RNA干扰载体的构建的实验流程

RNA干扰载体的构建的实验流程

RNA干扰载体主要用来研究基因表达调控，RNA干扰技术已已被广泛用于基因结构功能研究和传染性疾病及基因治疗领域，进行RNA干扰实验首先是构建RNA干扰载体，本文以pRI 系列载体为例论述了干扰载体的构建的实验流程。

产品技术背景

pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA 经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。

pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间内对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。

插入寡核苷酸设计

pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。

合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体XhoI，BglII位点之间，位于载体上H1启动子下游正确的位置上。连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。

1. 选择干扰序列

在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效果。我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列：

推荐长度为19 nt，采用21 nt序列也可以取得良好效果。

RNA干扰序列中不包含大于3 nt的连续相同碱基。

RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平(推荐GC含量在35%到50%之间)。

不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。

确保RNA干扰序列与其它基因没有较高的同源性。

方向：在编码mRNA的正义链上选择RNA干扰序列。

设计RNA干扰序列是RNAi实验的关键。这里提供的设计原则可以为您设计RNA干扰序列提供帮助。但是，值得注意的是，遵循这些原则不能确保设计的RNA干扰序列对目标基因有好的抑制效果。针对一个目标基因，我们建议您至少设计3条干扰序列并且从中筛选出干扰效果好的序列。

2. 寡核苷酸设计。

（1）设计正义寡核苷酸链(5’-3’方向)。

a) 5’TCGACCC

b) 19nt干扰序列正向序列(与目标mRNA一致)。

c) TTCAAGAGA(环状结构)。

d) 19nt干扰序列的反向互补序列。

e) TTTTT。

（2）设计反义寡核苷酸链(5’-3’方向)。

a) 去掉正义链寡核苷酸中5’TCGA

b) 将步骤a)中得到的序列做反向互补。

c) 在步骤b)中得到的序列的5’端加上碱基GATC。

一个设计好的例子见下图：

实验流程

概述：

以下为使用pRI载体的方法概述。

1. 将合成的正义和反义寡核苷酸链退火。

2. 用BglII和XhoI双酶切载体。

3. 将退火的寡核苷酸链与酶切后的线性载体连接。

4. 连接产物转化大肠杆菌。

5. 转染细胞。

6. 观测荧光表达(含有GFP的载体)或筛选稳定表达细胞(含有抗性的载体)。

7. 检测目标基因蛋白或mRNA表达水平

载体构建

对于实验中的很多步骤，您可以使用您实验室中常用的方法，或者您的实验经验证实有效的方法。对于酶切、DNA纯化以及转化等步骤，您可以参照《分子克隆实验指南》进行，也可以参照您购买的试剂盒中生产商提供的使用说明进行。

步骤1：退火寡核苷酸链

根据我们的经验，脱盐纯化的寡核苷酸足以满足连接和克隆需要。但是不同供应商提供的引物纯度差别很大，如果您连接和克隆遇到困难，可以考虑换用PAGE纯化或HPLC纯化的引物，或者使用其他供应商提供的引物。

用水将寡核苷酸稀释为100 μM。按以下体系配制退火反应体系：

正义寡核苷酸(100 μM) 5 μl

反义寡核苷酸(100 μM) 5 μl

NaCl 100 mM

Tris-Cl pH7.4 50 mM

加水补足50 μl

将配制好的退火反应缓冲液重复混合，短暂离心后放置PCR以上，运行以下程序：90 ℃4 min，70 ℃10 min，55 ℃10 min，40 ℃10 min，25 ℃10 min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在-20 ℃长期保存。

步骤2：酶切载体

用XhoI和BglII双酶切2 μg载体。酶切方法和体系参照您购买的内切酶说明书或者按照您的实验室习惯的方法进行。

通常情况下用大约20-30单位的酶在大约3小时可以酶切完全。

酶切后我们建议用琼脂糖凝胶回收线性化载体。将回收后的载体体积稀释为30 μl。

对线性化的载体进行去磷酸化处理是没有必要的。充分酶切后的载体具有不匹配的末端，一般不会发生载体自连。

步骤3：连接载体

用水将退火后寡核苷酸稀释100倍备用。按照以下体系配制连接反应体系：

T4 DNA 连接酶5 U

线性化载体 2 μl

稀释后寡核苷酸2 μl

10×连接酶Buffer 1 μl

加水补足10 μl

接连反应条件和时间参照您购买的连接酶说明书进行。

为了减少空载体自连，连接反应完成后，在连接反应体系中加入1 μl BglII，37 ℃反应30 min，切割连接上的空载体。(选做)

步骤4：转化大肠杆菌感受态

用连接后产物转化大肠杆菌感受态细胞。市场上常见的大肠杆菌感受态细胞(例如Top10，DH5-α)均可以使用，您也可以按照分子克隆中的方法自己制备感受态细胞。转化方法按照供应商的说明书或者您实验室中常用的方法进行。

在氨苄抗性的琼脂平板上37 ℃培养转化后细菌，大约14-16小时后，平板上出现单个细菌菌落。挑取多个菌落至氨苄抗性的培养基中培养后进行鉴定。

鉴定方法可以采用PCR鉴定或酶切鉴定。

PCR鉴定采用引物M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)和M13R-48(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)进行鉴定，空载体扩增产物长度为308 bp，阳性克隆扩增产物为361 bp。

酶切鉴定采用HindIII和EcoRI双酶切。空载体酶切产物长度为235 bp，阳性克隆酶切产物长度为288 bp。

鉴定正确的克隆可以用引物M13R-48测序验证插入的寡核苷酸序列是否正确无误。

步骤5：转染细胞

pRI系列载体可用常用的转染方法进行细胞转染。包括：磷酸钙转染、脂质体转染、电穿孔转染等。您可以购买市售的商品化转染试剂并且参照供应商说明书进行细胞转染实验。

步骤6：观测GFP荧光和稳定表达细胞系筛选

如果细胞转染成功，并且您使用了带GFP的载体，根据细胞生长速度的不同，在转染后3-5天能在荧光显微镜下观察到细胞发出绿色荧光。请注意，绿色荧光蛋白的表达表明转染细胞成功，不能说明RNA干扰实验成功。

如果您使用了带有真核抗性标签如Neo-R的载体，这时您可以加入合适浓度的相应药物如G418进行稳定表达细胞株的筛选。

步骤7：检测RNA干扰效率

您可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。一般情况下蛋白的表达变化与mRNA 水平的表达变化一致，也有少数情况下mRNA表达水平变化不及蛋白表达下降明显。

为检测蛋白表达情况，您可以使用Western-Blot。

为检测mRNA表达情况，您可以使用逆转录+Realtime PCR或Northern-Blot。

具体检测方法请参照分子克隆使用指南或者您实验室的常用实验方法。

疑难问题

遇见RNA干扰效果不理想，可以参考以下问题：

1. 寡核苷酸合成设计错误的核苷酸较多，致使序列与设计不符。建议做转染之前对载体进行验证，可以通过酶切以及测序进行测试。

2. 如果细胞转染效率不高，建议加入GFP进行标记检测。

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 令狐采学 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 （5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与

载体构建流程

载体构建SOP流程: GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒 I.获取目的基因/序列片段 一.获取序列信息 通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。 PCR引物的设计原则： ①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15~30碱基之间。 ④G+C含量在40%~60%之间。 ⑤碱基要随机分布。 ⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧引物5′端可以修饰。 ⑨引物3′端不可修饰。

⑩避免在引物的3’端使用碱基A。 在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。 二.制备模板 1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可

RNA干扰作用原理及其应用

RNA干扰作用原理及其应用 【摘要】 RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反应特征，反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与。RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景。 【关键词】 RNA干扰 siRNA dsRNA RNA诱导的沉默复合体 Argonaute RNA聚合酶III 启动子 【Abstract】 RNA interference(RNAi) in diverse organisms reveals the same highly conserved mechanism with an ancient is the mode of sequence-specific post-transcriptional gene silencing in animals and plants initiated by homologous double-stranded

RNA(dsRNA).The discovery of RNAi and the molecular mechanism will help us apply it to study the gene function and exploit the gene drug. 【Key words】 RNA interference(RNAi) small interfering RNA(siRNA) double-stranded RNA(dsRNA) RNA-induced silencing complex(RISC) Argonaute pol III 1 背景 20 多年前，在对矮牵牛进行的研究中有个发现：Rich Jorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制，Jorgensen将这种现象命名为协同抑制。在真菌中也有类似的现象，1996年就在脉孢菌属(Neurospora)发现这

RNA干扰shRNA原理及设计

RNA干扰/shRNA原理及设计 RNAi概述：RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA 发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默 (post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。 RNAi基本原理示意图：

RNAi类别： 1、siRNA合成：原理：在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。 化学合成的siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA 有效片段的筛选。 2、microRNA干扰载体构建：原理：载体采用Pol II启动子表达人工设计的微小RNA(miRNA),后者从长的转录本被加工，进而导致特异性的mRNA的降解。

载体构建的基本步骤

载体构建 一．原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二．操作步骤 1．摇菌 取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。2．提质粒 依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。 3．酶切 按下表加入试剂。 反应所需试剂体积（单位：ul） 质粒10 所需内切酶反应缓冲液 2 所需限制性内切核酸酶 1 H2O 7 将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度） 4．电泳检测 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。 5．连接 如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接，连接体系如下： 双蒸水5μL 10×T4 DNA连接缓冲液1μL 载体2μL 酶切后的目的基因1μL T4DNA连接酶1μL 总体积10μL 置于温箱，12-16℃，保温8-16h 6．转化 依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。 7．单克隆检测 （1）挑单克隆

先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。 （2）单克隆检测 以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μL，加到3ml（有LB液体培养液，AMP+）试管中，过夜摇；第二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序，并保种。 注：①挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落，有卫星斑的不挑。 ②别忘记往培养基中加AMP。 ③用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑菌。 三．注意事项 1．连接产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实验； 2．在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间； 3．连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一就是温度，因此要控制好连接温度。 4．进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制DNA 片段的自身环化。 参考： 1.刘进元，常智杰，赵广荣,等.分子生物学实验指导[M].北京:清华大学出版社，2002 2.周俊宜.分子生物学基本技能和策略[M].北京：科学出版社，2003：117-120 3.李海英，杨峰山，邵淑丽,等.现代分子生物学与基因工程[M].北京:化学工业出版社，2008:138-142 4.朱旭芬.基因工程实验指导[M].北京：高等教育出版社，2006:134-139

RNA干扰实验

RNA干扰实验 一、磷酸钙转染法 【实验原理】 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。【仪器、材料和试剂】 （一）仪器、用具 CO2培养箱、10cm细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml锥形管、烧杯、量筒等。 （二）材料 呈指数生长的真核细胞BALB/c 3T3 CsCl纯化的表达质粒DNA （三）试剂 1．完全培养液 DMEM 90ml FCS 10ml 2．2M CaCl2，过滤除菌，-20℃保存备用 3．2×HEBS (g/500ml) NaCl 8.0 KCl 0.38

Na2HPO4.7H2O 0.19 HEPES 5.0 葡萄糖1.0 用NaOH调pH至6.95，过滤除菌后，-20℃保存备用。 【方法与步骤】 1．在10cm的培养板上接种1×106个BALB/c 3T3细胞 第二天进行转染 2．准备CaPO4沉淀 2.1 准备两组试管 在A管中加入：15μg质粒DNA 69μl 2M CaCl2 460μl重蒸水 在B管中加入：550μl 2×HEBS 2.2 用巴斯德吸管将A管中的溶液缓慢地逐滴加入在B管中，同时用另一吸管吹打B管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。 2.3室温静置30min，出现细小颗粒沉淀。 3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10cm平板中，轻轻晃动（此过程需尽快完成）。 4. 在5%CO2的加湿培养箱中培养细胞2-6 hr。 5. 除去培养液，加入10ml完全培养液培养细胞1-6天（依具体情况而定）。 6. 收集细胞进行基因活性的检测，或分散接种到其他培养皿中进行选择培养。 【注意事项】 1．在整个转染过程中要保持无菌操作。

RNA干扰(Entranster)

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。它是指小分子双链RNA可以特异性地降解或抑制同源mRNA表达,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。显然，在理论上，通过siRNA几乎可以治疗所有的疾病，包括肿瘤、传染病、遗传性疾病等等，因而RNAi受到学术界普遍的关注，是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。除此之外，RNAi技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。可见，RNAi的应用非常广泛，具有巨大的市场发展空间。但是，由于RNAi现象刚被发现不久，仅仅才14年的时间，无论国外还是国内，目前都缺乏有效的siRNA载体，这大大制约了RNAi的应用，包括实验研究和药物开发。目前市场上主流的siRNA转染试剂是脂质体类的转染试剂，它能将siRNA转染入多种体外培养的细胞株，但原代细胞、悬浮细胞的转染效果不是很好。由于它是脂质体类的转染试剂，因而对培养细胞有一定毒性。而英格恩生物独辟蹊径，转染载体的材料不是用传统的脂质体，而是纳米聚合物材料。这种材料对细胞几乎没有毒性，转染效率在多数细胞株都可达到90%以上，在很多原代细胞中，转染效果也比较好。更为难得的是，该公司的体内RNA转染试剂Entranster-in vivo，和核酸混合后，便可注射进动物体内，完成动物体内RNA干扰实验，十分便捷，是动物体内RNA干扰实验的新创举。

关于RNA干扰的综述

关于RNA 干扰的综述 一、相关概念 基因沉默：通过人工手段使基因的最终产物无法表达。分为转录前水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默（TGS 和PTGS ）。 TGS 是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因沉默，例如转基因植物体内特定基因的甲基化，导致 无法转录。 PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA 存在这一现象。 反义RNA ：反义RNA 是指与mRNA 互补的RNA 分子，也包括与其它RNA 互补的RNA 分子。由于核糖体不能翻 译双链的RNA ，所以反义RNA 与mRNA 特异性的互补结合, 即抑制了该mRNA 的翻译。该技术属于 上述的PTGS 。 二、发现简史 上个世纪末，反义RNA 作为一项基因治疗 的新技术引起不少研究人员的兴趣，然而在一 些实验中发生了一些有趣的现象：向细胞中导 入与目的mRNA 序列相同的正义RNA 和与之 互补的反义RNA 一样，可以产生阻断mRNA 翻译的效果。这与传统的反义RNA 技术相悖。 之后人们发现，将双链RNA （dsRNA ，由 正义RNA 和反义RNA 结合而成）注入，诱发了 比单独注入二者之一都要强得多的基因沉默。之 后也证实纯化的正义RNA 没有诱导作用，而反义 RNA 的诱导作用也很小，而之前正义RNA 引发 基因沉默的实验结果也被证实是由于其中受到了 微量dsRNA 的污染。（如右图T1、T2所示） T1（上）T2（下）

三、原理与应用 概述：细胞由于进化的机理，有一套降解双链RNA的酶系统（抗病毒感染）。RNAi就是利用这一系统，人工引入一段和目标RNA互补的序列，这样，在细胞内形成双链RNA，诱发降解机制。使目标RNA降解，无法被进一步翻译了。 具体过程： 第一步（起始阶段）：是较长ds RNA在ATP参与下被 RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义 链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA 的两条单链末端为5’－磷酸和3’－羟基，且3’端均有２~3 个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ样核酸酶称为Dicer。 第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋 酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合 体(RNA-induced silencing complex，RISC)。在ATP酶的作用 下，活化的RISC以单链siRNA为向导识别同源性的单链靶mRNA，并在距离RISC的3’端11个碱基位置切割靶mRNA，导致靶基因的沉默。（RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。） 此外，siRNA不仅可引导RISC切割靶mRNA，而且可以以siRNA 作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合 成新的dsRNA ，它在Dicer酶的作用下也被裂解，生成大量的次级siRNA。 形成一种链式反应，使特定的基因表达被阻止。这解释了上述实验中表现 出的dsRNA的微量性和高效性。 RNAi 作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但 又不影响正常的等位基因。同时，肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调 控异常的结果，传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转

GenePharma shRNA表达载体使用说明书

GenePharma shRNA 表达载体使用说明 RNA干扰实验设计 在使用载体法针对某一基因进行RNＡ干扰研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因抑制效率的检测。 1、实验对照组的确立 在一个完善的RNA干扰实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。通常，这些对照组包括阴性对照、阳性对照、转染试剂对照。 阴性对照可以有两种，一种是采用通用的阴性对照组，在本试剂盒中包括了该对照所需的载体（shNC），可以表达与目的基因序列无同源性的siRNA片段；另一种是将目的siRNA的序列打乱后重新组合所得的阴性对照（scrambled）。 阳性对照组的设立对于RNA干扰研究是很有必要的，尤其对于第一次接触RNA干扰的用户而言。您可以利用阳性对照来确认RNAi实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法的可靠性。阳性对照通常采用已验证的对某些基因有效抑制的siRNA片段。本试剂盒中包括针对人GAPDH基因的表达载体（shGAPDH），该载体在导入细胞中后，可以有效抑制GAPDH基因的表达。上海吉玛还向用户提供其他的阳性对照以资选择，详细情况请参见本公司的产品目录或《RNAi产品使用手册》。 2、细胞转染条件的确定 使用DNA载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测DNA的导入情况。最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。上海吉玛公司提供的shRNA表达载体有一部分载体中包含绿色荧光蛋白的表达框架，转入细胞后可以表达绿色荧光蛋白，是用荧光显微镜或流式细胞仪可以很容易的确定转染效率；如果您所定购的载体中不含绿色荧光蛋白的表达框架，您可以先使用可以表达绿色荧光蛋白的表达载体来确定转染效率和转染条件，然后使用同样的条件来转染shRNA表达载体。 还用一种方法可以用于确定转染条件，就是采用阳性对照载体来转染细胞（如shGAPDH），检测对照载体对基因的抑制效率，然后采用抑制效率较高时的转染条件来进一步转染shRNA表达载体。 3、基因抑制效率的检测 通常用两大类方法来检测RNA干扰对目的基因表达的抑制效率，一类方法是直接检测目的基因在不同水平如mRNA和蛋白水平的变化，具体的方法如qPCR和Western杂交等；另一类方法是通过检测目的基因的生物学效应和细胞效应来间接的反映目的基因的表达变化，这一类方法很多，不同的基因有不同的检测方法。通常在有效片段筛选过程中多选用qRT-PCR和western杂交等方法直接检测目的基因的变化情况，可以很直观地反映基因的真实情况，不过也有一部分研究人员通过检测细胞效应如细胞增殖速率等指标间接反映基因变化。 RNA干扰实验操作 由于在RNA干扰实验中有多种条件选择如试剂和细胞株等，在本实验操作中以shNC为阴性对照，shGAPDH为阳性对照，RNAi-Mate为转染试剂，Hela细胞为实验细胞株，按照上述条件分步阐述RNA干扰实验的操作过程。如果用户使用不同的细胞株和转染试剂，可根据吉玛公司的《RNAi产品使用手册》进行相应的调整。 1 转染条件的确定 如果您选用可表达绿色荧光蛋白的pGPU6/GFP/Neo或pGPH1/GFP/Neo载体，可以直接用这些载体来确定转染效率；如果选用其他载体，可用其他表达绿色荧光蛋白的载体来确定转染条件，或使用阳性对照载体如shGAPDH来去确定转染条件。 选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很重要。DNA 的用量及其与转染试剂的比例可在推荐范围内适当调整。1、转染前一天，接种0.4-1.0×105细胞/孔至24孔板中，加入500μl含血清培养液，37oC 5% CO2培养至40-70%融合。 2、在50 μl Opti-MEM I培养液或其它无血清培养液中加入0.5-0.8μg DNA，混匀。 3、使用前轻轻混匀RNAi-Mate试剂，切忌离心处理。用30μl无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1-4μg RNAi-Mate试剂（可以分别设立DNA/RNAi-Mate的不同用量组，通常DNA 和RNAi-Mate的用量在1：2-1：5范围内，针对不同的细胞需要不同的用量），轻轻混匀，室温放置5分钟。 4、将稀释好的siRNA和RNAi-Mate试剂混合，定容到100μl；轻柔混匀，室温放置30分钟，以便形成siRNA/RNAi-Mate（或DNA/RNAi-Mate）复合物。 5、将100μl DNA/RNAi-Mate复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板板，使DNA/RNAi-Mate混合物均匀覆盖细胞。 6、细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。 7、如果使用可以表达绿色荧光蛋白的DNA载体来检测细胞的转染效率，细胞转染后24-48 h后，使用荧光显微镜观察计数表达绿色荧光蛋白的细胞，在明场观察计数同一视野中的总细胞数，转染细胞率=荧光蛋白表达细胞数/总细胞数×100%。或使用DAPI等染料染核后，使用流式细胞仪进行计数，然后计算转染效率。 8、也可使用阳性对照的抑制率来标定转染效率。例如使用shGAPDH来抑制细胞内GAPDH基因的表达，如果转染效率较高，shGAPDH对GAPDH基因的mRNA和蛋白水平的抑制率通常分别为50-90%和50-90%。反之，如果shGAPDH对GAPDH基因表现出较高的抑制率，也表明细胞的转染效率较高，可以满足进一步实验需要。 9、如果在转染条件摸索实验中没有找到较高效率的转染方法，请更换转染方法和试剂。如无其他方法选择，可以使用流式细胞仪将转染的细胞分选出来用于后续实验。如果无法分选细胞，可以在计算RNA 干扰抑制效率时去除转染效率的影响，也可以使用抗生素对转染后的细胞进行初筛后再进一步检测抑制效率。 2 细胞的转染1、设定合理的实验组，包括转染试剂对照（mock transfection）、阴性对照(negative control)、阳性对照（positive control）和目的基因实验组。 2、按照前面实验确定的细胞接种量接种。37oC 5% CO2培养至40-70%融合。 3、按照前面实验确定的转染条件转染细胞。如果需要转染不同培养量的细胞，试剂的用量可以根据本公司《RNAi产品使用手册》第9页和第13页所述进行相应的变化。 4、转染后24-48h后，收集细胞进行下一步的检测工作。通常，目的基因在转染后24-48h内就会表现出表达抑制，但有一些蛋白比如稳定性较强、半衰期较长的蛋白在转染后含量降低比较缓慢，所以需要延长检测时间。 3 基因抑制效率的检测1、在本公司的《RNAi产品使用手册》（14页-19页）中较详细地介绍了使用荧光定量PCR技术和Western blot方法检测目的基因表达变化的操作步骤和注意事项，用户可以酌情选用。 2、用户也可选用其他间接的方法（如目的基因的生物学功能或细胞生物学特性的变化）来检测目的基因的抑制情况。鉴于这方面的检测手段多种多样，需要用户自己进行选择，在此不再赘述。

(整理)rna干扰.

RNA干扰（RNAi）实验原理与方法 近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RN A(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为R NA干扰（RNAi）。一、RNAi的分子机制 通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。 在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个A TP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer 的RNA酶。 另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt 长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默. 二、如何进行RNAi试验 (一)siRNA的设计 1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选： https://www.wendangku.net/doc/7b19092548.html,/business/products/order2.htm https://www.wendangku.net/doc/7b19092548.html,/techlib/misc/siRNA_finder.html https://www.wendangku.net/doc/7b19092548.html,/Stu/shilin/rnai.html https://www.wendangku.net/doc/7b19092548.html,/rnadesign/default.aspx?SID=45358710 2.RNAi目标序列的选取原则： (1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3

慢病毒载体包装构建过程

慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。

包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含

两种方法研究不同茎部长度串联shRNA表达载体对EGFP基因的干扰效应

江西农业学报2010，22(10)：118—121A c t a A 鲥cul t urae Ji angxi 两种方法研究不同茎部长度串联s hR N A 表达 载体对E G FP 基因的干扰效应 肖红卫1，刘中华2，刘西梅1，郑新民H ，乔宪凤1，李莉1 (1．湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、湖北省胚胎工程与分子育种重点实验室，湖北武汉430064； 2．西北农林科技大学动物医学学院，陕西杨凌712100) 摘要：目的：旨在观察不同茎部长度串联s hR N A 表达载体对EG FP 基因的干扰作用。方法：采用体外培养的V et o 细胞，选用不同茎部长度串联s hR N A 表达载体+E G FP 表达栽体+脂质体转染的方法。将构建好的干扰载体转染V et o 细胞，然后使用实时荧光定量R T —PC R 对其沉默效应进行定量分析。在小鼠腿部肌肉注射干扰质粒，实时荧光定量R T —PC R 对其沉默效应进行定量分析。结果：转染V ero 细胞时，pG enes i l R 21、pG enes i l R 27和pG enes i l R 29荧光表达量仅为对照质粒pEG FP —C l 的4．3％、3，O ％和6．9％；小鼠腿部肌肉注射干扰质粒时，pG enes i l R 21、pG enes i l R 27和pG enes i l R 29荧光表达量仅为对照质粒pE G FP —C 1的2．5％、1．3％和5．1％。结论：在细胞和个体水平，不同茎部串联干扰载体对目的基因的抑制效应均很明显(达到90％以上)，比单一位，最产生的沉默效应要强许多，不同茎部长度干扰效应彼此间差异不显著。 关键词：s hR N A 表达裁体；V er o 细胞；脂质体；E G FP 表达载体；转染 中图分类号：Q TS6文献标识码：A 文章编号：100l 一8581(2010)10—0118—04 St udy on Si l enc i ng E f f e ct of T andem s hR NA E xpr ess i on —-vect or s E m br ac i ng D i f i er ent St em s on E G FP G ene bv T w o M et hods X I A O H ong —w e i ‘，U U Zho ng —h na2，U U X i —m ei l ，Z H E N G X i n —m i nl ’，Q IA O X i an —f en91，L I L i l (1．I nst i t ut e of A ni m al H us ba ndr y a nd V et er i nar y S c i enc e ，H ube i A cadem y of A gr i eulr ur al Sc i ences ：K e y Lab of 胁m s ／Em br yo En- gi neer i n g a nd M o l ecu l ar B r eedi n g of H ubei P r ovi nce ，W uhan430064，C hi na ；2．C ol l ege of V et er i nar y ，N or t hw est Sci —t e ch U ni ver s i -t y of A gr i cul t u r e a nd For es t r y 。Y ang l i ng 712100。Chi na ) A bs t r a ct ：I n or der t o st udy t he s i l enci ng e ff e ct of dif f erent s hRN A expr essi on —vect or s on E cFP ge ne 。i n vit r o cult i vated V er o ee l h w el D g used ，dif f er ent sh R N A expre ssi on —vec t or s ．E G 即expre ssi on —vec t or s a nd l i posom e w er e m i xed a nd t r ans f ected i nt o V e r o cel l s ．and t hen t he f l uor es cence quan t i t ati ve R T —P C R m e t hod w a s us ed t o det ect t he s i l enci ng eff ect of sh R N A expr e ssi on —vec t or s o n E 卿gene ．The f l uor escence quan t i t ati ve R T —P C R m e t hod W a s al so use d t o detect t he s h R N A ’S e ffe c t of gen e s i l ence aft er t he pl as ．Il l i ds w er e i nj ect ed i n t o t he l e g m u gcl e of rnon ∞．‰r esult s show ed t hat ：(1)The E G FP expr es s i on of pG enesi l R21。pG e ne si l R 27and pG e ne si l R 29W as r es p ect i v el y r egul at ed dow n t o 4．3％。3．0％and 6．9％of t he cont r ol pl asm i d pE G FP —C I aft er be i ng tr ansf ec t ． ed t o V e r o c ei l s ．(2)nl e E G _肿expre ssi on of pG enes i l R21，pG e ne si l R 27and pG enes i l R29W as r es p ect i v el y r e du ced t o 2．5％．1．3％and 5．1％of pE G FP —C I aft er bei ng i nj ect ed i nt o t he l eg m u scl e of m ouge ．T he s e r esul t s i ndi eat ed t ha t t he t a ndem s hRN A had a si g-nif i can t s i l en ci ng e ff e ct t o E G FP ge ne and i nh i bi ted t he gen e expr e ssi on do w n t o 10％．a nd t he dif f erent s h R N A ?ha d no s i g ni f icant di f f erence i n t he s i l en ci ng effec t ． ’ K e y w o r ds ：shR N A expr es s i on vect or ；V er o ce l l s ；L i posom e ；EcFP expr es s i on vect or ；T r ans f eet i on R N A 干扰(R N Ai nt er f erence ，R N A i )是将双链R N A R N A (shR N A )…。前者只能引起短暂的干扰效应，而后(ds R N A )导入细胞引起特异基因m R N A 降解的一种细 胞反应过程。它是转录后基因沉寂(PT G S)的一种¨J 。。 1998年，Fi r e 等旧。发现由正义和反义R N A 退火形成的 ds R N A 引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义 R N A 强10倍以上。目前，在哺乳动物细胞中，主要应用 两种相关的技术来实现R N A i 。一种方法是向哺乳动物细胞直接转染人工合成的长度为19bp 并且3’端具有2个突出碱基的小干扰RN A (s i R N A )，另一种方法是用表达质粒或者病毒载体在哺乳动物细胞中表达小发卡 者可以获得稳定而持久的基因沉默。s hR N A 表达载体虽然可在哺乳动物细胞及个体水平产生稳定而持久的干扰效应垆40，但目前普遍采用的单位点shR N A 干扰载体效果并不理想。已有研究将设计好的多条shR N A 序列克隆到同一载体上不同启动子之后，可以获得比单位点 干扰载体更强的沉默效应。 本试验针对EG FP 基因，设计不同茎部长度(21、27、 29 bp)的shR N A 干扰序列各4条，然后将同一茎部长度 的4条序列克隆到同一表达载体的不同启动子之后，构 St gU 3期：2010—0r 7—06 ． 基金项目：国家自然科学基金项目(30671495)；湖北省国际合作项目(2009B FA 012)；动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室开放课 题(20I O ZD l 03)。作者简介：肖红卫(19r 79一)，男，江苏大丰人，助理研究员，研究向：转基因动物。刘中华(1980一)，男，河南沁阳人，在读博士生，研究 向：动物生物技术。肖红卫、刘中华同为第一作者。+通讯作者：郑新民。

RNA干扰设计

什么是siRNA和RNAi 双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA,这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因静默机制，它通过生物体内siRNA介导识别，特定RNA水解酶参与，并靶向切割同源性靶mRNA。实现RNA干扰现象是真核生物中普遍存在的抵抗病毒等外来入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。目前RNA干扰技术已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，大量的论文被发表，成百上千的专利被授权或递交申请，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具以及新药开发的诱人前景，RNAi也越来越为人们所重视。 RNAi技术发展历程 1998：植物基因中基因沉默现象的发现 2000：哺乳动物细胞中基因沉默的实现 2001：被《科学》评为当年十大科技突破之一 2003：动物体内观察到RNA干扰作用 2004：在恒河猴上的SARS病毒研究取得进展 2004：Acuity Pharmaceutical 第一个RNA干扰药物申请IND 2004：siRNA Therapeutics 第一个RNA干扰药物申请IND 2005：第一个RNA干扰药物进入一期临床，取得良好的效果 2005：化学修饰的siRNA oligo 体内系统给药取得突破 2006：诺贝尔医学奖授予两美国RNAi技术专家 2007：美国卫生研究院（NIH）组建首个RNAi委员会，旨在为NIH 的科学主管给出有关如何尽可能改善他们对RNAi 技术的评估 截止2008年：已有七项核酸干扰药物项目在美国进入临床试验，其中，有一项药物已经推入到第III期临床试验 RNAi 2006诺贝尔医学奖述评 ——年轻的获奖者—— 2006年10月2日，现年47岁的Andrew Z. Fire和45岁的Craig C. Mello由于在RNAi(RNA interference，RNAi)及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而今年诺贝尔医学奖获得者，且获奖日期距其研究发表仅8年时间，获奖速度之快亦令人叹为观止。颁奖委员会评价：“他们发现了控制基因信息流通的基本机制，解释了困惑这一研究者们许久的难题。”“像在清晨突然打开窗帘，然后一切都一目了然了”。 —— RNAi的殊荣—— 2001年，随着人类基因组测序的完成，针对其它多种生物的基因组测序计划也相继开展起来。在未来的一段时间内，科学界将不会出现比人类基因组测序更瞩目的技术。有人将人类基因组测序称为“21世纪科学发展史上的里程碑”、“生物学领域最重要的成就之一”。然而时隔不久，同一年在哺乳动物中发现的RNAI掀起了一场风暴，而且愈演愈烈。《Science》杂志将RNAi称为“2002年的重大突破”(Couzin，2002)。然而，更加令人吃惊和兴奋的是，4年以后的今天，Andrew Fire和Craig Mello就因此获得2006年诺贝尔医学奖。一项全新的技术在提出后短短几年就得到诺贝尔奖的青睐和肯定，此前是绝无仅有的，这也足见RNAi在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。 —— RNAi的机制——