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改善反向液相色谱峰拖尾的方法

改善反向液相色谱峰拖尾的方法
改善反向液相色谱峰拖尾的方法

改善反相HPLC中的峰拖尾

在反相HPLC中峰拖尾是一个普遍的现象。特别是分离碱性化合物和通过HPLC分析药物成分时是经常产生拖尾缘由。峰拖尾可以引起分离度降低,灵敏度减弱,精密度和定量变差。图1表明峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相关。图2表明准确度和精密度因数据系统无法准确识别峰的起点和终点而受到影响。

图1 拖尾对分离度和灵敏度的影响

当峰拖尾(T,拖尾因子)从1.0增加到2.0时,分离度(Rs)从1.5降到1.0。灵敏度(峰高)由于峰的体积增大和样品的浓度降低而降低。

图2 峰拖尾对准确度和精密度的不利影响。

拖尾峰使数据系统难以准确确定峰的终点,故而影响准确度和精密度。在这个例子中,在B点测得到峰面积比在A点测得的峰面积少约3%。

峰拖尾的原因,峰拖尾的主要原因有:

1、溶解样品的溶剂比流动像更强,

2、样品量过载,

3、固定相中的硅醇基与胺类物质相结合反应,

4、硅胶吸附酸性化合物,

5、色谱柱柱床中有空隙。

只要确定了拖尾的原因就可以采取措施减少拖尾并消除之。(表1)

表1 峰拖尾:原因及解决方案

一、由于溶解样品的溶剂极性强于流动相而引起的拖尾

如果溶解样品的溶剂极性强于流动相,就会引起宽的甚至是拖尾的峰。有几种线索可以帮助确定是由于此种原因引起的拖尾。第一种就是先流出的峰的拖尾较后流出的峰拖尾严重;另一种迹象就是进样量减少或者是样品经流动相稀释后进样峰拖尾减轻了。

如果怀疑拖尾的原因是流动相的强度引起的,解决很简单。将样品溶解在流动相中,或者将样品经流动相稀释至进样后峰拖尾符合要求。

二、由样品量过载引起的峰拖尾

当进样量超过柱子的容量,样品峰会呈现一个直角三角形。当更多的样品量注入时,峰的前端变得很尖而后端就拖尾更严重。另一个现象就是色谱柱过载后保留时间会随样品量的增加而提前。(见图3)由样品过载引起的峰拖尾的解决方案就是减少进样量。表2提供了各色谱柱的直径及参考的最大进样量,表2还提供了进样量的范围,因为实际进样量依赖于柱子的填料(具有高的表面积的填充材料可以具有大的进样量),分析物质(分子量大的进样量要少),和其他的因素比如样品在流动相中的溶解性。

图3 样品量过载引起的拖尾

样品过载,峰的前端会变得尖锐,后端拖尾,保留时间会稍微提前。如果峰形看上去有点像直角三角形,那么可能就是过载了。

表2 HPLC色谱柱的参考最大进样量

表3 反相HPLC常用缓冲液

三、由固定相中的硅醇基与胺类相互作用引起的拖尾

在反相HPLC中出现拖尾的另一个常见的原因是由于带正电荷的溶液(胺类)与固定相颗粒表面上的酸性硅醇发生了离子交换而引起的二次保留(图4),具有显著的硅醇活性的固定相的色谱柱大部分都会发生此现象,而且中性pH(6~8)条件下比在酸性pH(<3)更易发生。

酸性和中性的化合物一般不受影响,一些碱性化合物更易受到此效应的影响。如果是因为硅醇的原因引起的拖尾,可以从下面几部来纠正拖尾的问题。首先,确认流动相中有合适的缓冲盐,可能的话尽量在pH<3的条件下操作。使用足够的缓冲液控制pH并减少离子交换效应。

在pH<3的条件下操作,可使硅胶固定相上的硅醇基质子化,减少了溶质与硅醇反应的几率。

图4相互作用引起的峰拖尾

固定相表面的酸性硅醇基可以形成与碱性化合物反应的离子交换位点,经反相HPLC分离胺类化合物时,这种离子交换反应常常引起峰的保留(二次保留)和峰拖尾。

另一种解决拖尾的方法是在流动相中加入竞争性的胺类,加到流动相中的三乙胺(TEA)就是这个目的。TEA可以与硅醇发生强的反应,并抑制样品中的胺类与硅醇反应。图5是TEA如何提高峰形的例子,多数情况下,大约10mM的TEA 足够了。

有些色谱分析者反对向流动相中加入竞争性的胺类,因为增加了分析方法的复杂性并且用一种不易逆转的方法改变了色谱柱的性质。强度胺类,像三乙胺,不易从色谱柱上洗脱下来。那意味着用过含有TEA的色谱柱就不再适合应用于流动相中不含TEA的分析。

图5 向流动相中加入TEA用来提高峰形

色谱柱:Eclipse XDB-C8 4.6*150mm

流动相:85%25mMNa2HPO4,pH7.0,15%ACN

流速:1.0ml/min

温度:35℃

样品:苯丙胺类

1. 苯丙醇胺

2. 麻黄碱

3. 苯丙胺

4. 甲基苯丙胺

5. 苯三胺

向流动相中加入竞争性的胺类,三乙胺等,可以减少峰拖尾。三乙胺与硅醇强烈作用,减少了样品混合物中胺类与硅醇的作用。阿米替林常用来检测反相HPLC 色谱柱的硅醇活性。下表根据阿米替林的对称性(峰拖尾)对色谱柱进行了分类。其中阿米替林具有较低的对称性的柱子具有较低的硅醇活性,这些色谱柱是常常用来用反相HPLC分离胺类物质的最好选择。数据来源于国家标准化研究所对标准参考物质的分析认证870“液相色谱用柱性能测试混合物”

使用三乙胺可以不用选择低硅醇活性的固定相。图6根据硅醇的活性分列出了常用的C18反相色谱柱,在图6中的分类根据测定阿米替林的对称性,一种胺类常用来测定固定相的硅醇活性。阿米替林在固定相中具有较低拖尾(低对称值)时,该固定相就显示较低的硅醇活性并且检测碱性化合物时就会有较低的拖尾。

图6 根据硅醇活性排列的常用C18柱

色谱柱:4.6×150mm,5um

流动相:80%甲醇20%0.05M磷酸盐缓冲液pH7

流速:2.0ml/min

温度:24℃

样品:阿米替林

四、酸性化合物在硅胶上吸附引起的拖尾

虽然较胺类引起的拖尾少,酸类物质有时候引起峰的展宽和拖尾主要由于硅胶固定相的吸附。纠正因为此类原因引起的拖尾就应提高流动相中盐的浓度来抑制二次反应,降低流动相的pH使硅醇和溶质质子化,必要时可以向流动相中加入竞争性的酸(图7)。

图7 酸性化合物引起的峰拖尾通常可以向流动相中加入酸来改善

色谱柱:4.6×150mm,C18

流动相:40%5mMNaH2PO460ACN

样品:布洛芬

布洛芬,酸性化合物,严重拖尾,向流动相中加入乙酸可以改善。乙酸优先和硅胶固定相表面的酸性硅醇基反应,抑制了布洛芬和硅醇基的反应,减低了拖尾。

五、由于柱床空隙引起的拖尾

色谱柱床的柱头空隙可引起峰的展宽有时候会拖尾。虽然几年前柱子有空隙非常普遍,生产商现在完善了填装技术生产更高质量的色谱柱,除非在极高的压力或流速的条件下装柱,很少色谱柱中有空隙,然而,如果通常色谱柱具有良好的柱效,突然发现所有的峰均拖尾时,可能是柱子有空隙。先洗脱出的峰较后洗脱的峰更易受柱空隙的影响。

虽然许多色谱分析者尝试用相同的固定相材料修补柱子的空隙,就经验来讲,此法很少能达到预期的效果。由于柱子空隙引起的拖尾最好的解决方法就是换掉它,这样可以节省时间,金钱,减少麻烦。

峰形拖尾的原因及解决方法

技术报告 改善反相HPLC中的峰拖尾 在反相HPLC中峰拖尾是一个普遍的现象。特别是分离碱性化合物和通过HPLC分析药物成分时是经常产生拖尾缘由。峰拖尾可以引起分离度降低,灵敏度减弱,精密度和定量变差。图1表明峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相关。图2表明准确度和精密度因数据系统无法准确识别峰的起点和终点而受到影响。 图1 拖尾对分离度和灵敏度的影响 当峰拖尾(T,拖尾因子)从1.0增加到2.0时,分离度(Rs)从1.5降到1.0。灵敏度(峰高)由于峰的体积增大和样品的浓度降低而降低。 图2 峰拖尾对准确度和精密度的不利影响

拖尾峰使数据系统难以准确确定峰的终点,故而影响准确度和精密度。在这个例子中,在B点测得到峰面积比在A点测得的峰面积少约3%。 峰拖尾的原因,峰拖尾的主要原因有: 1、溶解样品的溶剂比流动像更强, 2、样品量过载, 3、固定相中的硅醇基与胺类物质相结合反应, 4、硅胶吸附酸性化合物, 5、色谱柱柱床中有空隙。 只要确定了拖尾的原因就可以采取措施减少拖尾并消除之。(表1) 表1 峰拖尾:原因及解决方案 原因解决方案 样品溶剂极性强于流动相在流动相中溶解样品,尽可能降低样品 溶剂的强度 样品量过载减少进样量,参考表2中推荐的不同柱 型对应的不同进样体积 硅醇基与胺类物质的结合 1.调节流动相的pH<3.0。 2.增加流动相的离子强度,25mM~ 50mM。 3.流动相中增加竞争性的胺类,10mM

的TEA(三乙胺)。 4.选择低硅醇活性的固定相。参照图6 C18柱按固定相硅醇活性分级。 5. 酸性物质在硅胶上的吸附 1.增加流动相中盐的浓度,25mM~ 50mM。 2.调节流动相的pH< 3.0 3.增加竞争性的有机酸,1%醋酸或者 是0.1%TFA(三氟乙酸) 柱子空隙更换新的色谱柱 尝试填充空隙很少能达到较好的效果。 一、由于溶解样品的溶剂极性强于流动相而引起的拖尾 如果溶解样品的溶剂极性强于流动相,就会引起宽的甚至是拖尾的峰。有几种线索可以帮助确定是由于此种原因引起的拖尾。第一种就是先流出的峰的拖尾较后流出的峰拖尾严重;另一种迹象就是进样量减少或者是样品经流动相稀释后进样峰拖尾减轻了。 如果怀疑拖尾的原因是流动相的强度引起的,解决很简单。将样品溶解在流动相中,或者将样品经流动相稀释至进样后峰拖尾符合要求。 二、由样品量过载引起的峰拖尾 当进样量超过柱子的容量,样品峰会呈现一个直角三角形。当更多的样品量注入时,峰的前端变得很尖而后端就拖尾更严重。另一个现象就是色谱柱过载后保留时间会随样品量的增加而提前。(见图3)由样品过载引起的峰拖尾的解决方案就是减少进样量。表2提供了各色谱柱的直径及参考的最大进样量,表2还提供了进样量的范围,因为实际进样量依赖于柱子的填料(具有高的表面积的填充材料可以具有大的进样量),分析物质(分子量大的进样量要少),和其他的因素比如样品在流动相中的溶解性。 图3 样品量过载引起的拖尾

反相色谱峰形拖尾的原因和改善方法极限色谱柱

各种造成峰形拖尾的原因分析: [柱物理损坏] 色谱柱有物理损坏是造成峰形拖尾的根源。唯一的解决方法就是更换新柱。 [柱内填料污染] 流动相和样品中的杂质是色谱柱主要污染源。 流动相所用的各种溶剂至少是分析纯,尽量使用色谱纯试剂。流动相所用的水最好是超纯水或全玻璃器皿双蒸水。用前先用0.45um溶剂微孔过滤(器)过滤,除去可能存在的微粒。流动相建议现用现配,对于含盐的溶液尤其注意长置会产生细菌或出现沉淀。此外还得保证储存流动相的容器清洁。 复杂样品可选用0.45um溶剂微孔过滤(器)或样品预处理柱对样品进行预处理,确保样品中不含微粒杂质。若样品不便处理,要使用保护柱。 柱内填料污染时,可将柱头螺丝卸下,用专用工具挖出柱内前段被污染填料,再以相同的填料重新填入,修复。或以能溶解污染物的流动相按色谱柱使用的相反方向,冲洗色谱柱(约20至30倍柱体积,或视具体情况而定;另外,此时不能接检测器),将污染物冲出色谱柱,再按色谱柱标明的使用方向使用。 [柱进口处有异物] 当断定是柱进口处有异物时,可将柱头螺丝卸下,取出滤帽并将其置于20%硝酸溶液中,用超声波清洗约20分钟,再置于超纯水中,并用超声波清洗约10分钟,重新装入色谱柱内即可。 [样品浓度过高致使柱超载] 样品在柱上超载能引起峰展宽,拖尾(或伸舌)。 适当减小进样量或样品浓度(需要时,可提高检测器灵敏度)直至峰形和保留时间不再改变,便可消除这种不良影响。减小进样量还能改善其分离度。正常情况下,样品中每种化合物在150×4.6mm柱中进样量保持在3~50ug范围内,不会引起明显超载。 [样品溶剂不对] 选择合适的样品溶剂,以排除不必要的干扰。最好选用流动相溶解样品。 [柱外效应] 柱外效应(即进样阀、色谱柱及检测器间的管路过长、直径过粗、管路接头不匹配、有死体积)是影响色谱柱柱效的主要因素之一。所以在可能的条件下,色谱柱的两端连接管路要尽可能短,连接管内径尽可能细小,切口务必平整光滑,尽可能的减小死体积,以防止因样品扩散造成不能反映色谱柱真实柱效等情况发生。 [缓冲不足或不合适] 在缓冲不好或离子强度过低的分离中,也会出现保留时间重现性差和峰形拖尾。增加缓冲浓度(与样品大小相匹配)能改善此情况。 [硅醇基团作用] 仔细分析色谱柱内填料表面性质可知:反相色谱柱填料的表面大约被键合相覆盖了一半,其余的就是未被键合的硅醇基团。所谓的保留是指样品分子与键合相相互作用的结果。但是,酸性或碱性化合物与硅胶表面残存的硅醇基团或金属杂质之间相互作用而引起双重保留机理,因此,发生了峰形拖尾。

液相色谱峰形问题 减少拖尾

液相色谱峰形问题减少拖尾 2010-09-17 06:46:08| 分类:03液相色谱问答 | 标签:液色迷人液相色谱专家四极杆液质联用仪液相色谱品牌排名|字号订阅 液相色谱峰形问题减少拖尾液相色谱峰形拖尾解决方案 液相色谱峰形问题- 夜色砖家的日志- 网易博客 高效液相色谱法专家专注hplc药物分析液相...在流动相中加入三乙胺,能显著的改善...四烷基季铵盐(如四丁基硫酸氢铵、四...3)增加流动相中缓冲盐的浓度增加缓 冲https://www.wendangku.net/doc/854425922.html,/hplc2@126/blog/static/108348 ... 2010-12-26 - 百度快照 三、峰形问题 峰形对称性的优劣对峰面积和分离度有很大的影响,从而影响分析结果的准确性。引起峰形异常的因素很多,柱外死体积引起峰形异常有个特点:对先出的峰影响大,对后出峰影响小;柱头塌陷、柱头和筛板污染会引起所有的峰形都异常,而硅醇基次级保留只引起部分峰拖尾。相塌陷除了引起保留下降外,也会造成峰拖尾。色谱实践中,大部分的峰形问题都不是色谱柱的问题,仪器参数设定、色谱条件和方法正确与否对峰形有很大影响。 1. 峰后拖 常见的3种拖尾情况:

次级保留引起峰拖尾的机理解析: 反相色谱中,通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形,而带有-COOH、-NH2、-NHR、-NR2等极性基团的化合物则比较容易产生拖尾,原因是硅胶表面残留硅羟基对极性和碱性样品分子产生次级保留效应。 反相填料表面有残余的硅羟基,具有一定的酸性,其pKa约为4.5~4.7。根据电离规律,流动相的pH-pKa>2即pH>6.7时,99%以上的硅羟基应该是呈离子状态的,即Si-O-,而pKa-pH>2即pH<2.5时,酸性环境抑制了硅羟基的电离,99%以上的硅羟基应该是呈分子状态的,即Si-OH,但其极性仍然

反相高效液相色谱法测定茶叶中咖啡因的含量

实验一反相高效液相色谱法测定茶叶中咖啡因的含量 一.实验目的 1. 熟悉液相色谱仪的基本构造和操作方法 2. 学会利用外标法对物质进行色谱定量分析 二.仪器与试药 仪器: 高效液相色谱仪(日本岛津10AVP型)、溶剂过滤器、样品溶液过滤器、微量进样器 试药:甲醇、乙腈、超纯水、咖啡因对照品 三、色谱条件 色谱柱:C18(250×4.6,5um) 流动相:甲醇-乙腈-水=45:10:45 (v/v) 检测器及检测波长:紫外检测器280nm 流速:0.6ml/min 四、实验操作 1.对照品溶液的配制:准确称取咖啡因对照品适量,用乙腈:水(1:1)混合溶剂配制成1.0mg/mL 咖啡因储备液;分别移取10μL、20μL、30μL、40μL咖啡因储备液,用超纯水定容至5mL,配制成浓度为2.0μg/mL、4.0μg / mL、6.0μg /mL、8.0 μg/mL的一系列对照品溶液,备用。 2. 样品溶液的配制:准确称取0.035g茶叶, 加乙腈:水(1:1)混合溶剂8mL,超声提取10min,用超纯水定容至10mL,过滤并稀释20倍,备用。 3. 调用或创建咖啡因测定方法并运行方法 4. 测定:待基线平稳后,分别吸取25μL对照品溶液和样品溶液进样。 五、数据处理及计算 以对照品溶液峰面积与对应含量绘制工作曲线,根据样品溶液峰面积在曲线上查出其进样时含量,并计算得到茶叶中咖啡因的百分含量。 六、思考题 1.液相色谱与气相色谱相比较有哪些不同? 2. 如果用液相色谱法测定可乐中咖啡因,样品应该如何处理?

附:岛津10AVP型高效液相色谱仪操作 一、开机 1.打开计算机。 2.开启高效液相色谱仪各部件电源开关(脱气机→A泵→B泵→检测器→柱温箱→主控器)。 3.待高效液相色谱仪各部件自检完毕,在计算机上启动化学工作站ClassVP 并点击Instrument ,输入用户名和密码,点击确定。 二、实验参数的设置 在Method下,进行操作: 1.单击溶剂瓶图标,设置所用溶剂瓶中溶剂量后,点击OK;单击高压泵图标,设置泵流速0.6mL·min-1,梯度洗脱溶剂B(水)0%,最高柱压设为2.0×107 Pa。 2.单击色谱柱图标,设置柱温箱温度为25℃。 3.单击检测器图标,设置检测波长为280nm,,数据采集时间7min。 四、运行样品 1.打开Purge阀。 2.运行Instrument菜单下System On命令启动系统(或单击各图标的on图标启动系统)。 3.待废液管中无气泡流出,关闭Purge阀。 4.待基线稳定之后,单击single run, 进行样品信息编辑。 5. 用微量进样器进样后,扳动手动进样阀至Inject位置,仪器自动开始纪录。 6.待测物出峰完全后,按F8停止采集数据。 五、实验数据处理 1.定性、定量分析参数的设定 (1)一级校正表的建立 ①在Data Analysis界面下,点击File菜单下的Load Signal,调用低浓度标样的实验结果。 ②优化谱图:打开Graphics菜单,选择Signal Options选项,进入Signal Option编辑框,在Range选择中选择Use Range,输入适当的参数。 ③优化积分:在Data Analysis 界面下,单击Integration菜单,选择Integration Event,选择适当的参数,编辑积分项目。

气相色谱常见出峰异常问题的原因及解决办法

理论 ? 实践 190 | 2015年07月 气相色谱(gas chromatography 简称GC)是二十世纪五十年代出现的一项重大科学技术成果。经过这些年的发展,色谱分析技术日趋成熟,色谱仪的使用越来越普及,使气相色谱仪在物质的定性及定量的检测方面有着越来越重要的地位,在石油化工中的大部分的原料和产品都可使用气相色谱法来进行分析。色谱的分析过程是比较复杂的,诸多因素都可以对结果产生影响,经常会出现预料不到的现象,出峰异常就是经常遇到的问题之一,一般表现为色谱出鬼峰,色谱峰分不开,色谱峰拖尾,色谱峰出现圆顶峰,进样后不出峰等,这些问题的出现看似没有规律,认真分析大部分有迹可循。以下就比较常见的造成出峰异常的问题原因进行分析,并讨论可行的解决办法。 1 鬼峰出现的原因及解决办法 1.1 进样口硅胶垫的影响 (1)原因分析。与硅胶垫质量和进样针头质量有关,主要有 几个方面:①进样针头质量不好,边缘不够平整,硅胶垫容易损坏。②硅胶垫使用次数过多或时间长老化,硅胶垫质量不好,材料弹性差,硅胶垫碎屑进入汽化室,便会形成鬼峰。③硅胶垫被污染,如进样时针头处附着的样品液滴被硅胶隔垫所吸附,在之后的分析过程中一点点脱附后进入色谱柱中。 (2)解决办法。检查所使用的进样针及硅胶垫,对质量不好的进样针、使用时间过长或质量有问题的硅胶垫进行有针对的更换。 1.2 进样口、检测器或衬管和分流平板污染 (1)原因分析 污染产生的原因较多,可以归结为以下几 个方面:①长时间未进行色谱仪的定期维护。②待测样品的组成复杂,进样口温度设置不够高,使样品汽化不完全,较重的组分滞留在进样口当中。③汽化室和衬管内经常会聚集一些沉积物及高沸点物质,如果碰到某次分析高沸点物质时,进样口温度升高时就会使聚集的物质逸出多余的峰;④在检测器中和分流平板的凹槽中未挥发的物质会慢慢积累,造成鬼峰无规律出现。(2)解决办法 根据实际污染情况对仪器的各部件进行清理。①清洗进样口。首先拆除色谱柱,之后在保证加热和通气的前提下,将无水乙醇或丙酮由进样口注入,重复3~5次,最后加热通气干燥进样口。②更换衬管或清洗衬管。在衬管被污染时可清楚的看到有颗粒物沉积或石英棉颜色变暗,污染严重时需要更换新的衬管。清洗衬管的方法: 取出衬管中的石英棉,将衬管浸泡在铬酸洗液中24小时后取出,再分别用蒸馏水、甲醇、丙酮清洗后干燥。③分流平板的清洗。将分流衬板置于色谱纯的甲醇等有机溶剂中进行超声处理,干燥,注意在拆卸和安装分流平板的过程中不能直接用手触摸,以防污染。④检测器清洗。热导检测器:根据检测器污染的程度选择合适的清洗溶剂,将丙酮,乙醚,十氢萘等溶剂装满检定器的测量池,浸泡大约20分钟左右后倾出,如此重复多次至所倾出的溶液比较干 气相色谱常见出峰异常问题的原因及解决办法 柴聪(中国神华煤制油化工有限公司鄂尔多斯煤制油分公司, 内蒙古 鄂尔多斯 017209) 摘要:气相色谱作为一种成熟稳定的分离、分析技术,在石油化工领域应用非常广泛,利用气相色谱分析技术进行定性、定量检测时,出峰异常问题的出现往往会给结果判定带来严重干扰。对气相色谱分析时这类问题产生的原因进行分析,找出相应的解决办法, 可以减少处理结果时的干扰,进而提高分析结果判定的准确性。关键词:气相色谱;鬼峰;色谱峰分不开;色谱峰拖尾;解决办法净为止。如果选用一种溶剂不能洗净时,可以根据污染物的性 质先选用高沸点溶剂进行浸泡清洗,然后再用低沸点溶剂反复清洗。洗净后加热驱出溶剂,安装回仪器上,加热检测器至150℃左右,接通载气冲洗4小时左右即可使用。氢火焰检测器:在污染不严重时可以将色谱柱拆下,用管子将进样口与检测器联接起来,然后通载气并将检测器温度升至120℃以上,从进样口先注入20μl 左右蒸馏水,再注入几十微升丙酮溶剂进行清洗。当污染比较严重时,必须卸下检测器进行清洗,顺序拆下收集极、正极、喷嘴, 若喷嘴是不锈钢类的材料做成,可以与电极一起,先用细砂纸细心打磨掉脏污部分,再用超声清洗,最后用甲醇清洗干净,放入烘箱中烘干。 1.3 色谱柱的影响 (1)原因分析。①色谱柱未充分老化,柱温过低老化不充 分,温度过高产生液相遗失。②色谱柱长时间使用。柱自身有吸附特性,柱内余留高浓度样品或柱内留存高沸点物质,柱头被污染。再者毛细管柱低负荷量,需要高灵敏度检测器,这样就特别容易出现鬼峰。 (2)解决办法。截去受污染的柱头部分,升高进样口温度到合适的值,进行柱头老化;在进行组成复杂的样品分析后,采用程序升温对色谱柱进行吹扫,清除色谱柱中的残留物质。在程序升温的过程中,设置的最高柱温必须低于柱子最高使用温度20℃左右,以避免柱流失。 1.4 仪器分析条件设置不合适 (1)原因分析。在分析未知的新样品时,可能会由于仪器条 件设置不当产生一些干扰峰。一般原因是:①样品可能会在分析条件下发生降解产生一些干扰成分,如果这些成分恰好在该条件下有响应,就可能产生鬼峰。②选择的色谱柱不合适,不利于分析高沸点的化合物。 (2)解决办法。通过查阅文献,进行试验,查找方法,尽可能的了解检测样品的各种性质,如极性、分子结构、分子量大小等方面,选择适当的分析条件,包括柱箱、进样口、检测器的使用温度,色谱柱的极性、膜厚、长度、内径等。 1.5 样品污染 样品在进样前的处理过程中受到污染,鬼峰在检测时有规律出现,有良好的重复性,且溶剂空白不包含此峰,这种情况比较容易判断。 解决方法:由于色谱分析是一种痕量分析方法,所以在样品处理的各个过程中用到的所有物品必须保证清洁,以免使干扰物质进入样品。 2 色谱峰分不开的原因及解决办法 2.1 载气流速过高

高效液相色谱分析中异常峰的分析与处理_龚时琼

高效液相色谱分析中异常峰的分析与处理 龚时琼 (华中科技大学化学与化工学院,湖北武汉 430074) 摘 要:高效液相色谱(hig h perf ormance liquid chr omato gr aphy ,H PL C)在高等院校、医药卫生、食品、环保等多个领域的应用越来越广泛。叙述了高效液相色谱仪的工作原理,针对高效液相色谱分析中的异常峰问题进行了分析,并提出了相应的处理方法。关键词:高效液相色谱仪;异常峰;缓冲液 中图分类号:O 657.7 文献标志码:B 文章编号:1002-4956(2010)06-0037-02 Analysis and treatment of unusual peaks in analysis of high performance liquid chromatography Gong Shiqiong (School of Chemistry and Chemica l Eng ineering.H uazhong U niversit y of Science and T echnolog y,Wuhan 430074,China) Abstract:T he hig h perfo rmance liquid chro matog raphy (H PL C)is increasing ly w ide in application,for ex am -ple,colleges and universit ies,medicine health,fo od,env iro nmental pro tect ion,and so o n.T he buffer solution was cho sen and unusual questio ns w ere pro cessed. Key words:hig h per for mance liquid chr omato gr aphy(H PL C);unusual peak;buffer solution 收稿日期:2009-06-17 作者简介:龚时琼(1969)),女,湖北省仙桃市人,工程师,主要从事大 型仪器设备的使用、研发与管理维护. E -mail:370749606@https://www.wendangku.net/doc/854425922.html,;gongs hiqiong@https://www.wendangku.net/doc/854425922.html, 高效液相色谱(H PLC)具有分离效率高、分析速度快和应用范围广等特点,特别适合于高沸点、大分 子、强极性和热稳定性差的化合物的分离、分析。自20世纪60年代后期发展以来,是现代分离测定的重要手段[1] 。目前高效液相色谱已成为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检和法检等领域中重要的分离技术,是分析化学和生物化学等用于解决各种实际分析和分离课题必不可少的工具之一。但在高效液相色谱分析中因各种原因会经常出现异常峰形,严重影响对结果的分析。 1 高效液相色谱仪工作原理 高效液相色谱仪是由溶剂贮液器、高压泵、进样器、色谱分离柱、检测器和数据处理系统等部分组成。 高压泵从溶液贮液器中抽走流动相,流经整个仪器系统,形成密闭的液体流路。样品通过进样系统注入色谱分离柱,在柱内进行分离。柱流出液进入检测 器,使已被分离的组分逐一被检测器收集,并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰,通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算,从而完成整个分析过程 [2] 。 2 异常峰分析 异常的色谱峰指的是色谱图中的无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。异常峰是色谱实验工作中最棘手的问题。这些峰严重影响色谱分析的结果。色谱图中不可能有纯正的高斯对称峰,轻微的拖尾是正常的,这是由分离系统所决定的。在此仅对其中几种异常峰进行分析。2.1 峰前或峰后有小峰的分析 某个单组分样品的大峰附近带小峰,如图1中的第3个峰右下的小峰以及图2中第2个峰左下的小峰。产生原因大致分为以下几种情形,针对不同情况可采取具体的措施是完全可以解决此种异常峰的。 (1)样品不纯。可改变不同的流动相和色谱柱,对样品进行分离比较,选择合适的分离条件。(2)分析柱或保护柱柱头塌陷。此情况较常见,可更换分析柱或保护柱后对峰形进行比较。柱头塌陷时往往所有的峰都会出现峰分裂[3] 。对色谱柱再生和 ISS N 1002-4956 CN11-2034/T 实 验 技 术 与 管 理 Ex perim ental Technology and M anagem ent 第27卷 第6期 2010年6月Vol.27 No.6 Ju n.2010

气相色谱种异常峰型分析

气相色谱15种常见峰形异变来源解析 在日常色谱定量分析中,出现色谱峰形异变或鬼峰,不但严重影响定量精度,甚至使 分析工作无法进行,为此我们把峰形异变常见类型(15种)加以分析,并给出可能原 因,供工作经验不足的色谱工作者参考。我们在此讨论的峰形异变是指在色谱分析方法确定后,与曾经记录的已知色谱图比较时,出现某些色谱峰形的偏离畸变或多余峰。或者说,对于一已经设立好的色谱分析方法,由于不要求或出于无奈时有些峰分离不开、拖尾或峰形不对称等并不影响方法的实施情况,不属于上述因仪器故障、经验不足或操作失误造成的峰形异变。否则需要重新审定或修改原来的分析方法。另外,还应指出:由于无乱安装使用没有评价过的色谱柱可能出现的峰形拖尾,分离不好或峰形畸变,也不属于讨论内容。显然叫一个普通色谱分析工作者,在常规工作条件下去判断色谱柱的优劣,要求似乎高了一些。在怀疑峰形异变寻找可能原因、排除方法之前最好先做以下工作: 仔细核查操作条件,与分析方法要求是否一致; 和当初分析所存的标准色谱图对照,判断是否真出了问题; 逐项仔细观察仪器或设备工作状态,看有无操作失误而引起的出峰失常。 然后在依据以下15种异常峰形分析可能原因与排除方法。 1.台阶峰: (1)TCD热丝被样品中所含卤素、氧、硫等元素腐蚀; (2)气体流量突变如:注射垫突然漏气,气路受阻等; (3)记录色谱峰装置故障如:拉线松; 2.负峰: (1)TCD用氮做载气,由于待测组分在N2中浓度不同,热传导值呈现非线性而可能出现负峰,有时可以通过改变载气流量或进样量克服; (2)操作ECD时进样量过大而出负峰,这是由于工作原理由电子捕获转变为电离检测,此时灵敏度还会大大降低;

高效液相色谱中异常峰分析范文

异常峰分析 异常的色谱峰指的是色谱图中的无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。异常峰是色谱实验工作中最棘手的问题。这些峰严重影响色谱分析的结果。色谱图中不可能有纯正的高斯对称峰 , 轻微的拖尾是正常的 , 这是由分离系统所决定的。在此仅对几种异常峰进行分析。 1.峰前或峰后有小峰的分析 产生原因大致分为以下几种情形 (1) 样品不纯。可改变不同的流动相和色谱柱 ,对样品进行分离比较 , 选择合适的分离条件。 (2) 分析柱或保护柱柱头塌陷。此情况较常见 ,可更换分析柱或保护柱后对峰形进行比较。柱头塌陷时往往所有的峰都会出现峰分裂。对色谱柱再生和清洗可以改善分离效果。

(3) 色谱柱柱容量下降。当长时间使用后 , 有一些强保留组分吸附在柱子中 , 不大的进样量往往就会出现峰分裂。用强洗脱能力的溶剂清洗色谱柱 , 或更换色谱柱可使问题得到改善。 (4) 样品溶剂与流动相不匹配或进样体积过大。当样品溶剂比流动相极性大时 , 有时即使进样体积很小 , 也容易出现峰变形和裂分现象。建议用流动相溶解样品。 (5) 流动相不恰当。此情况较罕见 , 有些样品在特定的色谱条件下可能存在结构的动态平衡 , 而出双峰 , 这种双峰是无法分离完全的 , 改变色谱条件尤其是p H 值会使峰形正常。 (6) 样品分解。不稳定的样品在色谱分离过程中变成其他物质而出现双峰。这时需改变样品处理方法或色谱分离条件。 2.负峰分析 在色谱分析中有时会出现负峰或倒峰 , 如图 3 中的大峰的左下就有一负峰。出现这种现象可能是由以下几种原因引起的 , 可针对不同情况进行排除 , 进而使问题得到解决。 (1) 流动相吸收本底值过高。此时可适当改变检测波长。 (2) 进样过程中进入空气。进行排气处理 , 直到基线平稳再进样。 (3) 样品组分的吸收低于流动相。可改变流动相或改变检测波长。 (4) 配制样品的溶液与流动相不一样。重新配制样品 , 用与流动相一样的溶剂配制或稀释样品。 3.前沿、拖尾峰分析 拖尾:1 干扰峰,优化条件分离;2 色谱柱塌陷,更换色谱柱; 3 流动相pH 不合适,调节pH值;4 管路没有接好,存在较大的死体积,可以重新接一下。 前沿:1 溶剂选择不合适,选择合适的溶剂;2 样品过载,降低进样量; 3 柱温太低,升高柱温;4 色谱柱损坏,更换色谱柱; 图谱前沿和拖尾的原因主要是流动相选择不合适,可以相应调整流动相的极性,或者适当加入酸来调整,可以得到较好的改善。一般来讲,酸碱在流动相中对于前沿和拖尾影响较大。柱前沿是可能因为柱超载,拖尾是可能因为样品被污染,选择合适的流动相,调节好PH能够改善这以情况。 前辈们总是会告诉我们,拖尾峰与柱子有关,可能是过载,稀释样品再做,或换新柱做。有时候托尾峰往往是有机性相近杂质没有分开,此时,可以优化分析方法,或更换柱子试一试;也可能由于柱子使用时间太久柱效下降出现塌陷等原

反相高效液相色谱法测定雪碧中的苯甲酸

分析化学实验报告 实验名称:反相高效液相色谱法测定雪碧中的苯甲酸 专业:化学教育 班级:11化学班 姓名: 指导教师:郭老师 日期:2013.9.7

一、实验目的 1、学习高效液相色谱仪的操作。 2、了解高效液相色谱法测定苯甲酸的基本原理。 3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。 一、实验原理 苯甲酸为具有苯或甲醛的气味的鳞片状或针状结晶,具有苯或甲醛的臭味。熔点122.13℃,沸点249℃,相对密度1.2659(15/4℃)。在100℃时迅速升华,它的蒸气有很强的刺激性,吸入后易引起咳嗽。微溶于水,易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。苯甲酸是弱酸,比脂肪酸强。苯甲酸是重要的酸型食品防腐剂。在酸性条件下,对霉菌、酵母和细菌均有抑制作用,但对产酸菌作用较弱。抑菌的最适pH值为2.5~4.0,一般以低于pH值4.5~5.0为宜。在食品工业用塑料桶装浓缩果蔬汁,最大使用量不得超过2.0g/kg;在果酱(不包括罐头)、果汁(味)型饮料、酱油、食醋中最大使用量1.0g/kg;在软糖、葡萄酒、果酒中最大使用量0.8g/kg;在低盐酱菜、酱类、蜜饯,最大使用量0.5g/kg;在碳酸饮料中最大使用量0.2g/kg。 用高效液相色谱法将饮料中的苯甲酸与其它组分(如:柠檬酸(钠)、蔗糖等)分离后,将已配制的浓度不同的苯甲酸标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的,测定它们在色谱图上的保留时间t R和峰面积A后,可直接用t R定性,用峰面积A作为定量测定的参数,采用工作曲线法(即外标法)测定饮料中的苯甲酸含量。 三、仪器和试剂 1、Agilent 1220高效液相色谱仪。 2、色谱柱:Kromasil C18,5μ 150×4.6mm。 3、流动相:75%甲醇(色谱纯)+25%PH=3.3的磷酸缓冲溶液(过三次)。 4、苯甲酸标准贮备溶液:准确称取0.0109g含量99.5%苯甲酸,用过三次的蒸馏水溶解,定量至50mL容量瓶中,并稀释至刻度。标样浓度217μg·mL-1。 4、测饮料试液:雪碧 四、实验内容

色谱峰拖尾的原因

色谱峰拖尾的原因 色谱峰拖尾的原因有很多,例如: 1.色谱柱本身填装问题,筛板堵塞或填料塌陷;柱坏; 2.柱头有污染; 3.样品超载; 4.样品溶剂不合适; 5.柱外效应; 6.化学或二次保留(硅羟基)效应; 7.缓冲容量不足或不合适; 8.重金属污染。 解决方法如下: 一、与化学有关的拖尾问题 1.流动相中,加入30mM的三乙胺(用于碱性化合物)或醋酸胺(用于酸性化合物),未知化合物加醋酸三乙胺; 2.如仍然拖尾,将三乙胺换为二甲基辛胺(或醋酸二甲基辛胺); 3.降低进样量至<1μg。 二、与色谱柱有关的拖尾问题 1.如柱头处有强保留的样品组分积聚,反相柱可用20倍柱体积的96%的二氯甲烷与4%甲醇,加1%氢氧化铵混合液冲洗;正向柱可用甲醇冲洗; 2.使用保护柱。 三、与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽 1.进样体积过大,(通常≤25μL); 2.进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大(最佳连接管应<20cm,内径为0.007");

3.检测器流通池的体积过大。 多数色谱分析工作者在日常工作中想必都遇到过这样的问题:当用反相柱进行酸性或碱性化合物分析时,常常出现峰形拖尾现象,严重降低分离质量和精度,尤其是使用自动数据系统时。在此,笔者就各种造成峰形拖尾的原因作一次简浅的分析: [柱物理损坏] 色谱柱有物理损坏是造成峰形拖尾的根源。唯一的解决方法就是更换新柱。 [柱内填料污染] 流动相和样品中的杂质是色谱柱主要污染源。 流动相所用的各种溶剂至少是分析纯,尽量使用色谱纯试剂。流动相所用的水最好是超纯水或全玻璃器皿双蒸水。用前先用0.45um溶剂微孔过滤(器)过滤,除去可能存在的微粒。流动相建议现用现配,对于含盐的溶液尤其注意长臵会产生细菌或出现沉淀。此外还得保证储存流动相的容器清洁。 复杂样品可选用0.45um溶剂微孔过滤(器)或样品预处理柱对样品进行预处理,确保样品中不含微粒杂质。若样品不便处理,要使用保护柱。 柱内填料污染时,可将柱头螺丝卸下,用专用工具挖出柱内前段被污染填料,再以相同的填料重新填入,修复。或以能溶解污染物的流动相按色谱柱使用的相反方向,冲洗色谱柱(约20至30倍柱体积,或视具体情况而定;另外,此时不能接检测器),将污染物冲出色谱柱,再按色谱柱标明的使用方向使用。 [柱进口处有异物] 当断定是柱进口处有异物时,可将柱头螺丝卸下,取出滤帽并将其臵于20%硝酸溶液中,用超声波清洗约20分钟,再臵于超纯水中,并用超声波清洗约10分钟,重新装入色谱柱内即可。 [样品浓度过高致使柱超载] 样品在柱上超载能引起峰展宽,拖尾(或伸舌)。 适当减小进样量或样品浓度(需要时,可提高检测器灵敏度)直至峰形和保留时间不再改变,便可消除这种不良影响。减小进样量还能改善其分离度。正常情况下,样品中每种化合物在150×4.6mm柱中进样量保持在3~50ug范围内,不会引起明显超载。 [样品溶剂不对] 选择合适的样品溶剂,以排除不必要的干扰。最好选用流动相溶解样品。 [柱外效应] 柱外效应(即进样阀、色谱柱及检测器间的管路过长、直径过粗、管路接头不匹配、有死体积)是影响色谱柱柱效的主要因素之一。所以在可能的条件下,色谱柱的两端连接管路要尽可能短,连接管内径尽可能细小,切口务必平整光滑,尽可能的减小死体积,以防止因样品扩散造成不能反映色谱柱真实柱效等情况发生。 [缓冲不足或不合适] 在缓冲不好或离子强度过低的分离中,也会出现保留时间重现性差和峰形拖尾。增加缓冲浓度(与样品大小相匹配)能改善此情况。 [硅醇基团作用] 仔细分析色谱柱内填料表面性质可知:反相色谱柱填料的表面大约被键合相覆盖了一半,其余的就是未被键合的硅醇基团。所谓的保留是指样品分子与键合相相互作用的结果。但是,酸性或碱性化合物与硅胶表面残存的硅醇基团或金属杂质之间相互作用而引起双重保留机理,因此,发生了峰形拖尾。

反相高效液相色谱法

反相高效液相色谱法 鬼针草为菊科植物鬼针草属多种植物的全草,药材资源丰富,广泛分 布于热带及温带地区,遍布全国各地,极易采集。根据文献报道,鬼 针草属多种植物含有槲皮素成分[1];槲皮素具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、镇痛、抗血小板聚集、扩张冠状动脉等作用[2~4]。《中国药典》尚未收载鬼针草药材的质量标准。《贵州中药材标准》 收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.、鬼针草BidensbipinataLinn.的干 燥全草,《湖南中药材标准》收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.的干燥 地上部分,《甘肃中药材标准》1995年收载鬼针草BidensbipinataLinn.,《广西中药材标准》1990年收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.、白花鬼针草BidenspoilsaL.var.radiataSch.-Bip. 的干燥全草,河南中药材标准1991年收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.、鬼针草BidensbipinataLinn.、金盏银盘 Bidensbiternata(Lour.)Merr.EtSherff.的干燥全草,《上海中药材 标准》收载鬼针草BidensbipinataLinn.(婆婆针)的干燥地上部分[5]。从国内地方标准收载情况能够看出全国各地均有广泛的应用, 入药部位为全草或地上部分,本实验拟采用RP-HPLC法建立鬼针草属 药材中槲皮素的含量测定方法并比较鬼针草不同药用部位和不同种中 槲皮素的含量,为该类药材的传统入药部位是否准确和质量评价提供 参考依据。 1仪器与材料 美国waters2695高效液相色谱仪,VWD检测器;鬼针草采自云南红河州、广西,经刘圆副教授和戴斌教授鉴定为菊科鬼针草属植物狼杷草BidenstriparticaLinn.,白花鬼针草 BidenspilosaL.var.ratiataSch-Bip.,婆婆针BidensbipinataLinn.,三叶鬼针草BidenspilosaLinn.的干燥全草;槲皮素(批号081-9304,中国药品生物制品检定所,含量测定用);甲醇为色谱纯;水为二次 重蒸水;其余试剂均为分析纯。

色谱峰拖尾的原因

液相色谱峰有拖尾现象是什么原因 A、峰拖尾 1、筛板阻塞(a、反冲色谱柱b、更换进口筛板c、更换色谱柱) 2、色谱柱塌陷(填充色谱柱) 3、干扰峰(a、使用更长的色谱柱b、改变流动相或更换色谱柱) 4、流动相PH选择错误(调整PH值。对于碱性化合物,低PH值更有利于得到对称峰) 5、样品与填料表面的溶化点发生反应(a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂b、换柱子) B、峰前延 1、柱温低(升高柱温) 2、样品溶剂选择不恰当(使用流动相作为样品溶剂) 3、样品过载(降低样品含量) 4、色谱柱损坏(见A1、A2) C、峰分叉 1、保护柱或分析柱污染图(取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。) 2、样品溶剂不溶于流动相(改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。) D、峰变形 1、样品过载(减少样品载量)

E、早出的峰变形 1、样品溶剂选择不恰当(a、减少进样体积b、运用低极性样品溶剂) F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰 1、柱外效应(a、调整系统连接(使用更短、内径更小的管路)b、使用小体积的流通池) G、K’增加时,脱尾更严重 1、二级保留效应,反相模式(a、加入三乙胺(或碱性样品)b、加入乙酸(或酸性样品)c、加入盐或缓冲剂(或离子化样品)d、更换一支柱子) 2、二级保留效应,正相模式(a、加入三乙胺(或碱性样品)b、加入乙酸(或酸性样品)c、加入水(或多官能团化合物)d、试用另一种方法) 3、二级保留效应,离子对(加入三乙胺(或碱性样品)) H、酸性或碱性化合物的峰拖尾 1、缓冲不合适(a、使用浓度50-100mM的缓冲液b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液) I、额外的峰 1、样品中有其他组份(正常) 2、前一次进样的洗脱峰(a、增加运行时间或梯度斜率b、提高流速) 3、空位或鬼峰(a、检查流动相是否纯净b、使用流动相作为样品溶剂 c、减少进样体积) J、保留时间波动

反相高效液相色谱法测定化妆品中的24种防腐剂

反相高效液相色谱法测定化妆品中的24种防腐剂 建立了同时检测化妆品中24种防腐剂含量的反相高效液相色谱法(RP2HPLC)。采用KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,以磷酸盐缓冲溶液(pH=4.26)为流动相,梯度洗脱。样品经甲醇超声提取,然后采用RP2HPLC2二极管阵列检测法测定,对样品前处理和色谱条件进行研究和优化。 1引言化妆品中的防腐剂是为了使化妆品在生产、使用和保存过程中免受微生物污染的一类化妆品添加剂。但大多数防腐剂对人的皮肤会产生不同程度的刺激。因此,化妆品中防腐剂的用量必须以安全性作为前提。我国《化妆品卫生规范》对化妆品中防腐剂的使用浓度和范围做了相关的规定。目前,国内外对化妆品中防腐剂的测定一般多采用高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱质谱法、胶束电动色谱法、毛细管电泳法和伏安法等,而同时测定的防腐剂一般仅为4~8种,最多可同时测定18种,采用的方法均为气相色谱-质谱法。 本实验研究了化妆品中的24种常用防腐剂的样品前处理方法和HPLC分离条件,建立了化妆品中24种常用防腐剂同时检测的HPLC法。结果表明,本方法简便、快速、准确,应用于实际化妆品中防腐剂的测定,结果满意。 2实验部分2.1仪器与试剂高效液相色谱仪(美国Agilent1100系列),由四元低压泵、柱温箱、二极管阵列检测器及自动进样器组成;KQ-600型超声波清洗仪器(昆山市超声仪器有限公司)。 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、水杨酸、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、苯甲醇、苯氧基乙醇、4-氯-3-甲苯酚、三氯生及三氯卡班(Sigma公司);苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸苯酯及溴硝丙醇(AcrosOrgnics公司);2,4-二氯-3,5-二甲酚、对羟基苯甲酸异丙酯、2-苯酚、4-氯-3,5-二甲酚、对羟基苯甲酸异丁酯及2-苄基-4-氯酚(东京化成工业株式会社);苯甲酸、山梨酸(国家标准物质中心)。乙腈为色谱纯,甲醇为优级纯;无水乙醇、四氢呋喃等试剂均为国产分析纯;Millipore超纯水。 2.2标准品混合溶液和供试品溶液的制备分别准确称取一定量的24种防腐剂标准品,用甲醇溶液定容,配制成2g/L的标准储备液。分别移取一定体积的上述标准储备液至100mL 容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配成混合标准储备液。准确称取化妆品0.2g(精确到0.001g)于50mL锥形瓶中,加入10mL甲醇,超声提取30min,取部分溶液放入离心管中,在离心机上以5000r/min高速离心10min后,取上清液经0.22μm滤膜过滤,滤液供RP-HPLC检测。 2.3色谱条件色谱柱:伊利特KromasilC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:A.甲醇,B.0.025mol/LNaH2PO4溶液,pH4.26。线性梯度洗脱条件见表1。流速:1.0mL/min;柱温:25℃;检测波长:程序可变波长扫描;进样量:10μL。 3结果与讨论3.1流动相的选择3.1.1缓冲溶液pH的选择在24种防腐剂中,受pH影响的只有苯甲酸、山梨酸和水杨酸。因此,着重考察了不同pH值(2.5~5.5)对以上3种酸分离情况的影响。发现在pH4.26时,苯甲酸、山梨酸和水杨酸能与溴硝丙醇、苯甲醇、苯氧基乙醇和对羟基苯甲酸甲酯达到很好的分离,峰形良好。 3.1.2NaH2PO4浓度的选择在考察了0.01、0.025和0.05mol/LNaH2PO4溶液对分离的影响后,发现0.025mol/LNaH2PO4可达到较好的分离,且峰形良好。 3.2检测波长的选择通过全波长扫描可得到24种物质各自的吸收图谱。综合各物质在不同波长下的响应值和不同波长对基线的影响,最终确定采用程序可变波长进行扫描,即根据不同组分的出峰顺序,在不同时间段,分别用各组分的最佳吸收波长进行检测,从而提高检测的灵敏度,达到最佳的扫描效果。

改善反向液相色谱峰拖尾的方法

改善反相HPLC中的峰拖尾 分离碱性化合物、通过HPLC分析药物成分时是经常产生拖尾 峰拖尾可以引起分离度降低、灵敏度减弱、精密度和定量变差。(峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相关;准确度和精密度因数据系统无法准确识别峰的起点和终点而受到影响) 峰拖尾原因及解决方案 引起的拖尾 现象: 1、先流出的峰的拖尾较后流出的峰拖尾严重; 2、进样量减少或样品经流动相稀释后进样峰拖尾情况减轻。 二、由样品量(进样量超过柱子容量)过载引起的峰拖尾 现象: 1、样品峰呈现直角三角形,当更多的样品量注入时,峰前端变尖、后端拖尾更严重。 2、色谱柱过载后,保留时间随样品量的增加而提前。(见图3) 表 进样量、进样量的范围

因为实际进样量依赖于柱子的填料(具有高的表面积的填充材料可以具有大的进样量),分析物质(分子量大的进样量要少),和其他的因素比如样品在流动相中的溶解性。 图3 样品量过载引起的拖尾 表3 反相HPLC常用缓冲液 三、固定相中的硅醇基与胺类相互作用引起的拖尾 原因:带正电荷的溶液(胺类)与固定相颗粒表面上的酸性硅醇发生了离子交换,引起二次保留(图 4),常见于固定相具有显著的硅醇活性的的色谱柱,中性pH(6~8)条件下比酸性pH(<3)更易发生。酸性和中性的化合物一般不受影响,一些碱性化合物更易受到此效应的影响。 解决: 1、确认流动相中有合适的缓冲盐,可能的话尽量在pH<3的条件下操作(使硅胶固定相上的硅醇基质子化,减少溶质与硅醇反应的几率)。使用足够的缓冲液控制pH并减少离子交换效应。 在pH<3的条件下操作,可减少由图4 相互作用引起的峰拖尾,原理: 固定相表面的酸性硅醇基可以形成与碱性化合物反应的离子交换位点,经反相HPLC分离胺类化合物时,这种离子交换反应常常引起峰的保留(二次保留)和峰拖尾。 2、在流动相中加入竞争性的胺类,如:在流动相中加入三乙胺(TEA)(多数情况下,约10mM即可)。TEA可以与硅醇发生强的反应,并抑制样品中的胺类与硅醇反应。 如图5:向流动相中加入TEA用来提高峰形 1.苯丙醇胺 2.麻黄碱 3.苯丙胺 4.甲基苯丙 胺5. 苯三胺 色谱柱:Eclipse XDB-C8,4.6*150mm 流动相:85%25mMNa2HPO4,pH7.0,

改善反向液相色谱峰拖尾的方法修订稿

改善反向液相色谱峰拖 尾的方法 内部编号:(YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128)

分离碱性化合物、通过HPLC分析药物成分时是经常产生拖尾 峰拖尾可以引起分离度降低、灵敏度减弱、精密度和定量变差。(峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相关;准确度和精密度因数据系统无法准确识别峰的起点和终点而受到影响) 峰拖尾原因及解决方案

图3 样品量过载引起的拖尾 表3 反相HPLC常用缓冲液 三、固定相中的硅醇基与胺类相互作用引起的拖尾 原因:带正电荷的溶液(胺类)与固定相颗粒表面上的酸性硅醇发生了离子交换,引起二次保留(图 4),常见于固定相具有显着的硅醇活性的的色谱柱,中性pH(6~8)条件下比酸性pH(<3)更易发生。酸性和中性的化合物一般不受影响,一些碱性化合物更易受到此效应的影响。 解决: 1、确认流动相中有合适的缓冲盐,可能的话尽量在pH<3的条件下操作(使硅胶固定相上的硅醇基质子化,减少溶质与硅醇反应的几率)。使用足够的缓冲液控制pH并减少离子交换效应。 在pH<3的条件下操作,可减少由 图4相互作用引起的峰拖尾,原 理: 固定相表面的酸性硅醇基可以形成与碱性化合物反应的离子交换位点,经反相HPLC分离胺类化合物时,这种离子交换反应常常引起峰的保留(二次保留)和峰拖尾。 2、在流动相中加入竞争性的胺类,如:在流动相中加入三乙胺(TEA)(多数情况下,约10mM即

可)。TEA可以与硅醇发生强的反应,并抑制样品中的胺类与硅醇反应。 如图5:向流动相中加入TEA用来提高峰形 1.苯丙醇胺 2.麻黄碱 3.苯丙胺 4.甲基 苯丙胺5. 苯三胺 色谱柱:Eclipse XDB-C8, 4.6*150mm 流动相:85%25mMNa2HPO4, pH7.0,15%ACN 流速:1.0ml/min 温度:35℃ 样品:苯丙胺类 缺点:此法增加了分析方法复杂性并且改变色谱柱性质不易逆转。强度胺类(如三乙胺),不易从色谱柱上洗脱下来。既用过含有TEA的色谱柱就不再适合应用于流动相中不含TEA 的分析。 原理:三乙胺与硅醇强烈作用,减少了样品混合物中胺类与硅醇的作用,因此,使用三乙胺可以不用选择低硅醇活性的固定相。 反相HPLC色谱柱检测固定相硅醇活性的方法:根据阿米替林的对称性(峰拖尾),柱子对称性低则硅醇活性低。阿米替林在固定相中拖尾较低(对称值低),则固定相硅醇活性较低,并且检测碱性化合物时就会有较低的拖尾。图6根据测定阿米替林的对称性(即硅醇活性)排列了常用的C18反相色谱柱 色谱柱:4.6×150mm,5um 流动相:80%甲醇;20%0.05M磷酸盐缓冲液pH7 流速:2.0ml/min 温度:24℃ 样品:阿米替林 四、酸性化合物在硅胶上吸附引起的拖尾 原因:硅胶固定相的吸附。 解决:提高流动相中盐的浓度来抑制二次反应,降低流动相的pH使硅醇

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