西葫芦果实CpNCED1基因3_端的克隆及其表达分析

中国农业大学学报 2010,15(5):25230Journal of China Agricultur al University

西葫芦果实Cp NCED 1基因3c 端的克隆及其表达分析

吴洁芳 纪凯 冷平* 任杰 赵胜利 孙亮

(中国农业大学农学与生物技术学院,北京100193)

摘 要 采用RT 2P CR 和R ACE 2PCR 的方法从西葫芦果实中克隆了ABA 生物合成关键酶NCED 基因保守片段及其3'端,命名为CpN CE D 1,并通过R eal time R T 2PCR 方法分析了Cp NCED 1基因在果实发育和成熟过程中的表达。结果表明:CpN CED 1基因的DNA 序列及其推导的蛋白质序列与番茄、鳄梨及柑橘果实相同基因的同源性分别为61.90%(LeNCED 1)、62.15%(P a NCED 1)、62.55%(P aN CED 3)、54.67%(CsNCED 1)、56.23%(CsNCED 2)和69.75%、65.74%、66.67%、68.75%、71.76%。果肉中CpN CED1基因表达共出现了3个高峰,分别在花后5d,花后20d 及花后35d,并分别与ABA 积累相对应;果皮中Cp NCED 1表达在花后25d 达到最大值,而瓤和种子中CpNCED1的表达没有显著变化。果皮和种子中ABA 含量与其Cp NCED 1的表达基本一致。西葫芦果实在生长发育过程中乙烯产生量很低,为非跃变型果实;呼吸高峰出现在花后20d 。上述结果说明,西葫芦果实的成熟主要和ABA 调控有关,而乙烯对果实成熟的贡献很小。关键词 西葫芦;Cp NCED 1;ABA;实时定量RT 2P CR

中图分类号 S 64216 文章编号 100724333(2010)0520025206 文献标志码 A

收稿日期:2010201208

基金项目:北京市科委重大项目(D0706002000091)

第一作者:吴洁芳,硕士研究生,E 2mail:wujiefang1023@https://www.wendangku.net/doc/7917821832.html,

通讯作者:冷平,教授,主要从事果实发育与成熟机理研究,E 2mail:pleng@https://www.wendangku.net/doc/7917821832.html,

Clonging and analysis of CpN CED1gene in zucchini

WU Jie 2fang,JI Kai,LEN G Ping *

,REN Jie ,ZHA O She ng 2li,SUN L iang

(College of Agronomy and Biotechnolog y,Chi na Agricul tural U nivers ity,B eiji ng 100193,China)

A bstra ct One cDN As se gments e ncoding N CED s which wa s the critic al s te p in regula tion of a bscis ic a cid (ABA)synthesis in highe r plant(zucchini)using RT 2PCR a nd RACE 2PCR and named it as CpN CE https://www.wendangku.net/doc/7917821832.html,ing Rea l time RT 2PCR,the expression pa tte rn of CpNCED 1wa s dete rmined.The res ults suggest tha t the D NA seque nce of CpN CE D1homology with toma to 、avocado 、c itrus wa s 61.90%(L e N CE D1)、62.15%(Pa N CE D1)、62.55%(Pa N CED 3)、54.67%(CsN CE D1)、56.23%(CsN CED 2),and the homology of protein wa s 69.75%、65.74%、66.67%、68.75%、71.76%.The expres sion of CpN CED 1has thre e peak afte r bloom in pulp,and this consis te nt with the a ccumula tion of ABA .The expression of CpN CE D1has a pea k a t 25da ys afte r bloom(DA B)in pe ep,and the e xpre ssion of CpNCED 1ha s not obvious change in s eeds.ABA content of pe ep and se eds was res ond consis te nt with the e xpre ssion of CpN CED 1.E thyle ne production c apacity was very lower during growth and de velopment of zucchini fruit,and the re spira tion rates was highe r a t 20DA

B .The re sult show the ripening of zucc hini fruit wa s ma inly rela ted with the re gulation of ABA,a nd the role of e thyle ne was not important.

K e y words zucchini;CpNCED 1;ABA;re al time RT 2PCR

果实成熟涉及一系列复杂的生理生化变化,包括果实质地、香气、颜色、风味及果肉硬度[1]。长期以来,跃变型果实的成熟机制,尤其是植物激素乙烯的作用,一直是研究的重点[2]

,乙烯信号途径是目前

植物激素调控途径中研究的最清楚的路径之一,也

是控制果实成熟的关键路径之一。目前,虽然有许多相关的研究报道,但非跃变型果实的成熟机制还不清楚

[3]

。如西葫芦、樱桃及草莓等许多非跃变型

中国农业大学学报2010年第15卷

果实的成熟并不需要乙烯,所以这些果实的成熟过程中一般不会出现乙烯的跃变高峰。说明在非跃变型果实中存在着除乙烯之外的成熟调控机制。

植物激素ABA可能就是非跃变型果实成熟的主要调控因子,因为ABA不仅在调节植物生长、种子休眠及应对胁迫方面发挥着重要作用,而且在果实发育的后期呈现出与乙烯相似的变化[3]。有研究认为,ABA在果实成熟和衰老过程中发挥着比乙烯更重要的作用[426]。现在已经证明,92顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(N CED)是高等植物ABA生物合成的关键酶之一[729]。目前关于N CED基因的研究大多集中在其对干旱胁迫的调控方面[10211],而N CE D基因在果实中的表达只在鳄梨[12]和柑橘[13]以及番茄[3]、桃和葡萄[14]、甜瓜[15]上有初步研究。在鳄梨中克隆到3个NCE D基因(Pa NCE D1、Pa N CE D2、Pa N CE D3),其中Pa NCE D1、Pa N CE D3在果实成熟过程中表达,与果实成熟相关。在柑橘外皮中也克隆到2个N CED基因cDN A(CsN CE D1和CsNCE D2),CsN CED1在果实成熟过程中表达,表现出与果实成熟的相关性。

西葫芦果实由于营养价值高,味道鲜美,越来越受到消费者欢迎。近些年,西葫芦新品种也不断上市,然而,对西葫芦果实的成熟机理及其调控机制的研究仍较少,只知道它是一个非跃变型果实。为了深入研究西葫芦果实的发育与成熟机理,尤其是ABA和乙烯分别在西葫芦成熟过程中的作用及其相互作用机制,本项研究首先从西葫芦果实中克隆了ABA生物合成关键酶基因Cp N CE D1,然后利用Real time RT2PCR方法检测其在西葫芦成熟过程中的表达,旨在分析该基因在西葫芦成熟过程中的作用,为进一步的研究工作奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

试验于2008-2009年在中国农业大学果树系采后生理实验室进行。所用材料为西葫芦(Cucur bit pep o L.),品种为/阿尔及利亚0。种子由中国农业科学院蔬菜花卉研究所王长林博士提供,种植于中国农业大学试验田中。根据西葫芦的生长发育特点,开花后每隔5d采样1次,采样时间为上午9:00)10:00,采后立即带回实验室,用手术刀分离果皮,果肉及瓤和种子,液氮速冻后-80e保存备用。1.2方法

1.2.1果实不同发育时期呼吸速率,乙烯和ABA

的测定

各试验指标均以鲜重测定。

呼吸速率:采用便携式红外线气体分析仪GXH23010F测定,以nL/(h#g)表示;

乙烯产量:用美国Agilent6890N气相色谱仪测定,以nL/(h#g);

ABA用酶联免疫(ELISA)试剂盒测定:测定方法按试剂盒(中国农业大学作物化学控制实验室提供)说明书进行。

1.2.2总RNA的提取

总RNA的提取采用热硼酸法[16]。用热硼酸法提取西葫芦不同时期,不同组织的总RNA。

1.2.3NCED基因的克隆及其序列分析

采用PrimeScriptTM RT reagent kit(TaKaRa,日本)将提取的花后20d果实总RNA按说明书反转录为cDNA。根据GenBank已发表的相关同源基因的氨基酸保守序列和核苷酸序列设计简并引物, N CED(forward5c2T TYGAYGGNGAYGGNA2 T GGTN CA23c;rever se5c2T CCCANGCRT TCCA2 NARRT GRA A23c),actin(forward5c2AACGGG2 AAAT TGT CCGTGAC23c;rever se5c2GAAACA2 T CA TCCTCAGTGGT23c)。以第1链cDNA为模板,利用RT2PCR技术扩增N CED,actin基因片断。根据克隆得到的N CED中间片断设计特异性引物,利用RA CE2PCR技术,按照invitr ogen公司的3c RACE System for Rapid Amplification of cDNA ends试剂盒说明书,对N CED基因3c末端序列进行扩增。引物序列为:outer,5c2 CCACAA TGATA GCCCACCCAAAACT23c;inner, 5c2AAT GATGCACAATT TCGCCA TAACA23c。PCR反应程序:94e预变性3min;94e变性30 s,60e退火30s,72e延伸1min,扩增32个循环;72e延伸10min。目的片断回收按天根生化科技(北京)公司琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行。回收产物连接到pMD182T载体(TaKaRa)上,转化大肠杆菌DH5A后筛选阳性克隆送上海英骏公司测序鉴定。序列测定后在NCBI进行序列比对,核苷酸聚类分析由DNAMAN软件完成。

1.2.4CpN CED1表达的Real Time RT2PCR分析

提取不同时期西葫芦果肉,果皮及瓤和种子总RN A,采用PrimeScriptTM RT r eagent kit

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第5期吴洁芳等:西葫芦果实CpNCED1基因3c 端的克隆及其表达分析

(TaKaRa,日本)反转录成单链cDNA,用Corbett Research 公司Rotor 2Gene 3000Two 2filter Real 2time Cycler 对N CED 基因进行实时荧光定量

PCR 。用actin 作为内参以校正上样量。所用引物见表1。Real Time PCR 采用SYBR Premix Ex Ta q TM kit (T aKaRa,日本)。反应体系包括:1L L

primer mix (包括5mol/L of each forward and reverse primer ),2L L cDNA,12.5L L SYBR Premix Ex T a q TM (2@)mix 和9.5L L 水。反应条件为:95e /30s (1cycle);95e /15s,60e /20s;72e /15s (40cycles)。N CED 基因的相对表达量通过Rotor 2Gene 6.1.81软件进行计算。

表1 CpNCED 1基因表达实时定量P CR 引物

Table 1 Oligonucleotide pr imers for the Real 2T ime RT 2P CR analysis of Cp NCED 1

引物名称基因登录号引物序列

注释

CpNCED1F GU380290

5c 2aatgatgcacaatttcgacataaca 23c NCED1F or war d primer CpNCED1R 5c 2ggccacgcgtcgactagtac 23c NCED1Reverse pr imer CpACT1F GU3802935c 2aacgggaaattgt ccgtgac 23c ACT F orward primer CpACT1R

5c 2gaaacatcgtcctcagtggt 23c

ACT Reverse pr imer

注:本研究所克隆的基因在GenBank 登录号为Cp NCE D 1(GU380290)和CpACT1(GU380293)。

1.2.5 数据统计

试验所有数据用Excel 软件进行计算和作图,采用t 测验对试验数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 西葫芦果实成熟过程中呼吸速率、乙烯产生及

ABA 含量的变化

不同时期西葫芦的呼吸速率,乙烯产生和不同组织中ABA 的含量如图1所示。西葫芦果实中乙烯的产生最高出现在花后5d,为9.18nL/(h #g),以后乙烯含量一直维持在低水平,直至果实完全成熟和衰老。由图1可知西葫芦的呼吸速率在花后5d 较高,随后下降,到花后15d 时降到4.37nL/(h #g)。但是在花后20d 又上升,达到最高,为9.88nL/(h #g),然后一直下降。图2为西葫芦不

同时

图1 西葫芦不同时期呼吸速率和乙烯产生的变化F ig.1 Change of r esiration rates and ethyleme pr oduction

in the zucchini .s growth and development

期不同组织中ABA 的含量,果肉中ABA 的含量在幼果期较高,然后下降。花后15d 开始增加,到花后20d 达到最大值1000ng/g,之后下降,但到花后35d 又有少量的增加;果皮中ABA 的变化不大,

峰值晚于果肉5d;瓤和种子中ABA 的含量总体上比果皮中的高,但是在花后25d 有明显的降低,达到200ng/g,之后上升到30d 达到最高600ng/g

。

图2 西葫芦不同时期不同组织中ABA 质量分数的变化Fig.2 Change of ABA content in the zucchini .s gr owth

and development in the differ ent t issues

2.2 西葫芦NCED 基因的克隆

根据已知的番茄、鳄梨、柑橘等的N CED 基因,设计兼并引物扩增得到西葫芦N CED 基因的保守片段,回收纯化PCR 产物并测序,结果表明扩增得

到的确是西葫芦N CED 基因的保守片段,长度约为743bp(图3(a))。通过3c 2RACE 得到约1000bp 的cDNA 片段,测序后得到1213bp 的包含多聚核苷酸的3c 序列(图3(b))。

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(a )是Cp N CED 保守序列扩增结果,M 为Markv,1为N CED 基因保守片段;(b)是CpN CE D 3c 2RACE 扩增结果,M 为DL2000,2为3c 2RACE PCR 产物。

图3 NCED 基因扩增结果

F ig.3 PCR r esult s for N CED genes

2.3 西葫芦NCED 基因氨基酸序列推测及同源性

分析

将1213bp 的3c 序列与743bp 的中间片段拼接出1572bp 的3c 端完整序列;推导该序列编码1个含432个氨基酸的蛋白。BLAST 比对和同源性分析表明西葫芦N CED 基因所编码的氨基酸序列与番茄LeN CED1(Z97215)氨基酸同源性为69175%,与柑橘果实CsN CED 1(DQ028471)氨基酸同源性为68.75%,与CsN CED2(DQ028472)同源性为71.76%,与鳄梨PaN CED1(AF224672)氨基酸同源性为65.74%,与P aN CED3(AF224671)同源性为66.67%(图4),此外与桃(P pN CED 1,EF625684;P pN CED 2,EU912386)和葡萄(VvN CED1,EF625685)果实NCED 氨基酸片断地同源性都在69%以上。因此认为所获得的基因片断属于N CED ,命名为CpN CED 1,并在GenBank

上进行登录。

图4 不同物种NCED 基因的氨基酸序列比对

F ig.4 Amino acid sequences alignment of Cp NCED gene from differ ent species

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第5期吴洁芳等:西葫芦果实CpNCED1基因3c 端的克隆及其表达分析

2.4 CpNCED 1在西葫芦果实成熟过程中的表达

由图1可知,西葫芦果实成熟过程中几乎没有乙烯的产生,所以本项研究重点分析了ABA 与西

葫芦果实成熟的关系以及CpN CED 1在西葫芦果实成熟过程中的表达。通过Real time RT 2PCR 研究了西葫芦果实发育过程中Cp N CE D 1在果肉、果皮和种子不同部位的表达(图5)。结果显示,花后5d 果肉中基因的表达量最大,随后下降,之后又上升,在花后20d 达到最大值,花后25d 降到最低,随后又少量的增加。这与果肉中ABA 基因表达量的变化一致。果皮中CpN CED 1的表达,从花后5d 开始下降,之后上升,在花后25d 达到最大,之后开始下降直到果实成熟。Cp N CE D 1在果皮中表达的趋势与果皮中ABA 的变化整体一致。瓤和种子中Cp N CED 1的表达总体来说变化不大,花后5d 到花后25d 有少量降低,之后上升,花后30d 达到最大值,

之后持续不变。

图5 CpNCED 1基因在西葫芦果实成熟过程中

表达的实时定量PCR 分析

Fig.5 Real time RT 2PCR analysis of expr ession of

CpN CED 1dur ing the zucchini fruit ripening

3 讨 论

现在已经证明由9c 2顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)催化的顺2环氧类胡萝卜素向黄氧素的转化是高等植物中ABA 合成的限速步骤

[729]

。

本研究从西葫芦果实中克隆了一个编码N CED 基因的cDNA 中间片断及其3c 末端序列,命名为Cp N CED 1。Cp N CE D 1推导的蛋白质序列与其他种类的果实,不论是跃变型果实番茄,鳄梨,还是非跃变型果实柑橘等的NCEDs 都具有很高的同源性,说明果实成熟的遗传和生理生化机制是非常保守的。

西葫芦果实为非跃变型果实,在其发育和成熟整个过程中,除了5d 的幼果外,只能检测到少量的乙烯。而花后5d 检测到的乙烯很有可能是伤诱导乙烯,因为5d 的幼果非常嫩,在采摘及乙烯检测过程中极易受伤。从本实验结果看,乙烯在西葫芦果实成熟过程中应该不起主要作用。果实的呼吸作用有明显的变化,在花后20d 达到最大,与果肉中ABA 的变化一致。从花后20d 开始,果实的糖酸比开始上升,硬度开始下降(数据未显示),说明果实成熟的开始是在花后20d 前后。从上述数据分析,CpN CED 1基因的表达在西葫芦果实成熟过程中共有3个高峰的出现,第1次出现在花后5d 的幼果期,它可能与果肉的细胞分裂有关,第2次出现在花后20d 前后,它可能和果实成熟开始有关,果实中随即积累的内源ABA 构成了西葫芦果实成熟的启动信号。果实内源ABA 的绝对含量不是启动果实成熟的关键因素,还与激素信号受体的数量和活性有关[18]

,因此即使少量的ABA 也足以引起生理反应,而在此之前即使组织中高浓度的ABA 也不能启动成熟。第3次是在花后35d,它可能和果实的衰老有关。上述CpN CED 1基因的表达也说明,该基因是西葫芦果实ABA 生物合成的关键酶基因,由它诱导合成的ABA 遍及果实的生长、发育、成熟和衰老全过程,是西葫芦果实的重要成熟调控因素。

在西葫芦果实发育与成熟过程中,CpN CED 1在不同组织中持续表达,并与ABA 的含量相对应。但是,在不同成熟期不同组织中CpN CED 1的相对

表达量有很大差异。在果实成熟之前果肉和果皮中CpN CED 1的表达基本与其ABA 的变化相一致。而种子中Cp N CE D 1的表达及其ABA 含量在果实成熟时达到最高,这可能与随后的种子休眠有关。

迄今为止,有关N CE D 基因在果实中的表达在鳄梨[12]

、柑橘[13]

、葡萄[18]

、番茄[3]

、甜瓜[15]

上有报道。在鳄梨中P aN CED 1、Pa NCE D 3在果实成熟过程中表达,与果实成熟相关。在柑橘中CsN CE D 1在果实成熟过程中表达,表现出与果实成熟的相关性。在番茄中,LeN CED 1只在破色期表达,与ABA 合成高峰的时期一致。在番茄果肉和种子中LeN CED 1的起始表达的时期早于ACC 合成酶LeACS 2,LeACS4以及ACC 氧化酶LeACO 1。此外,外源ABA 能促进番茄果实LeACS 2,LeACS4,LeACO 1提前表达和表达量的上升,而抑制番茄果实内源ABA 的合成则会导致番

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中国农业大学学报2010年第15卷

茄果实LeACS2,LeACS4,LeACO1表达量的下降。这说明在番茄果实成熟过程中,ABA较乙烯可能具有更重要的功能,ABA可能触发了番茄果实乙烯的合成[3]。我们发现,外源A BA处理也能促进Cp N CED1的表达和西葫芦果实内源ABA含量的增加(数据未显示),进一步的实验还在进行中。

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红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯

毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校

华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告

癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。

基因的克隆、表达载体构建与功能验证

基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，

移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析

青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛

绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析

3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒

受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果

一个快速响应干旱的F-box基因的克隆和表达分析

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.wendangku.net/doc/7917821832.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.wendangku.net/doc/7917821832.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.wendangku.net/doc/7917821832.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.wendangku.net/doc/7917821832.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.wendangku.net/doc/7917821832.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发

基因克隆和表达

Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.wendangku.net/doc/7917821832.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006

gfp基因的克隆与表达

基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L

目的基因的克隆与及表达

分子生物学大实验—目的基因的克隆与及 表达 第一节基因操作概述 (2) 一、聚合酶链式反应(PCR) (2) 二、质粒概述 (4) 三、凝胶电泳 (5) 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6) 五、重组质粒的连接 (7) 六、限制性内切酶消化 (7) 七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7) 第二节材料、设备及试剂 (7) 一、材料 (8) 二、设备 (8) 三、试剂： (9) 第三节操作步骤 (10) 一、目的基因的获得： (10) 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11) 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12) 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定

(13) 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE 电泳。 (14) 六、融合蛋白的毒力测定 (16) 第四节本实验的实验报告 (16)

第一节基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA 扩增达106倍。 （一）、PCR反应中的主要成份 1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中

目的基因的克隆表达

目的基因的克隆表达 一．PCR 1.原理 DNA在高温时发生解链，温度降低时又可复性成双链。根据DNA的半保留复制原则，通过控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP完成特定基因的体外复制。2. 反应体系 LA Taq DNA聚合酶0.25*6=1.5ul 10* buffer 2.5*6=15 ul dNTP 4*6=24 ul P1 1*6=6 ul P2 1*6=6 ul 模板1*5=5 ul 水15.25*6=92 ul 3. 注意事项：先加多的再加少的；模板最后加；设置阴性对照， 不加模板，加入等量的水 4.反应过程 （1）预变性：94℃,1min (2)变性：90℃,30s (3)退火：45-60℃，45 s （4）延伸:72℃,2min (5)2,3,4,5步循环

（6）72℃,10min （7）16℃，保温 二．琼脂糖凝胶电泳 1.原理：若将一种分子置于电场中，它会以一定的速度向适当的电极移动。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。由于琼脂糖凝胶是一种无反应活性的稳定的支持介质，故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小，极性及介质粘度的函数。因此，根据分子大小的不同，构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在凝胶电泳中，加入适量的溴乙啶或Glodview染料，它能对核酸分子进行染色，而不与琼脂糖凝胶相结合，然后将电泳标本放在紫外线下观察，可清晰地检测到发出绿色荧光的DNA谱带位置。 2.具体操作 1.制胶 （1）称量0.25g琼脂糖和25ml缓冲液TBE，混合均匀 （缓冲液TBE的作用：用于稳定体系酸碱度，使溶液两极的PH保持基本不变；是溶液具有一定的导电性，利于DNA的迁移） （2）在微波炉中打化，每20s摇一下 （3）按每10ml培养基加0.5 ul的比例加入Glodview核酸染料，使DNA带上绿色荧光标记