点,使P50/65 二聚体以失活状态存在于胞架中。脑缺血再灌注时各种细胞因子、炎症因子、氧化应激、钙超载及兴奋性氨基酸均可使NF-KB活化。NF-KB是炎症反应的中枢,也是细胞内信号转导途径的中间枢纽,其活化后与DNA特定序列结合，诱导相关基因转录和表达从而激活炎症因子及细胞因子，导致缺血后炎症反应的发生[3]。 2 NF-KB与脑缺血再灌注损伤 2.1 NF-KB与脑缺血再灌注损伤及其参与机制 脑缺血再灌注损伤指缺血脑组织恢复血液再灌注后,脑组织损伤反而较缺血前加重的现象[4]缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程,多种因素与其中,包括炎症反应、兴奋性氨基酸毒性、钙超载、自由基等[5]。NF-KB在脑缺血再灌注损伤中的作用机制主要通过下述几个途径来实现: (1)促进炎症的发生发展。(2)诱导细胞凋亡。(3)介导自由基损伤。以上所述几种机制都不是孤立的发挥作用,它们互为因果,相互促进,加重了脑缺血损伤。但Clemens等———————————————————————————————————————基金项目：国家自然科学基金（81260568）;银川市科技攻关课题（2012017） 作者简介：于凌志（1987-），男，在读硕士研究生。研究方向：中医药、回医药防治心脑血管疾病的理论和临床研究。E-mail:806431921@https://www.wendangku.net/doc/7412924503.html,
细胞凋亡实验报告
实验七、Hela细胞凋亡诱导及检测 一、实验目的 学习细胞凋亡诱导及检测。 二、实验原理 1.细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细 胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一种自然的生理学 过程。与细胞坏死不同，不会引起炎症反应，不释放细胞内容物。 2.DAPI是一种荧光染料，它可以与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与 DNA紧密结合，可在紫外下激发蓝光。 三、实验材料 8.8mol/L的H2O2溶液，甲醇，PBS溶液，10μg/mL的DAPI染液 四、实验步骤 1.细胞传代（上一次实验完成） 2.凋亡诱导 1)取做H.E染色的小皿，加H2O2溶液150μL使终浓度为0.8mol/L 2)24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。 3. 染色 1）收集细胞，观察，贴壁细胞较多，直接用PBS溶液洗 2）吸出洗液，加入500μL甲醇，室温固定10min 3）倒掉甲醇，PBS洗净，加500μLPBS溶液和50μLDAPI母液，于37℃染色10min 4）倒掉染液，用PBS洗净（注意避光），加入500μLPBS溶液，倒置荧光显微镜 下观察并拍照。 五、实验结果与分析 1.观察： 实验开始前镜检： 细胞贴壁较多，细胞有的仍呈不规则状，有的细胞已皱缩，还有一些细胞呈圆形浮在培养基中，核质分界不明显。可以看到有的细胞处于裂解状态。 染色后： 由于DAPI染料只对核进行染色，所以在紫外下只可见核的结构。 视野里最多的是正常细胞，其特点是染色质均一且核表面光滑，说明凋亡是不同步的。 凋亡各时期的细胞也都可见，其主要特点是染色不均一。凋亡前期和中期的细胞较多。很少看到凋亡末期的细胞，除了这个时期细胞较少外，还可能因 为在前期操作中很多凋亡小体被洗掉了。而且有的细胞在正常光下观察是明显 的裂解状态，但是到紫外光路下就变得很不明显了。 另外，可以看到很多分裂期的细胞，其特点为染色深，细胞核染色质浓缩，但是看起来较均一，往往有对称性，特别是分裂末期的细胞两个子细胞会靠在 一起。 2.照片及分析：