噬菌体展示载体的构建
噬菌体展示载体的构建
中国药科大学
JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2002,33(6):529,532529 噬菌体展示载体的构建
吴国球,沈子龙.
(中国药科大学生物技术中心,南京210009)
摘要目的构建适宜噬菌体展示的载体系统.方法利用pCOMB3的LacZ强启动子,Pelb引导序列,包
膜蛋白?基因,用NHeI—XbaI双酶切,切除一个克隆位点;同时设计一对引物,用PET一28(a)作模板扩增550bp片
段,插入XhoI—SpcI位点之间,扩增质粒后用限制性内切酶,PCR,DNA测序等方法作鉴定.结果切除了272bp
NHeI—XbaI片段,插入片段后酶切鉴定显示:XhoI,SpcI单酶切,XbaI,NheI无酶切;所构质粒用Xhol+SpcI双酶切
及PCR扩增均可见550bp片段;测序结果正确.结论成功构建了一种高拷贝,稳定,多用途,易于操作的噬菌体
展示载体.
关键词噬菌体展示;构建;载体
中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1000—5048(2002)06—0529—04 噬菌体展示文库在新药开发领域,尤其在全人
源化单克隆抗体方面为扩展生物多样性提供了强
大的研究工具[】].它能容纳超过上百万个单个分子
的克隆,因此又称全套基因库,可以通过受体与配
体,抗原与抗体相结合的特性,从中筛选出目的基
因克隆,使目的基因能在很短的时间内(数周)高效
克隆,筛选和表达[2].文库的大小是决定生物多样
性的关键.因此构建一种高拷贝,稳定,多用途,易于操作的载体具有十分重要的意义.
l材料和方法
1.1材料
pCOMBs质粒,XL1一blue菌株(东南大学基础医学院张建琼博士惠赠),PET一28(a)质粒,JM109菌株(本实验室保存),限制性内切酶NheI,XbaI,
SacI,SpeI,XhoI(Mm),T4连接酶,琼脂糖,EDTA, DNA回收试剂盒等(上海生
工),LB,SOC按常规方法配制,PCR仪(AmpGene4800),电泳仪(北京六一仪器厂).
引物:
P1:5'-GGGCCAACTCTAGTATGGCCC一3' 下划线为XhoI酶切位点
P2:5'-GG垒!垒!CTAACCAGCAC'ITCAGTGGGAA一3' 下划线为SpcI酶切位点Ck 连宝生物工程公司合成) 1.2方法
收稿日期2002—04—17通讯作者Tel:025—3271389 1.2.1pCOMB3的扩增含pCOMB3的XL1一blue 接种于四环素(50mg/L),氨苄青(100mg/L)双抗平板,37?过夜培养,挑单个菌落,接种l0ml的LB 液体增菌培养液,37~C6h,摇至ODeoo为0.36,按常规方法抽提质粒:按每毫升菌液l00lI液(50
mmol/LGlucose,25retool/LTris—HC1,l0retool/L EDTA),200l?液
(0.24mmol/LNaOHl00l, 5SDSl001),l50l?液(3mmol/LK.Ac,2.5 mmol/LHAc)混
匀,12000r/min5min,吸取上清
液,等体积酚:氯仿抽提一次,上清液加两倍体积的无水乙醇,4?放置
10min,12000r/min离心5min,
弃上清,沉淀挥干后,加无菌水20l,一20.C保存备用.
1.2.2片段切除及剩余片段的连接pCOMBsl0l, 加l0×buffer4l,去离子水
34l,NheI,XbaI各1.0 l,37?酶切2h,回收片段,20l水溶.取5l加l0× ligationll,去离子水3.5l,T4连接酶0.5l,16?连接过夜.
1.2.3感受态细胞制备及转化XL1一blue单菌落接种于100mlLB(含氨苄青100mg/L),37?摇至 OD600为0.4,8000r/min2min收集菌液,按每毫升菌液加
0.5mol/LCaCI2lOOgd,冰上放置30min,8000r/
min20min,弃上清,沉淀用相同浓度CaC1z悬浮菌液,lOOp1分装,加l0甘油,一70?保存.取连接液 5l,加入lOOpl感受态细胞,冰上放置30min,42?
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热激90s,加入预热SOClml,37?摇45min,涂布于四环素(50mg/L),氨苄青(100mg/L)双抗平板,同时设阴,阳性对照,37?过夜,随机挑选单菌落扩大培养,抽提质粒,分别用NheI,XbaI,SacI,SpeI,酶切检查,0.8琼脂糖l00v/50mA电泳
40rain,EB染色,观察结果.阳性质粒命名为Pa.
1.2.4插入片段的制备
1.2.4.1插入片段的扩增PET一28(a)质粒抽提后,取ll加
l0×buffer3l,P13~1(50pmo1),P2
3~1(50pmo1),Taq酶0.5l,dNTPll,加D2o至 30l,加一滴矿物油,94?变性5min 后执行94? 变性lmin,45?退火lmin,72?延伸lmin循环程序,25个循环后72?延伸10min,同时设阴,阳
性对照.PCR产物用1.2琼脂糖电泳检查,切下 550bp条带.每l00mg琼脂糖加400lBinding buffer,50?放置2min,转移至离心柱,8000r/min lmin,弃废液后加Washsolution450ml,8000r/
minlrain,弃废液,重复一次,12000r/min,开盖离心lmin,在柱中央加
20lD2O,12000r/min2rain,
一
20?保存.
1.2.4.2酶切取"1.2.3"酶切鉴定阳性质粒及
550bpPCR回收片段各l01分别加l0×buffer2 l,D207l,SpeIll,37?酶切
4h,65?20min
灭活;补加10×buffer2.3l,XhoIll37?继续酶
切4h,1.5琼脂糖电泳,按"1.2.4.1"方法回收相
应片段.
1.2.4.3连接及转化取回收片段各4l加T4
liga sell,l0×T4ligationll,16C连接过夜,全量
转化XL1一Blue感受态细胞,42?热激后涂布于氨苄,四环素双抗平板,37?过夜.挑单菌落接种于双抗LB,37.C6h,抽提质粒,1.5琼脂糖电泳检查. 1.2.5PCR及酶切位点检查取质粒ll,加引物
Pl,P2各3l,Taq酶0.5l,dNTPll,l0×buffer2l, 补加DzO至20l,l滴矿物油,按"1.2.4.1"PCR程序25个循环,1.2琼脂糖电泳观察结果.取PCR 阳性质粒5l,加入l0×bufferll,D2O3l,SpeIl
l,37?酶切4h,65?20min灭活;补加l0×buffer 1.1l,XhoIll37?继续酶切
4h,1.5琼脂糖电
泳,EB染色,观察结果.阳性质粒命名为Pa. 1.2.6载体测序测序引物为5一TTACTCGCTGCCCAACCAG一3',引物距XhoI位点
尚有20个碱基,采用ABIPRISM377DNA
2结果
1)第二个克隆位点的切除pCOMB3用NheI+
XbaI双酶切,可见272bp条带,切除上述片段后,将
剩余大片段回收自连后转化并抽提质粒,分别用
NheI,XbaI,Spel,XhoI酶切检查,结果显示:Xbal,
NheI无酶切,SpeI,hoI可见单酶切条带,酶切位点
正确(图1).
3800bp————一
272bp————一
I,2:Nhel,Xbalseparatelyanalysis;3,4:Spel,Xholseparately
analysis;5:Nhel+Xbalanalysis;6:pCOMB3;7:kphageDNA/Hind I+IKbDNAL~der.
Fig1.Restrictionenzymeanalysisofplasmid 2)片段插入PET一28(a)作模板PCR扩增后,
可见550bp条带,回收片段后与相同酶切的Pa载
体连接,转化后筛选阳性质粒,1.5琼脂糖电泳条
带出现在Pa之后.随机挑选l0个单菌落进行PCR
检查,其中9个出现550bp条带,阳性率90(图2).
SpeI+XhoI双酶切检查,可见550bp及3800bp条
带(图3).Pa质粒送生工测序,结果与预期序列一
致(测序结果略).
1,2,4,6,7,8,9:PCRproduct;3:negativeresult;5]kbMa~er
Fig2.PCRanalysisoftransformants
6期吴国球等:噬菌体展示载体的构建53l
3800bp——一
550bp一
1:XphageDNA/HindI/EcoR1;2:PCRproduct;3:pCOMB3;4:pa~;
5:Nhel+Xbalanalysisofpositiveplasmid(Pa+);6:PCRanalysisof positiveplasmid(Pa) Fig3.Restrictionenzymeanalysisofplasmid
3讨论
噬菌体表面呈现技术(Phagedisplagtechnology)
使制备全人源化单可隆抗体成为可能.1989年Huse 等口首次用噬菌体建立了
小鼠抗体片段的抗体文库,随后又有单链Fv(ScFv)E,Fab片段以及双功能抗体文库的报道.用于抗体表面呈现的噬菌体载体是体现这一技术的关键.目前使用的载体包括Lerner实验室以pBluescrip为背景构建了 pCBAK8,pCOMB3,pCOMB8,Chang,用PUC和PGC1 构建pTACP,Winter实验室以PUC119构建的 pCANTAB等载
体,pCOMB3[是许多实验室广泛采用的载体,它拷贝数高(>200拷贝/细胞),容易分离,带有Ap抗性基因用于筛选,目的基因表达在? 基因上游,用于融合及呈现;含有LacZ强启动子, Pelb引导序列,包膜蛋白Ill基因.重链基因克隆位点XhoI—SpeI,轻链基因克隆位点Xball—SacI.但我们在使用过程中发现,克隆基因频繁发生缺失,其原因可能因为此载体含有两个克隆位点,分别用于克隆重链和轻链基因,每个位点含有LacZ启动子,核酶结合位点及Pelb前导序列.限制酶分析显示,缺
失发生在两个克隆位点之间,此区域包含两个8lbp 的重复序列,即24—105bp和1037—1118bp之间,质粒在线性化变性后第一个克隆位点的重复序列与第2个克隆位点的重复序列发生退火,从而导制基因缺失.通过切除272bpNHeI—Xbal片段,即切除第 2个克隆位点及其81bp的重复序列,消除了相应的缺失.NheI(G.CTAGA)和XbaI(TCTAGA)是同尾
酶,因此用双酶切除272bp片段后,剩余片段可通
过T4连结酶自连.
另外,在操作过程中,我们还发现由于Spel—
XhoI之间仅相差40bp,因此在双酶切后,由于片段
大小无法用普通琼脂糖电泳检查酶切是否完全,是
单酶切还是双酶切,操作极为不便,因此插入550bp
片段,可大大简化酶切消化,克隆及电泳分离等
DNA操作步骤.由于切除了第2个克隆位点,因此构
建的载体宜用于单链抗体的克隆与表达.
本载体是丝状噬菌体的突变株,作为克隆载
体,噬菌体在转染细胞后能够自我复制并翻译出目
的蛋白,在用辅助噬菌体如VCSM13,M13K07共同
感染后,噬菌体能自我组装,形成新的噬菌体.Ill基
因是噬菌体的包膜蛋白基因,编码406个氨基酸,其
C端(P198一$406)镶嵌在噬菌体外壳上,N端(1一
P918)伸出噬菌体的表面特异性地吸附在雄性E.
coli的性菌毛上,当用目的基因代替N端时,伸出部
分带有目的蛋白,但失去了浸染雄性曰.coli的能力.
因此只有用辅助噬菌体超感染提供野生型?基因
分子,才能组装成具有另一轮浸染活力的噬菌体颗
粒,不用辅助噬菌体,就成了与表达质粒完全相同
的表达载体,因此称双相表达载体.
参考文献
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ConstructionofVectorforPhageDisplay
WUGuo-Qiu.SHENZi-Long
B/otechno/ogyCenterofChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,Chi na
ABSTRACTAIMToconstructethevectorforphagedisplay.METHODSByremovingaNheI-XbaIcloning
site,pCOMB3wasremainedtobealacZstrongpromoter,aPelBleadsequenceandac oatproteingene?.Inthe
meanwhile,550bpfragmentwhichwasamplifiedbydesignedtwoprimersandusing templetofPET一28(a)was
insertedintothesitesbetweenXholandSpelI.Thephagemidwasidentifiedbyth emethodsofrestrictiveenzyme
analysis,PCRandDNAsequencingaftermultiplied.RESULTSA272bpfragmentwas deletedbyNheI—XbaI;
Restrictiveenzymeanalysisshowedthattheplasmidwascutbymeansofsinglesi teofeitherX
hoIorSpeI;there
werenositesofXbaIorNheI;550bpfragmentwasamplifiedbyPCRusingtempletof construc
tedplasmid;DNA
sequencewasinaccordancewiththeexpectedsequence.CONCLUSIONAvectorwith chara
cteristicsofhighcopy
number,applicability,easeofmanipulationforphagedisplaywassuccessfull yconstruction.
KEYWORDSConstruction;Vector;Phagedisplay; ?
新成果?
我国在医药生物技术领域取得系列重大成果
在医药生物技术领域,我国已经步入了国际先进国家的行列,具备了一定的国际竞争能力.
目前我国在以下领域取得了重大成果:一批基因工程药物和疫苗正在从实验室研究向产业化转化,基
因工程制药产业已初具规模;人工血液代用品即将进入临床研究;体细胞克隆和遗传病的基因诊断技术达
到国际先进水平;B型血友病,恶性肿瘤,梗塞性外周血管等6个基因治疗方案已进入了临床疗效研究;纳
米技术开始应用于医药研究;肿瘤免疫治疗,抗血管治疗,组织工程,生物芯片和干细胞等技术上也取得了
一
系列突破和重要进展.
中国已经开发成功了21种基因工程药物和疫苗,世界上销售额排名前l0位的基因工程药物和疫苗,中
国已能生产8种.
专家指出,虽然中国医药生物技术发展速度较快,取得一些喜人成就,但也存在着一些不容忽视的问
题:中国生物制药企业研究与开发投入太少,使得研发能力很差;上下游技术脱节,成果转化率低等.专家
们建议,应发挥社会各方面投资新药的积极性,多渠道增加医药生物技术投入,包括部门和地方政府资金,
科技贷款,股票市场,海外基金等.同时还应积极培育风险资本市场,鼓励建立生物技术风险投资基金.
(中创网)
噬菌体的分类
病原微生物名词解释与解答题 噬菌体的分类:毒性噬菌体温和噬菌体 沙门菌肠热证胃肠炎败血症病 毒复制T：吸附穿入脱壳生物合成装配与释放 乙肝颗粒：大小球形颗粒管型颗粒 梅毒分期硬性下疳全身和皮肤黏膜出现梅毒疹皮肤黏膜溃疡性坏死和内脏器官肉芽肿样变（梅毒骝） 细菌的致病性物质:毒素（外神经毒素细胞毒素肠毒素内） 霍乱弧菌致病因子：霍乱肠毒素鞭毛菌毛及其他毒力因子内毒素 细胞壁保护细菌物质交换决定抗原性与致病性染色性药物敏感性有关 真菌培养基沙保弱(G 蛋白胨） 病毒培养法细胞培养鸡胚接种动物接种 AIDS性接触血源性母婴垂直 IMVIC：I吲哚M甲基红VP C枸橼酸盐 病毒自然条件入侵机体呼吸道消化道皮肤黏膜 病毒抗原变异类型抗原漂移抗原性转变 细菌生繁条件水碳源氮源无机盐生长因子（有些）温度：37℃ pH：7.2～7.6 气体：对O2要求(专性需氧菌、微需氧菌、兼专性厌氧菌）对CO2求： 5~10% CO2 渗透压 革兰染色初染媒染脱色复染将细菌涂片标本固定，初染加结晶紫，约一分钟，水洗。滴加碘液媒染，约一分钟，水洗，形成结晶紫—碘复合物，成深紫色。用95 ％酒精脱色，30 秒钟，用水冲净酒精。用稀释复红复染1 分钟，水洗。镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。 链球菌所致脓疾病：化脓性感染（淋巴管炎淋巴结炎蜂窝组织炎痈等局部皮肤和皮下组织感染）毒素性疾病（猩红热）超敏反应性疾病（风湿病急性肾小球肾炎）
狂犬病：管理传染源（捕杀野犬多犬预防接种对咬过人的猫犬隔离观察7·10发病处死取脑组织检查病毒抗原和內基小体）伤口处理和注射抗体（用3%·5%肥皂水0.1%苯扎溴铵或清水洗再用75%乙醇或碘酒注射高效价抗狂犬病毒血清于伤口周围与底部）预防接种（咬后和接触病毒危险的人及早接种疫苗） 真原核差异：无典型细胞结构核质无核膜核仁仅核糖体DNA RNA 细菌生长曲线分期定义将一定量的细菌接种于合适的培养基和T 过程有规律数目对数纵T横的曲线a迟缓期（最初准备代谢活跃V大储蓄E 中间代谢产物不繁殖1-4h 对数期（最快先短暂的加速期后对数期活细菌快增细菌形态染色性生理活性典型）稳定期（繁殖减慢死活相等活细菌保持稳定典型小改变代谢产物产生）衰退期（更慢死大于活典型大改变生理活动停滞出现衰退形菌体自溶） 内外毒素差异1（来源阳及部分阴分泌于菌体外或菌体自溶阴细胞壁裂解释放）2化学成分（蛋白质脂多糖）3稳定性（不稳定60死160 2-4h死）3抗原性（强产抗毒素经甲醛脱毒成类毒素4毒性作用强选择性毒害较弱引起发热休克DIC） 病毒感染类型隐性感染（无明显症状获得免疫力显性感染感染靶细胞大量增殖造成细胞结构域功能损伤急性感染持续性感染（慢性感染潜伏感染慢病毒感染） 微生物是存在于自然界的一群体形微小、结构简单、肉眼直接看不见，必须借助于光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物 消毒消除和杀灭物体上或环境中的病原微生物及其它有害因子，但不一定能杀死全部非病原微生物的方法 灭菌杀死物体上所有微生物的方法，包括杀死芽胞 无菌操作防治病原微生物进入人体或其他物品上的方法 热原质是细菌合成的一种注入人体或动物体内能引起发热反应的物质，产生它的dad是阴，其细胞壁的脂多糖是热原质 正常菌群正常下人动物体表及呼吸道消化道泌尿生殖道德微生物种类数量稳定与机体平衡 致病菌少数正常菌在条件下致病 病原菌：少数微生物引起人动植物具有致病性
第一章1-6噬菌体载体2
3、λ噬菌体载体的优缺点：?优点：包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比 质粒转化细菌的效率高。 ?缺点：λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。 ?用途：λ噬菌体载体比质粒载体能插入的DNA长得多，常用于构建cDNA文库或基因组文库。 第一章 分子克隆的工具酶和载体?第八节噬菌体载体 ?一、λ噬菌体 ?（一）λ噬菌体 ?（二）λ噬菌体载体的改造 ?（三）λ噬菌体载体举例 （三）λ噬菌体载体举例?Lambda gt10 ?Lambda gt11 ?EMBL3和EMBL4Lambda gt10 概述： ?Lambda gt10是一种插入载体。 ?在噬菌体阻遏基因cI 内有单一的EcoRⅠ克隆位点。用于插入小的cDNA片段(约6kb)，构建cDNA文库或基因文库。 ?该载体克隆效率很高。 ?在构建cDNA文库时，利用Oligo(dT)或随机引物合成的cDNA经过EcoRⅠadaptors或Linkers修饰后，就可以和λgt10连接起来。?克隆到λgt10的噬菌体，可用核酸探针进行筛选。 Lambda gt10map 宿主： ?建议用C600 and C600hf1作受体菌。 筛选： ?如果有外源DNA插入，cI基因失活，该噬 菌体进入裂解生长途径，在培养皿形成噬 菌斑。反之，若无插入，cI基因表达，噬 菌体进入溶原生长途径，不形成噬菌斑。 ?核酸探针杂交。
Insertional cloning ?Insertional cloning into the cI gene of the lambda -gt10 cDNA cloning vector (DNA inserts of ~1-5 kb) can be selected in hfl (high frequency of lysogeny ) mutant strains of E. coli. In hflA strains of E. coli, expression of the lambda cII gene is elevated, resulting in transcriptional induction of the lambda cI repressor gene which promotes lysogeny . Disruption of the lambda cI coding sequence by DNA insertion into the unique EcoRI site of the lambda gt10 cDNA cloning vector, blocks the lysogenic pathway leading to cell lysis and plaque formation. Lambda gt11 ?λgt 载体系列：是插入型载体。插入了大肠 杆菌β-半乳糖苷酶基因片段，可以表达外源cDNA 而形成β-半乳糖苷酶融合蛋白。?λgt18/19 、λgt20/21和λgt 22/23 是λgt 11的衍生载体。?重组体筛选： ?未重组的噬菌体载体转入lac -宿主后，在X-gal 平板上形成淡蓝色噬斑；而外源DNA 片段插入载体后，重组噬菌体形成无色噬斑，很容易辩别。 ?常常用免疫学方法对噬班或菌落进行筛选。 Lambda gt10 map Lambda gt11 map Lambda gt11 概述： ?Lambda gt11是一个克隆和表达载体。 ?用于小的插入（7.2 kb ）片断构建cDNA 文库或基因文库。 ?在其β-半乳糖苷酶翻译终止位点上游的LacZ 基因内，有单一的EcoR Ⅰ位点。 ?如果外源DNA 的阅读框与lacZ 吻合，即可表达融合蛋白。 ?在构建cDNA 文库时，利用Oligo (dT)或随机引物合成的cDNA 经过EcoR ⅠAdaptors 或Linkers 修饰后，可以和λgt11连接起来。 宿主： ?建议用Y1089(r-) and Y1090(r-)作受体菌。筛选： ?利用特异的抗体进行筛选。 EMBL3和EMBL4 ?EMBL3/4是由λ1059衍生的λ置换型载体。?是常用的基因组克隆载体，克隆的DNA 片 段大小为9-23kb 。 ?多克隆位点分别位于一个14 kb 填充片段的两侧。 ?两载体均在填充片段内含有red 及gam 基因，可由Spi 表现型筛选重组子。 ?除多克隆位点的顺序相反外，EMBL3和EMBL4的其余特征相同。
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体 吴乃虎 中国科学院遗传与发育生物学研究所
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体 一、单链噬菌体的一般生物学 1．单链噬菌体的优越性 2．M13噬菌体的生物学特性 二、M13克隆体系 1．M13克隆体系 2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理 3．M13载体系列的发展 4．M13载体系列的优点 三、噬菌体展示载体 1．噬菌体展示载体的构建原理 2．噬菌体展示载体 3．噬菌体表面展示文库 4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例 四、噬菌粒载体
1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒 3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体 一、单链噬菌体一般生物学 大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。 1．单链DNA phage的优越性 A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。 B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。 C．不受包装的限制。因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。 D．可容易地测出外源DNA的插入取向。 E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)： *1用作双脱氧链终止法进行DNA测序
*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针 *3利用寡核苷酸进行定点突变 2．M13 phage的生物学特性 A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如： ①基因组组织形式相同； ②病毒颗粒大小、形状相近； ③DNA同源性高达98%以上。 B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。 C．复制型双链DNA(RF DNA=Replication Form DNA) 感染过程：当感染的M13 phage颗粒穿过性须时，其外层主要 衣壳蛋白质脱落，M13 DNA及附着其上的Gene Ⅲ 蛋白进E.coli细胞内， ↓ 感染性单链DNA(正链DNA)在细菌胞内酶的作用 下转变为双链DNA，称复制型DNA。通过结构 进行几轮复制。
噬菌体载体word版
第三章噬菌体载体 一、填空题 1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是—-----------—；二是----------——。 2．第一个报道的全测序的单链DNA噬菌体是ФX174，DNA长5386个碱基对，共一个基因，为一环状DNA分子，基因组的最大特点是—----------—。 3．λ噬菌体的基因组DNA为———————kb，有——多个基因。在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按—-----—复制，成熟包装(晚期复制)则是按—--------—复制。它有一个复制起点，进行—-------—向复制。λ噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。其原因主要是在λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一个——个碱基组成的天然黏性末端。这种黏性末端可以自然成环。成环后的黏性末端部位就叫做——————位点。 4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为————kb，插入的外源片段最大不超过——————kb。 5．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是————和--------------—。 6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自——、COS位点序列来自—--------—，最大的克隆片段达到—----------—kb。 7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。从酶切点看，插入型为——个，取代型为——个。 8．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1)---------------——(2)——————————(3)—---------------------—。 9． M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1)————————(2)—-------------—， (3)———————————。 10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是—-----—，而来自噬菌体的主要结构是—-------------------—。 11．M13单链噬菌体基因2和基因4之间的IG区有三个最重要的功能，即(1)—————(2)—------------—(3)—-------------—。 12．野生型的M13有10个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是：——------------------和——-----------------。 13．以丸噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA的长度是不同的，前者为—----— kb，后者为————kb。
λ噬菌体载体
λ噬菌体载体 λ噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体。 是一种中等大小的温和噬菌体。迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因。 一．λ噬菌体的分子生物学概述 （1）λ噬菌体基因组的结构 在λ噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核劳酸组成的彼此完全互补的5′单链突出序列，即通常所说的粘性末端。注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5′-P和3′-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos 位点（略语cos，系英语cohesive-end site的缩写，即粘性末端位点之意）（如图）。 在环化的状态下，λ噬菌体DNA分子的长度为48 502碱基对。
（2）λ噬菌体DNA的复制 在λ噬菌体感染的早期，环形的λ DNA分子按θ形式从双向进行复制。到了感染的晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出了由一系列线性排列的人基因组oxA组成的长多连体分子。 （3）λ噬菌体DNA的整合与删除 λ噬菌体基因组的整合作用，是通过它的附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现的。整合作用需要int基因的表达，它是一种可逆的过程。的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。λ噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和bio基因的协同作用才能实现。 （4）λ噬菌体DNA的转录与转译 在溶菌周期，λ噬菌体DN A的转录是在三个时期，即早期、中期和晚期发生的。大体的情况是，早期基因转录确立起溶菌周期；中期基因转录的结果导致DNA进行复制和重组；晚期基因的转录最终使DNA被包装为成熟的噬菌体颗粒。 二．λ噬菌体载体的构建及其主要类型 （1）构建λ噬菌体载体的基本原理 构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。 按照这一基本原理构建的λ噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型： 一种是插入型载体（insertion vectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点(如图)。 另一种是替换型载体（rePlacement vectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的人 DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代。
第四节 单链丝状噬菌体载体
第四节单链丝状噬菌体载体 一、M13 噬菌体的生物学 1．M13 噬菌体的组成和结构 M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。 M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成（GenBank 注册号为 V00604）。基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ 和基因Ⅲ 以及基因Ⅱ 和基因Ⅳ 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。 M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ 和Ⅹ），形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ 和Ⅺ），结构蛋白（基因Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ 和Ⅸ）。所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。基因组 DNA 为正链，按基因Ⅱ 至基因Ⅳ 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。图 3-20 是 M13 噬菌体的遗传图谱。 M13 噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长 880nm ，直径 6-7nm 。噬菌体颗粒的核心由 2700 个基因Ⅷ 编码的结构蛋白呈管状排列而成（图 5-32），成熟的基因Ⅷ 的产物为由 50 个氨基酸残基组成的α螺旋蛋白。顶端由 5 个基因Ⅶ 和 5 个基因Ⅸ 产物组成，作用于间隔区中的包装信号。 5 个基因Ⅲ 蛋白和5 个基因Ⅵ 蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。图 3-21 是 M13 噬菌体结构模型。 2．M13 噬菌体的增殖 吸附是噬菌体感染的第一步， M13 噬菌体只感染具有性纤毛的菌株，携带 F 质粒的菌株可产生性纤毛。在吸附过程中，噬菌体的基因Ⅲ 蛋白与性纤毛发生作用。随后丝状噬菌体穿入到性纤毛，基因Ⅲ 蛋白与宿主的 TolQ 、TolR 和 TolA 蛋白发生作用，去除外壳蛋白，致使病毒 DNA 及附着于其上的基因Ⅲ 蛋白进入宿主菌体内。
第2章 基因克隆的载体——质粒和噬菌体
第2章基因克隆的载体——质粒和 噬菌体 载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 一、载体的功能： 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件 二、载体应具备的条件： 1.具有对受体细胞的可转移性 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3.长度尽可能小，以提高其载装能力 4.具有多种单一的酶切位点 5.具有合适的选择性标记 附图： 图 3-1 自主复制型载体和附加载体的扩增方式 2.1 质粒 质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA），并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。分子量在1-200kb之间。
一、质粒的基本特性： （一）自主复制性 质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群。 （二）不相容性 利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。 （三）可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。pMB1或ColEI 类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。 但另外两种质粒（psc101和p15A）和的复制子的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。 （四）可转移性 在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。 二、质粒的构建 （一）天然存在的两种质粒 （1）colE1宿主细菌大肠杆菌6.5kb松弛型复制20-30/cell。 （2）pSC101宿主细菌沙门氏菌8.8kb严谨型复制5copy/cell标记基因为Tcr质粒的命名 p小写代表质粒；后面有两至三个大写字母代表发现者或构建者的姓名。
λDNA+噬菌体载体
λDNA λDNA,就是λ噬菌体中的DNA，但是λDNA也分很多种情况的，有正常的，有突变的，还有整合了宿主染色体的。 λDNA是一种溶原性的染色体序列，可以整合到宿主的染色体组上，也可以脱离下来，他的整合和脱离所产生的失误可产生宿主的基因重组现象，所以可以用于局限转导，是一种基因转化的载体。 柯斯质粒载体 目录 一.柯斯质粒载体的来源 二．柯斯质粒载体的特点 三．柯斯克隆 四．柯斯克隆的优点 一.柯斯质粒载体的来源 1978年由collins和hohn改建的一种新型大肠杆菌克隆载体，用正常的质粒与噬菌体λ的cos位点构成。“cosmld”一词是由英文“cos site-carrying plasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒。 所谓柯斯质粒，乃是一类由人工构建的含有λ DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。诸如右图所示的柯斯质粒载体pHC79，就是由λ DNΑ片段和pBR322质粒DNA联合组成的。一般长度4~6kb。含有Amp和Tet选择标记基因。其上的cos位点可识别噬菌体外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度上相当于噬菌体的基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒载体的外源DNA片段的长度可大于40kb，从而大大增加了载体的携带能力。
二．柯斯质粒载体的特点 柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面： 第一，具有λ噬菌体的特性。柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。 第二，具有质粒载体的持性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此在寄主细胞内能够像质粒DNA一样进行复制，并且在氯霉素作用下，同样也会获得进一步的扩增。此外，柯斯质粒载体通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重组体分子表型选择标记。 第三，具有高容量的克隆能力。柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和COS位点等三个组成部分，其分子量较小，一般只有5～7kb左右。因此，柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右。 第四，具有与同源序列的质粒进行重组的能力。一旦柯斯质粒与一种带有同源序列的质粒共存在同一个寄主细胞当中时，它们之间便会形成共合体。 三．柯斯克隆 应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做“柯斯克隆”（cosmid cloning）。 这种技术的理论依据是，在线性λ噬菌体DNΑ分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端（cos位点）。在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系（site-specific cutting system），叫做末端酶（terminase）或Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。只有在被作用的λDNA分子具有两个cos位点，而且它们之间的距离保持在38～54kb的条件下，Ter体系才能对它们发生作用。 应用柯斯质粒作载体进行基因克隆的一般程序是：将外源DNA片段与柯斯质粒线性DNA分子进行体外连接反应。由此形成的连接产物群体中，有一定比例的分子是两端各有一个cos位点的长度为40kb左右的真核DNA片段，而且这两个cos位点在取向上是一样的，可作为λ噬菌体Ter功能的一种适用底物。当加入λ噬菌体的包装连接物时，它能把这些分子包装进λ噬菌体的头部，可以用来感染大肠杆菌四．柯斯克隆的优点 柯斯克隆技术的优点主要有两方面： 首先，由于柯斯载体兼具了质粒和λ噬菌体两方面的特性，提高了克隆外源DNA 片段的能力，可达45kb左右，因此对于构建真核生物基因文库是一种特别有用的克隆载体； 其次，应用柯斯质粒作克隆载体，所形成的非重组体的克隆本底比较低，从而提高了筛选具外源DNA的重组体质粒的几率。
噬菌体展示载体的构建
噬菌体展示载体的构建 中国药科大学 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2002,33(6):529,532529 噬菌体展示载体的构建 吴国球,沈子龙. (中国药科大学生物技术中心,南京210009) 摘要目的构建适宜噬菌体展示的载体系统.方法利用pCOMB3的LacZ强启动子,Pelb引导序列,包 膜蛋白?基因,用NHeI—XbaI双酶切,切除一个克隆位点;同时设计一对引物,用PET一28(a)作模板扩增550bp片 段,插入XhoI—SpcI位点之间,扩增质粒后用限制性内切酶,PCR,DNA测序等方法作鉴定.结果切除了272bp NHeI—XbaI片段,插入片段后酶切鉴定显示:XhoI,SpcI单酶切,XbaI,NheI无酶切;所构质粒用Xhol+SpcI双酶切 及PCR扩增均可见550bp片段;测序结果正确.结论成功构建了一种高拷贝,稳定,多用途,易于操作的噬菌体 展示载体. 关键词噬菌体展示;构建;载体 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1000—5048(2002)06—0529—04 噬菌体展示文库在新药开发领域,尤其在全人 源化单克隆抗体方面为扩展生物多样性提供了强 大的研究工具[】].它能容纳超过上百万个单个分子 的克隆,因此又称全套基因库,可以通过受体与配
体,抗原与抗体相结合的特性,从中筛选出目的基 因克隆,使目的基因能在很短的时间内(数周)高效 克隆,筛选和表达[2].文库的大小是决定生物多样 性的关键.因此构建一种高拷贝,稳定,多用途,易于操作的载体具有十分重要的意义. l材料和方法 1.1材料 pCOMBs质粒,XL1一blue菌株(东南大学基础医学院张建琼博士惠赠),PET一28(a)质粒,JM109菌株(本实验室保存),限制性内切酶NheI,XbaI, SacI,SpeI,XhoI(Mm),T4连接酶,琼脂糖,EDTA, DNA回收试剂盒等(上海生 工),LB,SOC按常规方法配制,PCR仪(AmpGene4800),电泳仪(北京六一仪器厂). 引物: P1:5'-GGGCCAACTCTAGTATGGCCC一3' 下划线为XhoI酶切位点 P2:5'-GG垒!垒!CTAACCAGCAC'ITCAGTGGGAA一3' 下划线为SpcI酶切位点Ck 连宝生物工程公司合成) 1.2方法 收稿日期2002—04—17通讯作者Tel:025—3271389 1.2.1pCOMB3的扩增含pCOMB3的XL1一blue 接种于四环素(50mg/L),氨苄青(100mg/L)双抗平板,37?过夜培养,挑单个菌落,接种l0ml的LB 液体增菌培养液,37~C6h,摇至ODeoo为0.36,按常规方法抽提质粒:按每毫升菌液l00lI液(50 mmol/LGlucose,25retool/LTris—HC1,l0retool/L EDTA),200l?液 (0.24mmol/LNaOHl00l, 5SDSl001),l50l?液(3mmol/LK.Ac,2.5 mmol/LHAc)混 匀,12000r/min5min,吸取上清 液,等体积酚:氯仿抽提一次,上清液加两倍体积的无水乙醇,4?放置 10min,12000r/min离心5min,
基因工程 考试 重点 噬菌体载体
第二章 DNA重组克隆的单元操作 练习题 噬菌体载体(练习题) 一、填空题 1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。2．第一个报道的全测序的单链DNA 噬菌体是φX174，DNA 长5386 个碱基对，共个基因，为一环状DNA 分子，基因组的最大特点是。 3．λ噬菌体的基因组DNA 为kb，有多个基因。在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按复制，成熟包装(晚期复制)则是按复制。它有一个复制起点，进行向复制。λ噬菌体的DNA 既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。其原因主要是在λ噬菌体线性DNA 分子的两端各有一个个碱基组成的天然黏性末端。这种黏性末端可以自然成环。成环后的黏性末端部位就叫做位点。4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为kb，插入的外源片段最大不超过kb。 5．野生型的M13 不适合用作基因工程载体，主要原因是和。 6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS 位点序列来 自，最大的克隆片段达到kb。 7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。从酶切点看，插入型为个，取代型为个。 8．野生型的丸噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。9．M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1) (2) (3) 。10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA 共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 11 ．M13 单链噬菌体基因2 和基因4 之间的IG 区有三个最重要的功能，即(1) (2) (3) 。 12．野生型的M13 有10 个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是：和。 13．以λ噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA 的长度是不同的，前者为 kb，后者为kb。 14．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA 片段后，总的长度应在噬菌体基因组的的范围内。 二、判断题 1. 取代型载体(replacement vector)是指同一种限制性内切核酸酶在),DNA 中具有两个切 点，外源DNA 通过取代这两个切点间的片段被克隆。 2. 现在最常用的pUC 载体是pUCl8,它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制。另外，这种载体可在辅助质粒的帮助下合成单链DNA。 3. 噬菌粒(phagemid)pUCll8／pUCll9 载体是集质粒和丝状噬菌体有利特征于一身的载体，既能合成单链DNA,又能合成双链DNA。 4. λ噬菌体DNA 和M13 单链噬菌体DNA 在成熟前的DNA 复制都是用滚环模型。 5. M13 噬菌体每个世代裂解宿主后，可释放100 个子代噬菌体。 6. 以黏粒为载体的重组体虽然在平板上生长的速度不同，但是转化子中插入片段的扩增量
载体练习题
一、单选题 1.下列关于质粒的叙述正确的是（） A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种细胞器 B.质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA C.质粒只有侵入宿主细胞中才能复制 D.质粒都可以作为基因工程的载体 2.下列载体中装载量最大的是（） A.质粒 B.M13噬菌体 C. 噬菌体 D.考斯质粒 3.不属于质粒被选为基因载体的理由是（） A.能复制 B.有多个限制酶切点 C.具有标记基因 D.是环状DNA 4.下列哪项叙述不是载体必须具备的条件（） A.具有某些标记基因 B.决定宿主细胞的生存 C.能够在宿主细胞中复制 D.有一个或多个限制酶切点 5.下列哪项不是基因工程中经常使用的用来运载目的基因的载体（） A.细菌质粒 B.噬菌体 C.动植物病毒 D.细菌核区的DNA 6.科学家常选用的细菌质粒往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是（） A.便于与外源基因连接 B.检测目的基因是否导入受体细胞 C.增加质粒分子的相对分子质量 D.提高受体细胞的耐热性 7.在基因工程操作中，载体的本质是双链DNA分子，下列功能不能由载体完成的是( ) A.目的基因的转运 B.目的基因的扩增 C.目的基因的表达 D.目的基因的定位 8.基因工程中常见的载体是 ( )
A.质体 B.染色体 C.质粒 D.线粒体 9.下列说法正确的是（） A.DNA连接酶最初是从人体细胞中发现的 B.限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列 C.质粒是基因工程中唯一用作运载目的基因的运载体 D.利用载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程称为“克隆” 10.质粒与病毒的主要区别是（） ①质粒是很小的环状DNA分子；②质粒可以在大肠杆菌内复制；③质粒的基因能编码蛋白质；④质粒的存在不会影响宿主细胞的生存 A.①② B.①③④ C.①②③④ D.①④ 11.下列关于基因工程的叙述，正确的是（） A.基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因 B.细菌质粒是基因工程常用的载体 C.通常用一种限制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA，用另一种处理载体DNA D.为培育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为载体 12.在基因工程中，下列特征除哪项外，都是载体必须具备的条件（） A.能够在宿主细胞中复制，并稳定地保存 B.具有多个限制酶切点 C.必须是细菌的质粒或噬菌体 D.具有某些标记基因