细胞融合和单克隆抗体

温故而知新

1、下列与细胞工程技术相关的表述中，不正确的是（）

A: 植物体细胞杂交技术可以克服常规的远缘杂交不亲和障碍

B: 动物细胞培养与植物组织培养所用的培养基成分基本相同

C: 动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同

D: 植物组织培养技术的理论基础是细胞的全能性

2、关于动物细胞培养和植物组织培养的叙述,错误的是( )

A. 动物细胞培养和植物组织培养所用培养基不同

B. 烟草叶片离体培养能产生新个体,小鼠杂交瘤细胞可离体培养增殖

C. 动物细胞培养和植物组织培养过程中都要用到胰蛋白酶

D. 动物细胞培养可用于检测有毒物质,茎尖培养可用于植物脱除病毒

3、如图为白菜—甘蓝杂种植株的培育过程。下列说法正确的是（）

A: 图示白菜—甘蓝植株不能结籽

B: 愈伤组织的代谢类型是自养需氧型

C: 上述过程中包含着有丝分裂、细胞分化和减数分裂

D: 白菜—甘蓝杂种植株具有的性状是基因选择性表达的结果

4、下表为动、植物细胞工程的有关内容比较,你认为错误的是

A. 0处

B. 1处

C. 2处

D. 3处

5、科学家把天竺葵的原生质体和香茅草的原生质体进行诱导融合，培育出的驱蚊草含有香茅醛，能散发出一种特殊的达到驱蚊且对人体无害的效果。下列关于驱蚊草培育的叙述中，错误的是( )

A、驱蚊草的培育属于细胞工程育种，其优点是能克服远源杂交不亲和的障碍

B、驱蚊草培育过程要用到纤维素酶果胶酶、PEG等试剂或离心、振动、电激等方法

C、驱蚊草培育过程是植物体细胞杂交，不同于植物组织培养，无愈伤组织和试管苗形成

D、驱蚊草不能通过天竺葵和香茅草杂交而获得是因为不同物种间存在生殖隔离

6、科学家利用植物体细胞杂交技术成功获得了番茄—马铃薯杂种植株,为了便于杂种细胞的筛选和鉴定,科学家利用红色荧光和绿色荧光分别标记番茄和马铃薯的原生质体膜上的蛋白质,其培育过程如图所示。

(1)植物体细胞杂交依据的生物学原理有_________________________________。

(2)过程①常用的酶是____________________,细胞融合完成的标志是_________________ 。

(3)植物原生质体融合过程常利用化学试剂______________诱导融合,在鉴定杂种原生质体时可用显微镜观察,根据细胞膜表面的荧光的不同可观察到_______种不同的原生质体(只考虑

两两融合),当观察到______________时可判断该原生质体是由番茄和马铃薯融合而成的。(4)过程③和过程④依次为___________________,过程④中的培养基常添加的植物激素是___________________。

(5)若番茄细胞内有m条染色体,马铃薯细胞中含n条染色体,则“番茄—马铃薯”细胞在有丝分裂后期含____ 条染色体。若杂种细胞培育成的“番茄—马铃薯”植株为四倍体,则此杂种植株的花粉经离体培育得到的植株属于_______ 植株。

细胞融合和单克隆抗体

1、关于动物细胞融合的说法不正确的是（）。

A: 动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程

B: 动物细胞融合后形成的具有原来两个或多个动物细胞遗传信息的单核细胞称为杂交细胞C: 常用的诱导动物细胞融合的手段有：聚乙二醇、灭活的病毒、电激、紫外线照射

D: 细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能

2、下列有关利用动物细胞工程生产单克隆抗体的叙述,错误的是( )

A. 单克隆抗体制备使用的主要生物材料是骨髓瘤细胞和浆细胞

B. 单克隆抗体制备的原理之一是一个浆细胞可以产生多种特异性抗体

C. 筛选能分泌所需抗体的杂交瘤细胞运用了抗原一抗体特异性反应原理

D. 单克隆抗体具有纯度高、产量大、灵敏度高等优点

3、下列有关植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较，正确的是（）。

A: 两者应用的原理都是高度分化的细胞具有全能性

B: 两者都可用聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合

C: 两者最终都能获得杂种生物

D: 两者都已用于大量生产分泌蛋白

4、很多生物工程技术都需要进行“筛选”,下列与之相关的叙述中正确的是( )

A. 目的基因导入受体细胞后,需要筛选,以确保目的基因已经成功导入

B. 植物体细胞杂交过程中需要筛选出杂种植株,以获得新类型

C. 动物细胞融合后要进行筛选,选择出杂种细胞进行细胞培养

D. 单克隆抗体制备的第一次筛选,要选择出能产生特定抗体的杂交瘤细胞

5、植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术与原理不相符的是( )

A、纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理——酶的专一性

B、植物组织培养和动物细胞培养——细胞的全能性

C、原生质体融合和动物细胞融合——生物膜的流动性

D、紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养——细胞分裂

6、下列说法不正确的是( )

A. 体细胞融合技术可用于制备单克隆抗体

B. B淋巴细胞与肿瘤细胞融合,杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因

C. 利用植物体细胞杂交技术可克服生殖隔离的限制,培育远缘杂种

D. 用动、植物成体的体细胞进行离体培养,都须用液体培养基

7、下列关于细胞工程的叙述，不正确的是（）

A、植物体细胞杂交的原理是细胞膜的流动性和植物细胞的全能性

B、动物细胞融合的过程包括杂交细胞形成杂交新个体

C、细胞融合包括质融合和核融合，细胞壁形成是质融合完成的标志

D、二倍体生物细胞融合后，遗传物质为二个细胞遗传物质的组合

8、下列是应用动物细胞工程获取单克隆抗X抗体的具体操作步骤，其中对单克隆抗体制备的相关叙述错误的是（）。

①从患骨髓瘤的小鼠体内获取骨髓瘤细胞

②将X抗原注入小鼠体内，获得能产生抗X抗体的B淋巴细胞

③将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内培养④筛选出能产生抗X抗体的杂交瘤细胞

⑤利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞⑥从小鼠腹水中提取抗体

⑦利用促细胞融合因子促使细胞融合

A: 实验顺序应该是①②⑦⑤④③⑥B: ③过程产生多个杂交瘤细胞的过程称为克隆C: ⑦过程获得的细胞均可无限增殖

D: 利用细胞融合生产单克隆抗体过程中通常要经过两次筛选

9、如图表示抗人体胃癌的单克隆抗体的制备过程,有关叙述错误的是( )

A. 图中实验小鼠注射的甲是能与抗人体胃癌抗体特异性结合的抗原

B. 利用聚乙二醇、灭活的病毒和电激等方法可诱导细胞融合获得乙

C. 用特定的选择培养基对乙筛选,融合细胞均能生长,未融合细胞均不能生长

D. 丙需进行克隆化培养和抗体检测,经多次筛选后可获得大量能分泌所需抗体的丁

10、下列关于细胞工程的叙述,正确的是( )

A. 细胞的全能性是植物组织培养和动物细胞培养的理论基础

B. 进行植物组织培养,需先用酶解法去掉细胞壁

C. 要获取单克隆抗体只能将杂交瘤细胞注入小鼠体内培养

D. 动物细胞培养可作为检测有害物质的有效手段

11、下图表示单克隆抗体的制备过程，请回答下列问题：

（1）图中小鼠需经过___________________________才能用于单克隆抗体生产。

（2）细胞A具有产生___________的功能。细胞B的突出特点是__________________。A、B细胞融合的诱导因素通常是___________或聚乙二醇，融合后具有______________特征的细胞是符合要求的。

（3）若细胞A基因型为HH，细胞B基因型为SS，生产的目标是基因型为_____________的细胞。在两两融合后的众多细胞中，基因型还可能有_____________ 。可通过特定的____________培养基将所需的融合细胞筛选出来。

（4）培养液的配方通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素等，与植物细胞培养基有所不同的是，还含有____________ 。细胞在培养瓶中贴壁生长，随着细胞的增多，需要定期地用______________处理，使细胞从瓶壁上脱离下来，以便于分装到更多的培养瓶中继续培养。

（5）单克隆抗体与常规抗体相比，最大的优越性是________________________________。（6）淋巴细胞是由动物__________中的__________________分化发育而来的。

12、如图是单克隆抗体制备流程阶段示意图.

(1)________________技术是单克隆抗体技术

的基础.

(2)根据培养基的用途分类,图中培养基属于

________________培养基.

(3)单克隆抗体与常规的血清抗体相比.最大

的优越性是__________________________．

(4)动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体

融合常用诱导剂外,还可以采用___________________．

(5)选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的____________特点,又具备淋巴细胞的___________________特点.

(6)淋巴细胞是由动物体________ 中的___________________细胞分化、发育而来.

(7)杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是___________________．

原生质体细胞融合技术

食品生物技术课程论文原生质体细胞融合技术

原生质体细胞融合技术 摘要：细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术己在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。综述了细胞融合技术中的常用方法:细胞融合仙台病毒诱导法、细胞融合PEG（聚乙二醇)诱导法、细胞融合电场诱导法、细胞融合激光诱导法;以及最新研究进展:基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片、空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术等，并对它们的优缺进行简要的评述。 关键词：原生质体细胞融合技术影响因素融合方法发展 正文： 原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞，这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质，具有新的遗传或生物特性。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy 等采用离心力诱导的方法，报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到界间的融合。目前，通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。细胞融合核技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方而都有广泛的应用价值。特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。 1 原生质体融合技术 微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备，原生质体融合，原生质体再生。 1. 1 原生质体制备与再生过程中的影响因素 制备原生质体的最大障碍就是细胞壁，现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法，使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶，具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多，不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上，多采用对数生长中后期的细菌，这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感。对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中，用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5:3: 1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用

动物细胞融合和单克隆抗体

单克隆抗体导学案2.2.2 班级姓名 问题生成阶段 【温故知新】 免免 结分泌的，能和抗原 1．抗体的化学本质是，是由合。诱导融合细胞2.动物细胞融合：不同DNA的两种细胞 筛选杂交细胞 3.动物细胞培养：分散的单个细胞制成原代培养 培养 【新知预学】 1．传统抗体的获得 (1)方法：①向动物体内反复注射某种，使动物产生；②从

动物 中分离所需抗体。 (2)特点：、纯度低、。 2．单克隆抗体的制备原理 细胞特点 能产生，但不能B淋巴细胞 能，但不能骨髓瘤细胞 既能融合细胞，又能 单克隆抗体的制备过程3. (1)制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的，然后从小鼠 获得相应的B淋巴细胞。 1 (2)细胞融合：融合的方法常用聚乙二醇、、电激等，这时得到的融合细胞除了杂交瘤细胞，还有相互融合的细胞和相互融合的细 胞。 (3)筛选：用特定的培养基筛选出杂交瘤细胞。这时候的杂交瘤细胞既能 同时又能。 (4)克隆化培养和抗体检测：从杂交瘤细胞群中选出能产生的特异性杂交瘤细胞。 相关资料：先在多孔培养皿上培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。由于该细胞群是由单个杂交瘤

细胞克隆来的，所以产生的抗体一定是化学性质单一、特异性强的单克隆抗体。 (5)培养杂交瘤细胞获得单克隆抗体：将杂交瘤细胞在条件下做大规模培养或注射到小鼠内增殖，从 ______或小鼠的 ______ 中提取单克隆抗体。 4．由上述抗体的产生过程我们可将单克隆抗体的定义归纳为：由 大量繁殖所产生的、的抗体。 5．单克隆抗体的应用 (1)优点：、、并可能大量制备。 (2)应用 ①作为诊断试剂，具有准确、、简易、的优点。 ②用于和。 问题解决阶段 【合作探究】单克隆抗体的制备 B淋巴细胞？如何得到已免疫的1. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？2.如何诱导效应 融合过程中会出现几种类型的细胞？3. 怎样淘汰我们不需要的细胞？上述过程得到的细胞哪种是我们需要的？其特 点是什么？4. 淘汰后的细胞所产抗体是单一的吗？如何检测？5. 如何获得大量“单克隆抗体”？6. 2 注意：制备单克隆抗体过程中两次筛选的方法及目的

细胞融合技术的应用与前景

细胞融合技术的应用与前景 人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象，首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞，紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合，随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后，人们又实现了利用灭活病毒促进动物异种细胞融合，从而打破了细胞融合的种属屏障，推动细胞融合技术跃上新的 台阶。原生质体的大量制备较为困难，限制了植物细胞融合技术的发展，因此植物细胞融合的起步较动物细胞融合要迟10年左右。直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后，才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因，人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制，活性稳定，使用方便的化学物质PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合，但在PEG诱导细胞融合的有效的浓度范围内(50～55)对细胞毒性很大，因此人们又找到了新的方法来替代PEG，这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术以及空间融合技术等。纵观细胞融合技术的发展历史，该技术的不断改进首先表现在融合剂上，从致癌活病毒到灭活病毒再到化学物质，其次体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法一般采用将化学法和物理法结合起来进行，如将磁、超声、机械等和激光、电相结合，同时添加化学剂以便进一步提高融合率，细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、简单，便于量化研究，同时融合率又能得到不断提高的 方向发展。 1．细胞融合的意义 所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合或细胞杂交口]。如取材为体细胞则称体细胞杂交，体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。细胞融合不受种属的局限，可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限和生殖壁垒，极大地扩大了遗传物质的重组范围；细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求不象基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，有着重大的实践意义，正得到科学界的日益重视[2_引。经过长期反复研究和实践，细胞融合技术逐步发展和完善起来，已成为生物工程的基础技术之一。特别是近20年来，从理论和实践两个方面，有力地推动了生物科学各领域的发展。细胞融合方法得到了不断的更新，融合率也得到逐步的提高。 2．动物细胞融合技术 动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品，改良培育动物新品种，缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，特别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成绩。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的用。动物体细

细胞融合技术的发展及应用

#专题综述# 细胞融合技术的发展及应用* 霍乃蕊a,韩克光b (山西农业大学a.食品科学与工程学院;b.动物科技学院,山西太谷030801) 摘要:细胞工程是四大生物工程之一,细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上,另一方面体现在新方法上,再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段向操作更为简便,便于量化研究,同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。本文以细胞融合技术的发展历史为主线,对上述内容做了简要综述。 关键词:细胞融合技术;发展;应用 中图分类号:Q813.2 文献标识码:A 文章编号:100727146(2006)022******* C ell Fu si on T echn iqu e:its D eve l opm en t and App lica ti on s H U O N a i2ru i a,HA N Ke2guang b (Shanxi Agr i cu lt ura lUn i ve rs it y a.College of Food Sc i ence and Eng i neering; b.College ofAn i m a l Sc ience and Technol ogy,Ta i gu030801,Shanx,i Ch i na) Ab stra ct:C ell u l a r engi neer i ng i s o ne of t he f our techniques of biote chnolo gy,and as t he core of ce ll ular engi neering, the cell fusi on technique ha s acqu ired outstand i ng ach ieve m ents i n m any fields such as agr icu lt ure,m ed icine and envi2 ron m enta l protecti on.Its app licati on i s still i ncreasi ng i n nu m ber.The i m prove m ent of t he ce ll fusi on techn i que i nvol ves the fusi on agent,new m e t hods and the cells used i n fusi on.No w new cell fusi on m ethods are re sorti ng to the co m b i ned usage of phys i ca l and chem i ca lm ethods to deve l op a s i m p le and co nven i ent,easy quantificati on and a t t he sam e ti m e can i ncrease the fusi on rate.A ll these aspects were d i scussed i n th i s pape r centered aro und the h i story of the cell f usio n te ch2 n i que. K ey word s:ce ll fus i on techn i que;deve l op m ent;app licati on 细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20世纪70年代末至80年代初,是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术研究的不断深入,细胞融合 第15卷第2期2006年4月 激光生物学报 ACTA LAS ER BI O LOGY SI NI CA Vo.l15No.2 Ap r.2006 *收稿日期:2005203210;修回日期:2005209222 基金项目:山西省科委攻关项目(04105523);山西省自然科学基金项目(20041094) 作者简介:霍乃蕊(1972)),女,博士,现为澳大利亚纽卡斯尔大学访问学者,主要从事生物工程方面研究. (电子信箱)sxndkgh@163.co m

高中生物选修三教案 动物细胞融合与单克隆抗体

2020年4月16日磨课教案 第二单元动物细胞工程 2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体 一、学习目标 1．知识目标： ⑴掌握动物细胞融合与植物体细胞杂交的区别和联系。 ⑵简述动物细胞融合和单克隆抗体制备的过程。 ⑶了解单克隆抗体在医学实践中的应用，并说其应用实例。 2．能力目标： 让学生尝试设计单克隆抗体的制备过程，指导学生掌握获取知识和探索生物科学的基本方法，使学生了解生物科学认识模式以发展学生的创造性能力。 3．情感、态度和价值观目标： 通过向学生介绍动物细胞融合与单克隆抗体技术的发展动态及一些新的研究成果，使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入，知识不断更新并向前发展，认识到学无止境，形成终生学习的意识。 二、教学重点难点单克隆抗体的制备过程。 三、流程 1、小结植物细胞工程涉及的技术，让学生回顾有关植物体细胞杂交技术的基本知识 2、探究一：动物细胞的融合 教师提出思考问题，布置学生进行讨论探究，四人一组，探讨交流。 多媒体展示探究思考题。 1）、植物体细胞杂交和动物细胞融合的区别 2）、植物体细胞杂交和动物细胞融合的主要区别是什么？ 3）、为什么可以使用灭活的病毒促进动物细胞融合？ 4）、不灭活的病毒能作为诱导剂吗？ 3、探究二：单克隆抗体制备的原理 多媒体展示探究问题。 1）、传统的抗体生产方法及缺陷是什么？抗体是从何来的？

2）、B淋巴细胞有什么特点？ 3）、若要想获得大量的单一抗体，如何做呢？ 4）、在体外培养的条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的，那么，怎样解决这一问题的呢？ 5)、小结以下内容： ◆利用____________________产生特异性抗体的功能。 ◆利用____________________无限增殖的特性 ◆利用____________________技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞。 ◆利用____________________技术大量培养杂交瘤细胞 4、探究三：单克隆抗体制备的过程 教师通过多媒体展示单克隆抗体的制备过程，同时提出问题，教师展示讨论问题，学生分组讨论。 1）、如何获得B淋巴细胞？ 2）、如果把B淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起时，会有几种融合方式（类型）？ 3）、选择杂交瘤细胞的两步筛选的目的各是什么？ 4）、如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？（教师讲解为主） 5、探究四：单克隆抗体的应用 教师引导学生阅读课本进行回答，多媒体展示问题 1）、单克隆抗体的应用有哪些？ 2）、生物导弹的组成及优点 四、二次备课

动物的克隆----动物的细胞融合技术及其应用

第二章克隆技术 第三节动物的克隆----动物的细胞融合技术及其应用 【学习目标】 1.说出动物细胞融合技术的概念、原理及方法。 2.辨别细胞融合与细胞杂交。 3.简述单克隆抗体的制备过程。 【学习重难点】 1.重点：动物细胞融合技术的概念、原理及方法；辨别细胞融合与细胞杂交；单克隆抗体的制备过程。 2.难点：辨别细胞融合与细胞杂交；单克隆抗体的制备过程。 【课前导忆】 写下植物体细胞杂交（原生质体融合）的原理和诱导方法。 动物细胞克隆培养的方法和要求。 【课堂任务】 任务一： 请阅读p31，完成以下问题 细胞融合的概念： 细胞杂交的概念： 细胞融合的诱导方法： 选择下列材料，为制备针对肝癌细胞的单克隆抗体提供思路 原理： 动物细胞的融合物理： 诱导方法化学： 生物： 应用： 【课堂练习】 1、人绒毛膜促性腺激素(HCG)是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，制备抗 HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。下图是抗HCG单克隆抗体制备流程示意图，请分析回 答： (1)制备单克隆抗体过程中要用到_________和__________技术。

(2)制备单克隆抗体过程中，给小鼠注射的HCG相当于________，使小鼠产生分泌相应 ________的淋巴细胞，此过程属于特异性免疫中的______________免疫。 (3)在细胞内DNA合成一般有两条途径，主途径是在细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基喋呤可以阻断此途径。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存 在的情况下，经酶催化作用合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。 ①．利用DNA合成途径不同的特点配制的HAT培养基含有多种成分，其中添加的_________ 成分具有筛选杂交瘤细胞的作用。 ②．最终筛选获得的杂交瘤细胞的特点是___________________。 (4)此过程生产的单克隆抗体可以与______________特异性结合，从而诊断早孕。

植物细胞融合的研究进展_综述_郭学民

河北科技师范学院学报　第19卷第1期,2005年3月 Jo ur nal o f Hebei N or mal U niver sity of Science&T echnolog y Co llege V o l.19　No1.1M arch2005 植物细胞融合的研究进展(综述) 郭学民1,2,徐兴友1,2,王同坤1,王华芳2,尹伟伦2 (1河北科技师范学院生命科学系,河北秦皇岛,066600;2北京林业大学生物科学与技术学院)摘要:概述了原生质体分离和培养的影响因素,介绍了近年来国内外原生质体培养与融合及杂种细胞、筛选和鉴定的动态。 关键词:细胞融合;原生质体;筛选与鉴定 中图分类号:Q321+.2 文献标识码:A 文章编号:1672-7983(2005)01-0065-05 细胞融合(cy to mixis),亦称细胞杂交(cell fusio n),是指亲本的两个细胞在特定的物理和化学因子处理下合并为一个杂种细胞的过程[1]。植物细胞融合可分为体细胞杂交(somatic hybridizatio n)和配子-体细胞杂交(gameto-somatic hy br idizatio n),前者是指不经过有性过程,而直接由体细胞原生质体融合产生杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[2],后者是指性细胞(如小孢子四分体、精子、精细胞、幼嫩花粉、成熟花粉、卵细胞、助细胞和中央细胞等)原生质体和二倍体原生质体融合产生三倍体杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[3]。植物细胞融合是植物细胞工程的一个重要分支,是一种突破物种生殖隔离、创造远缘杂种的新途径,原生质体技术还可用于细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入。 自1960年Cocking[4]用酶法分离出番茄根原生质体后,Natag a和T akebe[5]1970年首次利用烟草叶分离原生质体,经培养获得再生植株;1975年以色列的Vardi等[6]首次从木本植物Sham onti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织,并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株;在禾本科植物中,除在珍珠谷、紫狼尾草用悬浮细胞为材料,较早获得原生质体再生植株外,直到1985年Fujim ur a[7]等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株,才出现了重大突破。现已从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进,植物细胞融合获得了巨大成功。植物细胞融合包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养,以及植株的再生和鉴定等环节。 1　原生质体的分离和培养 1.1　起始材料 起始材料及其生理状态对原生质体的制备及其活力有很大的影响。在以往的双子叶植物培养中,大多以叶片为分离原生质体的材料,近年来,起始材料的适用范围有了较大扩展。目前,以愈伤组织、悬浮细胞和体细胞胚为材料制备原生质体是最主要的方式;禾本科植物原生质体培养获得成功的试验,几乎都是用从幼胚或成熟胚诱导形成的胚性愈伤组织或胚性细胞系来游离原生质体。采用这些材料制备原生质体方法简便、产量高、不污染、不易破碎。 1.2　基因型 同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不同,所以在相同条件下,不同品种的再生能力不同。王光远和夏镇澳[8]在水稻原生质体培养中曾用26个品种进行组织培养,其中仅有3个品种(粳稻农虎6号、国香1号和上农香糯)能成功地用于原生质体培养,获得再生植株。据统计,小麦获得原生质体再生植株的基因型只有大约10个[9]。基因型的选择在植物原生质体培养中起着重要作用,它不仅影响原生质体的产量和活力,而且还影响植株的再生。Cheng和Veillenux证明芙薯(Solanum phureja)从原生质体培养到愈伤组织形成受2个独立位点的显性基因的调控[10]。因此,现有 收稿日期:2004-03-09;修改稿收到日期:2004-12-12

动物细胞融合与单克隆抗体(讲课教案)

动物细胞融合与单克隆抗体(讲课教案) 黄冈中学 屈泽兵 一、教学重点 1．细胞融合的概念及原理 2．单克隆抗体的制备过程及原理 3．单克隆抗体在实际生活中的应用 二、教学难点及突破 1．杂交瘤细胞的筛选。课文中的相关介绍语言简洁，但是此处也是学生理解单抗制备的最大难点，教师可以将该过程分解，设置一些小问题，带领学生仔细阅读，从课本寻求答案，最终准确理解该知识点。 2．“生物导弹”中单克隆抗体的作用。抗体本身具有清除抗原的作用，学生在这里容易形成误解，认为“生物导弹”中治病的是抗体，此处教师也应该设置问题，引导学生仔细读书，准确理解课本语言，避免形成错误的认识。并可以组织一场短时间的讨论，讨论在什么样的情况下，应该采取这种治疗手段。 三、教学过程 导入：在植物细胞工程的内容中，我们学习了植物体细胞杂交，从而克服了植物种间杂交生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。那么，我们能不能用类似的方法，对动物体细胞进行融合，从而获得新的动物类型呢？今天，我们就来学习一下动物细胞融合技术。 1．动物细胞融合（也称细胞杂交） 概念分解：两个或多个动物细胞 → 人工诱导 → 一个细胞（即杂交细胞） 杂交细胞：融合后形成的具有两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。 融合原理：细胞膜具有流动性 诱导方法：物理、化学、生物方法。 2．单克隆抗体 单克隆：用一个细胞作为祖细胞，通过分裂得到很多相同的细胞，称之为单克隆。 克隆则指的是获得相同的物质，有时候DNA 的复制也可以称为克隆。在抗体的生产中，用于生产抗体的细胞起源于一个杂交细胞，所以称之为单克隆抗体。 （1）制备 带问题去看书： ① 总结单克隆抗体制备的生物学原理基础。 ② 诱导动物细胞融合之后，我们会得到哪些种类的细胞？ ③ 单抗制备过程中用到了哪些筛选手段？ ④ 单克隆抗体在“生物导弹”中的基本作用？ 原理：一个B 细胞分泌一种抗体，瘤细胞能无限增殖 过程： 分解筛选步骤，设置小问题引导学生思考： ① 第一次筛选我们获得的是什么细胞？ ② 第二次筛选是怎样实施的？获得的是什么细胞？ B 淋巴细胞 小白鼠 注射抗原 骨髓瘤细胞杂交细胞 能产生特定抗体的细胞 筛选 杂交瘤细胞 抗体鉴定 筛选 培养

综述：无缝克隆与基因融合(中文版)

无缝克隆与基因融合 基因融合技术是基因功能研究的关键工具。准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使我们可以对分子进行精确的研究。本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这些杂交分子的方法 前言 随着各种基因组测序项目的完成，人们越来越关注基因产物的功能分析。基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。传统的基因融合技术涉及到type II 限制酶消化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。然而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处，概括了实现无缝基因融合的方法。 无缝基因融合及其应用 无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起，在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。这是获得杂交基因的理想情况。以下强调几个例子，以表明无缝基因融合的重要性。 启动子和外显子研究 基因启动子含有许多调控元件。转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息。然而，因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。在真核细胞中，通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。只要杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。 蛋白质功能研究和蛋白质工程 蛋白质由有功能结构域构成。为了阐述一个蛋白某个结构域的功能，需要构建该结构域删除或者被相似结构域替换的突变体。这种结构域删除或者互换实验将在很大程度上得益于相关元件的无缝融合，来消除有操作序列所带来的潜在的负面影响。更加概括地说，不同结构域的无缝融合对于蛋白质工程是非常重要的，包括获得新的杂交分子和抗体改造。对于抗体改造，互补决定区嫁接（CDR-grafting）和定点突变是经常要做的。嵌合体蛋白也可以通过內含肽介导的蛋白拼接和连接获得。只要含有內含肽的前体蛋白没有多余的序列，精确蛋白融合就可以实现。 蛋白质表达 标签和融合伴侣的使用促进了蛋白质的表达。它们赋予蛋白的可溶性和稳定性并促进接下来的目的蛋白的亲和纯化。在目的蛋白的活性不受到融合伴侣或者标签影响的情况下，整个融合蛋白可以直接用到接下来的研究中。对于酶学研究和测定，通常是这种情况。然而，在许多情况下，移除融合蛋白是必要的，这可以通过改造的蛋白酶酶切位点来完成。这个过程需要蛋白酶切位点和目的蛋白之间无缝的连接。为了进行功能研究，在一些情况下携带一个短标签（比如his标签）的融合蛋白被成功地结晶，移除这个标签是不必要的。然而，如果带有标签的蛋白无法结晶，就难以估量标签的影响，标签的切除通常是必要的。 在表达成熟和有活性蛋白的过程中，常常需要表达蛋白氨基酸序列与原来的一样。例如

细胞融合实验报告

聚乙二醇介导的细胞融合 2012年2月19星期一 陈倩倩（118627140313）同作者：郑梦璐谢雨后赵松 1、文摘 细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合,使远缘杂交成为可能,因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限,扩大了遗传物质的重组范围。 但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要求的性状出现,直接利用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。 细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作,在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂,投资少,有利于广泛开展研究和推广,有着重大的实践意义,正得到科学界的日益重视。 自从20世纪70年代Kao和Michayluk用聚乙二醇( PEG, polyethyleneglycol) 诱导大麦、大豆等植物原生质体融合后PEG 法诱导细胞融合以其容易制备、活性稳定、不需要特别的仪器设备、操作简便等优点, 被普遍地应用于生物、遗传、医药等研究领域. 高体积分数、高相对分子质量的PEG会对细胞产生毒性,是限制其被广泛应用的瓶颈, 此外,由于该方法涉及的影响因素较多, 进一步加大了获得理想细胞融合率的难度.本实验主要研究PEG的浓度和细胞浓度对细胞融合率的影响。 2、背景介绍 细胞融合现象最初是在动物细胞中发现的。1958年日本学者阅田善雄用紫外光灭活的仙台病毒在体外诱导艾氏腹水红纲胞相互融合。1965年他和Harris等在此基础上各自分别采用灭活的仙台病毒,诱导产主了第一个种间融合并培养成活。一年后Yerganzan又进一步使用仙台病毒获得了能够增殖的杂种细胞。后来Littlefield 用缺陷型细胞HGPRT-XTK-细胞杂交,用HAT 选择培养基选出杂种细胞,开创了细胞工程的新纪元,继而推动了整个生物工程的发展。1975年英国科学家Milestein 和Kohler在体细胞杂

选修三专题二2.2.2《动物细胞融合与单克隆抗体》导学案

学校：临清二中 学科：生物 编写人：黄丽平 审稿人：于振玲 专题二细胞工程一一.动物细胞工程 2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体 课前预习学案 一、预习目标 预习动物细胞融合和单克隆抗体制备的过程， 应用实例。 “二、预习内容 ㈠、动物细胞融合 1概念： _________ 或 ________ 动物细胞结合形一个细胞的过程，也称细胞杂交。 2、 结果：形成 。 灭活的病毒或 PEG 3、 过程：两个或多个细胞 ________________________________________ 4、 意义：克服了 ___________ 的不亲和性，成为研究 _________________ 、 ____________ 、肿瘤和 _________________ 培育的重要手段。 ㈡、单克隆抗体 1抗体 ⑴产生细胞： ____________________ 。 ⑵成分： ____________ 。 ⑶特点：从 ___________ 中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。 2、单克隆抗体的制备 (1)过程 一 给小鼠注射特 从 ________ 中分、 r 未融合细胞 定的抗原蛋白 f 离B 淋巴细胞 灭活病毒融合 -------------- 培养骨髓瘤细胞 I V ___________ f 骨髓瘤细胞 \ 体外培养 ⑵杂交瘤细胞的特点： _________________________ 、 _______________________ 。 ⑶单克隆抗体的优点： _______________ 、 _______________ 、 _____________ 。 ㈢、单克隆抗体的应用 1、 作为诊断试剂，具有 _____________ 、 ___________ 、 ___________ 、 ____________ 的优点。 2、 用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗 _____________ 、可制成 _____________ 。 三、提出疑惑 同学们，通过你的自主学习，你还有哪些疑惑，请把它填在下面的表格中 了解单克隆抗体在医学实践中的应用， 并说其 选择培养基 小鼠体内培 ＜养 抗体

细胞融合技术的发展过程

细胞融合技术的发展过程 生物方法融合：1957年，冈田善雄意外发现仙台病毒（HVJ），能诱导悬液中小鼠艾氏腹细胞（EAC）融合。然后Harris、Kada等用于诱导种间细胞融合，获得成功。 化学方法融合:1972年，卡尔森首先用硝酸钠进行烟草两个种的细胞原生质体的融合，1974年K a o等，首先发现聚乙二醇（PEG）能诱导植物细胞原生质体融合产生杂交细胞。 1975年Pentecorvo发现P E G也能帮助哺乳类动物细胞的融合，1976年，Davidson更进一步证实这一结果，并且认为其具有简单快速、高效率等优点。因而，1975年之后聚乙二醇就逐渐取代了仙台病毒。 电融合法电融合法:70年代未期和80年代初期发展起来的一种新的细 胞融合方法。1970年，Senda首先应用电脉冲，通过微电极在显微镜下使植物细胞融合，奠定电融合技术基础。 激光诱导卵细胞融合:激光诱导方法是最新的细胞融合方法，该法为张闻迪等人在1988年首先应用，他们利用激光微束的单色性、高功率密度、短脉宽和极小的作用范围等特点。对泥鳅受精卵进行融合试验，获得成功，且融合后的细胞可存活发育，经卵裂期、囊胚期、原肠期、孵化期、直至幼鱼。整个过程可通过显微镜观察，还可同时由电视摄象监视器观察和进行照相记录。 典型试题解析

试题：回答下列关于细胞工程的问题。（1）如图是细胞融合的示意图， 据图回答。 ①若A、B是植物细胞，则在细胞融合之前已用处理过。用 聚乙二醇诱导融合之后，体系中会出现未融合的细胞，原因 是。 ②若A是小鼠骨髓瘤细胞，B是受到抗原刺激的B淋巴细胞，用灭活的 仙台病毒诱导融合之后，需要用特定的选择性培养基进行筛选。在该培 养基上，细胞和的细胞都会 死亡，只有融合的杂种细胞（杂交瘤细胞）能够生长。杂交瘤细胞不止 一种，原因是。 （2）植物组织培养有一项应用是培育“脱毒苗”，动物细胞培养需要 创造“无菌无毒的环境”，脱毒苗中的“毒”是指，“无菌无毒环境”中的“毒”是指。 （3）制备单克隆抗体有一项重要的应用是作为诊断试剂，例如“早早 孕诊断试剂盒”。“早早孕诊断试剂盒”通过检测被测试者尿液中人绒 毛膜促性腺激素的含量，从而判断被测试者是否怀孕，其起检测作用的 核心物质是。 （4）动物的培育过程中需要进行细胞核移植，早期的细胞 核移植操作会将供体细胞的细胞核取出，再植入去核的卵母细胞，但取 出细胞核的过程会对细胞核造成一定的损伤。后期的核移植操作是直接 将供体细胞注射到去核卵母细胞外的透明带位置，再通过电刺激的方法 诱导，从而实现供体细胞核进入去核卵母细胞。 【答案】：（1）①纤维素酶和果胶酶融合的成功率不是百分之 百②未融合的亲本融合的具有同种核小鼠脾脏中分离 的B淋巴细胞是多种 （2）病毒代谢废物 （3）抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体 （4）克隆供体细胞膜与去核卵母细胞膜融合 【解析】：植物体细胞杂交技术：就是将不同种的植物体细胞原生质体 在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术；单克隆抗体的制备过程：首先用特定抗原注射小鼠体内，使其发生免疫，小鼠体内产生具有免疫能力的B淋巴细胞，再利用动物细胞融合技术将 B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，经过两次筛选获得产生特定抗体的杂交 瘤细胞。据图分析，图示A细胞与B细胞融合，形成的C是正在融合的 细胞，D是杂种细胞。

细胞融合技术研究进展

细胞融合技术研究进展 年级专业 课程 学生姓名 学号 指导教师

摘要：人们对细胞融合的机理、融合方法的了解越来越多，其应用范围也越来越广。对细胞融合的机理、方法、应用及目前存在的问题进行了综述。 关键词：细胞融合;机理;方法;应用 细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉骨骼胎盘的发育[1]、肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供了有力的手段[2],而且被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单克隆抗体[3-4]及动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。 1细胞融合的机理 最近研究表明,细胞融合与病毒和细胞之间的融合以及细胞内的膜泡融合有许多相似之处,即带包被的病毒(或细胞)通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合。I类病毒融合蛋白包括流感病毒红血球凝集素(HA)和人类免疫缺陷病毒包被蛋白,它们都具有相似的结构域,即都具有a-螺旋结构。病毒和细胞之间正是通过这些蛋白来完成融合过程(伴随有构象的变化)的。细胞内的膜泡融合也是如此,其相关融合蛋白包括GTPases及SNARE家族。因此推测细胞融合采用相似的机理。然而细胞融合蛋白并不全具有a-螺旋结构,提示a-螺旋并非融合所必需[2]。 2细胞融合的方法 2.1生物法 自从发现活的仙台病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了利用灭活的病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新台阶。解决病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异等问题是病毒诱导细胞融合新的研究方向。 2.2化学法 2.2.1盐类融合法 此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。2.2.2高钙和高pH值融合法 Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。 2.2.3聚乙二醇融合法(PEG法) 加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。 2.3物理法 2.3.1电脉冲诱导细胞融合技术 电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。

PCR 技术综述

08检二陈勇0803010049 PCR技术综述 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。能通过体外（试管内）扩增将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。目前，这项已广泛应用于分子生物学的各个领域，在医学检验中也显示广阔的应用前景。PCR技术的展简史 1953年沃森（Watson）与克里克（Crick）提出的DNA结构模型。 1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制。 1971年Korana最早提出核酸体外扩增的设想：经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA聚合酶I的Klenow片段。但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA 片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶等特点。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶Taq DNA Polymerase。此酶的发现使PCR得以广泛应用。 20世纪90年代中期，随着多种自动化PCR扩增仪的问世，PCR 技术迅速普及，其应用范围也越来越广泛。近年来，PCR技术从原来的定性检测迅速发展到实时定量检测，它克服了传统PCR的许多不足，在分子诊断及其他相关领域发挥着重要作用。 PCR技术的基本原理 PCR是一种选择性体外扩增DNA的方法,反应原理与细胞内的DNA 半保留复制相似,但PCR的反应体系要简单的多,主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3 ’末端互补的合成引物、四种dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。基本过程是以待扩增的DNA片段为模板,首先高温变性,将混合物加热到94℃维持15到30秒,使模板DNA双链解旋成两条单链；然后逐渐降温退火,温度降到55℃,使引物与模板DNA单链碱基互补配对结合；最后在引物、四种dNTP、DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。理论上每次循环结束后靶DNA扩增一倍，即靶DNA数目以

细胞工程在细胞融合技术上的应用

摘要：细胞工程是四大生物工程之一，细胞融合技术作为细胞工程的一项 心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上，另一方面体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用，使细胞融合的方法和手段向操作更为简便，便于量化研究，同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。 关键词：方法动物细胞融合植物细胞融合应用 1.细胞融合常用的技术 1.1生物法 仙台病毒HVJ诱导法 1962年日本的冈田善雄偶然发现了由日本血凝性病毒HVJ或称仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象+ 冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础, 细胞融合现象的发现引起细胞学界的高度重视。 1.2化学法 1.2.1盐类融合法 此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。1.2.2高钙和高pH值融合法 Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。 1.2.2聚乙二醇融合法(PEG法) 加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。 1.3物理法 1.3.1电脉冲诱导细胞融合技术 电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。 1.3.2激光融合技术 1987和1989年德国海德堡理化研究所采用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟[7]。该法可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌无毒性,但它只能逐一处理细胞。 2细胞融合技术的最新进展

细胞融合技术及其研究进展

细胞融合技术及其研究进展 摘要：自1958年Okada首次表明紫外灭活的仙台病毒可以诱导体外培养细胞融合形成多核体以来，细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术，已在医药、环保、免疫学、医药、食品以及农业等领域的基础研究和应用开发。本文综述了细胞融合技术中的常用方法：仙台病毒（HVJ）诱导法、聚乙二醇（PEG）化学诱导法、电融合诱导法及激光诱导法的基本原理和研究进展。 关键词：细胞；细胞融合；细胞工程 1 引言 在细胞融合是 20 世纪发展起来的一种细胞工程技术，可以在一定的条件的诱导下使两个或多个细胞(原生质体) 相互接触，进而发生膜融合、胞质融合和核融合，从而形成杂种细胞。细胞融合所形成的新细胞( 杂合细胞) 得到了来自两个父本细胞的遗传物质，因而具有新的遗传学或生物学特性[1]。细胞融合逐渐成为细胞工程的一项核心技术，它不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等领域的研究提供了有力手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、免疫学、医药、食品以及农业等领域具有广泛应用价值[2]。它已成为杂交育种、单克隆抗体制备、动物克隆以及抗癌疫苗研发等现代生物医学研究中的一项关键技术。 随着研究的不断深入，细胞融合技术的应用领域越来越广，产生的影响也日益显著，本文就其现有的研究情况进行讨论。 2 细胞融合技术 2.1仙台病毒(HVJ)诱导法 2.1.1仙台病毒诱导法原理 1962年日本的冈田善雄偶然发现了由仙台病毒引起的细胞融合成多核细胞的现象[2]。由于仙台病毒诱导细胞融合法较简便,特别是许多种类的细胞对其敏感,所以常选用仙台病毒作为细胞融合的诱导剂。仙台病毒属于RNA病毒,其质膜表面存在两种糖蛋白,一种是HANA 蛋白,它具有凝集红细胞能力和神经氨酸普酶活性。一种是F蛋白,它具有质膜融合能力(质膜和细胞膜融合的能力)、细胞融合能力和溶血能力。仙台病毒诱导细胞融合的能力与共质