SSR分析程序—非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

SSR分析程序—非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

1．准备DNA样品，将浓度调整至40-60ng/μL;

2．PCR扩增体系(反应体系总体积：10μL)

试剂μL/tube 终含量

ddH2O 5.15

10 x PCR buffer 1 1x

MgCl(25mM) 0.8 2mM

dNTP(8mM/4个) 1 0.2mM/个

Primers(5μM/2个) 1 250nM/个

Taq 酶(5U/μL) 0.05 0.25U/10μL

模板DNA 1 40-100ng/10μL

(注：SSR的引物包括两个：Forward Primer 和Reverse Primer)

最后每个反应管中加30μL矿物油；此外，操作时，试剂等应放在冰上；

3.PCR扩增根据引物所要求的结合温度(TM=47℃、50℃、55℃、60℃)选择扩增程序；PCR 反应一般需要3hr左右;

①SSR分析中所应用的PCR反应程序(引物结合温度60℃)

File 15Time-delay95℃, 2min

16 Step-cycle5 cycle(94℃, 1min; 60℃, 1.5min; 72℃, 1min)

17 Step-cycle30 cycle(92℃, 30sec; 60℃, 50sec; 72℃, 30sec)

18 Time-delay72℃, 5min

19 Time-delay25℃, 1min

14 Soak-file4℃, 24hrs

②SSR分析中所应用的PCR反应程序(引物结合温度55℃)

File 21 Time-delay95℃, 2min

22 Step-cycle5 cycle(94℃, 1min; 55℃, 1.5min; 72℃, 1min)

23 Step-cycle 30 cycle(92℃, 30sec; 55℃, 50sec; 72℃, 30sec)

24 Time-delay72℃, 5min

25 Time-delay25℃, 1min

14 Soak-file4℃, 24hrs

③SSR分析中所应用的PCR反应程序(引物结合温度50℃)

File 26 Time-delay95℃, 2min

27 Step-cycle5 cycle(94℃, 1min; 50℃, 1.5min; 72℃, 1min)

28 Step-cycle30 cycle(92℃, 30sec; 50℃, 50sec; 72℃, 30sec)

29 Time-delay72℃, 5min

30 Time-delay25℃, 1min

14 Soak-file4℃, 24hrs

4聚丙烯酰胺凝胶制备

4.1 清洗玻璃板、灌胶用量筒和烧杯，玻璃板气干(制胶用玻璃板为硫化玻璃，灌胶面必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡；烧杯、量筒和玻璃板如果有水，由于胶与水不相溶，易使胶不能牢固粘在玻璃板上)；

4.2将平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撑物（瓶盖等）上，给玻璃板滴少量100%乙醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，气干；

4.3 平口玻璃板和凹口玻璃板的三个边均匀的涂抹适量凡士林（凡士林太多不容易清洗）；放上需要厚度的板条，此步应注意密封好板条的相接处，用手将三边和接茬处按牢固，否则容易漏胶；然后用夹子（夹子夹在板条中间）将玻璃板固定于灌胶架上；

4.4 配胶（8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis=37.5:1）、灌胶;

将以下母液按量混合均匀保存于4℃，一般一周内用完，

溶液 120ml 240ml

40%Acr 24ml 48ml

2%Bis 12.84ml 25.68ml

10XTBE(8.3) 12ml 24ml

ddH2O 70.8ml 141.6ml

10%APS （催化剂）和TEMED（加速剂），摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固；（注：1 聚丙烯酰胺凝胶在凝固以前有毒，凝固后无毒，因此操作时应戴上手套； 2 板条和梳子厚度必须一致，否则将在点样孔中产生胶膜，影响点样和最后电泳质量）

对于20cm x 17cm的玻璃板，除去板条尺寸，胶为16.5cm(宽) x 15.5cm(高) x 1mm(厚)，配制如下：

胶混合液10%APS TEMED

一板胶30ml 180μL 80μL

两板胶60ml 360μL 160μL

5电泳

5.1 在气门芯中放入金属线，弯成凹形，挂在电泳槽上，在气门芯上均匀涂抹适量凡士林，用来防止上槽缓冲液渗入下槽，往上下电泳槽先加入适量1 x TBE 电泳缓冲液，缓冲液可重复使用6-7次；

5.2 胶凝固后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），取出胶底端的板条，用纸擦净板条上的凡士林，并用板条刮净玻璃板底端内侧的凡士林（防止将玻璃板放入胶槽中的缓冲液时产生气泡），并用水稍微冲洗点样孔处，斜着将玻璃板放入电泳槽，避免胶底端与缓冲液相接处产生气泡，用夹子从上端将玻璃板固定于电泳槽上，再加入缓冲液，使上槽缓冲液至少盖住点样孔，下槽缓冲液至少与胶下边缘相平齐，然后用电泳缓冲液冲洗点样孔；5.3 向10μL PCR扩增样品中加入2μL的5x Loading dye（此步一般可在PCR扩增完成后进行，从而使溶液充分混合），每个样品点10-12μL；最后点Marker DNA;

5.4 恒压或恒流电泳，恒流，1板，50mA-60mA, 电压约300V; 2板，100-120mA, 电压约300-400V；但是应保持电压恒定，否则条带容易弯曲；

注：PCR扩增产物也可以进行琼脂糖凝胶（3%）电泳，用EB染色观察。

6银染显色

6.1 当第一染料接近胶底边缘，电泳结束，也可使第一染料跑出；关闭电泳仪，移去夹子，

取下玻璃板，将胶从玻璃板上小心取下，切去一角或两个角作为记号，以便于辨认，然后开始银染处理，处理均在摇床上进行，具体步骤如下：

10%醋酸(Fix/stop solution) 20分钟

纯水15分钟

0.2%硝酸银(染液) 30分钟

纯水10-20秒左右

显影液(Developer solution, 4-10℃) 显影适当

定影液(3%或10%醋酸，加几滴甘油) 5分钟

包胶

注：定影液——将胶在10%的醋酸中处理结束，可向醋酸中加入少许甘油(防止胶在干燥过程中发生胶裂)，摇匀，直接用作定影液；

银染中应注意事项：

①水的质量对染色效果影响极大，一般用超纯水或双蒸水，如果水含有污染物，胶可能不显影或仅仅显上部条带；而下部空白；

②显影液中碳酸钠的纯度也很重要，建议使用无水碳酸钠；

③由于温度过高，显影太快，所以为了便于控制显影过程，一般将显影液储存于4℃，用

时取出；显影液在4℃长期放置容易结晶，一般使用前1-2天配制即可，显影液配制方法如下：

试剂名称 500ml 1000ml 终浓度

Na

2CO

3

(无水碳酸钠) 50g 100g 100g/L

50mg/ml硫代硫酸钠 80μL 160μL 160μL/L

(Sodium thiosulfate)

甲醛(Formaldehyde) 1ml 2ml 2ml/L

（注：50mg/ml硫代硫酸钠溶液应于-20℃保存）

④在10%的定影液加入几滴甘油，可以用作最后的显影液；

⑤每一步都应该轻微摇动，一般在摇床上进行；

⑥银染后在无离子水中的冲洗时间要求十分严格，一般在10秒左右，应小于20秒，如

果超过20秒，应重新在0.2%的硝酸银重新染30分钟；

⑦ 0.2%的硝酸银溶液可以重复使用6-7次，每次适当延长银染时间，最后可以在废弃银

沉淀，过滤或重力沉淀即可以回收银；

液中加入NaCl，使银以AgCl

2

⑧因为不容易清洗，所以装硝酸银、显影液和固定液及定影液的盆不能混用；

⑨电泳结束后，涂抹凡士林的玻璃板、板条用热水浸泡后，用纸擦去凡士林，再清洗时比较容易洗净，或浸泡后用洗洁精清洗即可。

7 包胶

将包胶用的玻璃板洗净，玻璃纸提前泡在水中30-60分钟。包胶时，先在玻璃板上铺一张玻璃纸，赶净气泡，四边向下抹平；将胶放在玻璃纸上，再用另一张玻璃纸盖在胶上，赶净气泡，四边向下抹平，将玻璃板放在吸水纸上，在室温（25℃）或恒温箱中干燥（由于恒温箱透气性差，干燥过程慢），干燥好的胶可以用热钢锯条封四边；照相或干胶扫描。

附录：实验试剂的配制

1 2X loading dye(用于变性胶；98%甲酰胺，10mM EDTA，0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯青F F)

4

2 3X用于变性胶；95%甲酰胺，10mM NaOH，0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯青F F)

4℃保存

3 5 X用于非变性胶；100mM EDTA(pH=8.0)，10mM Tris-Hcl(pH=7.5)，5%聚蔗糖400，

4 40%丙烯酰胺（Acrlamide）4℃保存

似结晶状固体，比重较轻，溶解时不要加太多水。将80g丙烯酰胺溶解于100ml水中，微热充分溶解后，凉至RT，定容至200ml;

5 2% N、N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis- acrlamide or N、N’-Methylene Bis- acrlamide）4℃保存

此试剂为细粉末状固体，比重轻，有毒，称量时应戴防毒面具，以免吸入。

将2g N、N’-亚甲基丙烯酰胺溶解适量蒸馏水中，充分溶解后，定容至100ml;

6 10X TBE(pH=8.3) 电泳缓冲母液RT保存

Tris-base

硼酸(Boric acid)

Na2EDTA.2H2O 充分溶解，加4M HCL约30滴，定容500ml。

dd H2O

7 10% APS(Ammonium persulfate; 过硫酸铵) -20℃保存

容易溶解，一般每次配制少量即可，RT放置，短期内用完，-20℃长期保存亦不好。

将0.1g APS倒进1.5ml离心管中，加入1ml 蒸馏水，充分溶解，分装保存于-20℃或待用；

8 10%冰乙酸（Acetic acid）固定液，加少许甘油也可以用做定影液只用一次

100ml冰乙酸加900ml蒸馏水；

9 0.2%硝酸银（Silver nitrate）避光RT保存，可以使用5-6次，每次适当延长时间

2g硝酸银溶解于1000ml蒸馏水中；

10显影液（Developer）4℃保存；

试剂名称 500ml 1000ml终浓度

Na

2CO

3

50g 100g 100g/L

50mg/ml硫代硫酸钠 80μL 160μL 160μL/L

(Sodium thiosulfate)

甲醛(Formaldehyde) 1ml 2ml 2ml/L （注：50mg/ml硫代硫酸钠溶液应于-20℃保存）

以下试剂在变性胶时擦玻璃板用：

11 Gel Repel solution(保存于棕色瓶)

将1ml二甲基二氯硅烷（Dimethyl-diclorosilane; (CH3)2SiCl2, 此试剂保存于-20℃）溶解于100ml 100%乙醇；

12 Gel Bind solution 1(保存于棕色瓶)

硅烷

250μL或

methacryloxypropyltrimethoxysilane(C10H

(Sigama Cat No. M6514; 药品有毒)

13 Gel Bind solution 2(保存于棕色瓶)

将150μL硅烷和250μL 0.5%冰乙酸与50ml 95%乙醇混合均匀即可。