测序技术回顾与第三代测序技术展望

测序技术回顾与第三代测序技术展望

摘要：DNA测序技术是分子生物学实验中的重要的实验手段。几十年来，测序技术发展飞快，本文简述了测序技术的发展历程，详述了以单分子测序和基因组光学图谱技术为代表的第三代测序技术。

关键词：DNA测序技术；单分子测序；基因组光学图谱技术

The sequencing technology review and the third-generation

sequencing future perspective

Abstract：DNA sequencing technology is one of most important experiment methods in molecular biology field. For several decades, sequencing technology has been developing quickly. In the paper, it briefly introduces the development process of sequencing technology, and recommends the single molecule sequencing technology and Optical mapping solutions in detail, which are the representatives of the third generation sequencing technology.

Key words：DNA sequencing;Single-molecule sequencing;Optical mapping solutions

1953年Watson和Crick揭示了DNA的双螺旋结构[1]，这大大激励了人们对DNA序列的探索。于是DNA测序技术应运而生，是现代分子生物学中重要的实验手段。DNA测序技术及伴随产生的基因操纵技术它极大地推动了生命科学的发展[2][3]。现介绍DNA测序技术的发展历史及第三代测序技术中两个代表性的技术单分子测序和基因组光学图谱技术。

一、DNA测序技术的发展历史

DNA测序技术迄今经历了三代的发展。DNA测序技术成熟于上世纪70年代中后期，随后的20多年第一代测序技术测出了不少简单的小型基因组。1990年提出人类基因组计划（Human Genome Project ,HGP），逐步诞生了高通量第二代测序技术。近年来，单分子等第三代测序技术开始出现，也预示着测序技术将应用更广，测序的成本越低[4][5]。

1.1第一代测序技术

1975年Sanger和Coulson发明了“Plus and Minus”（俗称“加减法”）测定DNA 序列[6]；1977年Maxam and Gilbert发明了化学降解法测序[7]；1977年Sanger引入ddNTP（双脱氧核苷三磷酸），发明了著名的双脱氧链终止法[8]。双脱氧链终止法有效控制了化学降解法中化学毒素和同位素的危害，在随后的二十多年得到

很好的应用。这些技术及在此基础上发展的相关技术统称为第一代测序技术。（Stephan C Schuster Next-generation sequencing transforms today’s biology）第一代测序技术在人类基因组计划中有了极大作用与发展[9]。

1.2 第二代测序技术

随着人类基因组计划的完成，人们开始进入后基因组时代（post-genomic era）。科学家逐步测出多种生物的序列，传统的测序技术已经无法满足高通量和高效率的大规模基因组测序，第二代DNA测序技术（next-generation sequencing）就诞生了[10]。第二代测序技术主要有Roche公司应用焦磷酸测序原理的454测序技术及454基础上的GS FLX、GS Junior测序平台[11]；Illumina公司应用合成测序原理的新一代Solexa Genome Analyzer测序平台，ABI公司使用连接技术的Solid 测序平台。第二代测序技术实现了高通量、高效率、高准确度的测序大大降低了测序的成本，DNA测序可以向个人测序发展。第二代测序技术很好应用于单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）的研究，对探索人类的遗传及基因病有极大的意义[9]。

1.3 第三代测序技术

然而在遗传学中，成千上万的基因组需要测出及分析，高通量的二代技术还是面临成本高、效率低、准确度不是很高等的难题，第三代测序技术已经开始崭露头角。第三代测序技术主要有Helicos公司开发的单分子测序、Complete Genomics公司对人类大型基因组研究中最新技术[12]、OpGen公司的Optical Mapping Solutions测序等。

二、单分子测序(Single-molecule sequencing)

单分子测序1989年被J. H. Jett等提出来的[13]。单分子测序在近些年来发展迅速，Timothy D. H.等使用了单分子测序的测序方法测定了M13病毒的基因组[14]，Doron Lipson等使用单分子测序的方法研究了Saccharomyces cerevisiae DBY746

的转录组[15]。Helicos公司开发了新型的单分子测序仪[16]。

2.1.单分子测序原理

Helicos公司单分子测序仪的技术原理是利用合成测序理论，将样本DNA数以百万的单链分子绑定在该仪器特有的、没有背景荧光的玻璃表面，通过加入荧光标记的核苷酸(一次加入4种核苷的1种)和聚合酶到单分子阵列中，核苷酸会结合到DNA分子上特异性结合的位点上。用激光激发结合在DNA分子上的荧光标记的核苷酸，使标记物发出荧光，相机以15ms速度快速扫描整个阵列，检测特异性结合到DNA片断上的荧光碱基。在此之后，结合的核苷酸对会被移动除去，然后，通过重复加入标记的核苷酸来重复这一过程[16]。

2.2单分子测序步骤

2.2.1单程单分子测序（single-pass sequencing）（见图1）

1 将DNA双链解开成单链，在3’端加上标记的多聚A尾(poly A tail)，再用末

端转移酶封闭3’端。

2 3’端与固定在仪器表面的基因组模板寡核苷酸的5’端以共价键的形式杂交。3通过所提取的基因组模板合成测序的位点。

4 在测序仪器玻璃表面加入被标记的碱基和DNA聚合酶的混合液，碱基自然

延长，使用647nm的荧光下对Cy5直接扫描成像。

5 使用化学方法对去除碱基中的染料标记。

6 加入新的标记的碱基和DNA聚合酶使反应继续循环下去。

图1：单程单分子测序

图2：双程单分子测序

2.2.2双程单分子测序（two-pass sequencing）（见图2）

在单程单分子测序中，DNA样品是与仪器玻璃表面的固定的寡核苷酸相杂交。DNA复制的时候，其共价连接的模板也同时复制，在模板的末端提供引物序列。这个引物序列用于合成法测序。一个测序反应后，合成链解开，一个新的引物杂交上去，进行第二次测序。

2.3 单分子测序的优势

单分子测序减少了试剂的使用，测序成本价格大大降低，使得人的基因组测序低于1000美元慢慢走向可能。此处Helicos公司还有一个优势，就是它不需要扩增建立DNA库，从而切断数据结果中潜在错误的来源。

三、基因组光学图谱系统(Optical Mapping Solutions)

Phil Latreille等利用光学图谱研究了X. nematophila基因组，完成了基因组的组装[17]。OpGen公司在近年开发了一种新型的光学图谱技术[18]。

3.1光学图谱技术原理[18]

这种光学图谱技术是一个利用单个DNA分子基因组限制性内切酶图谱快速生成高分辨率、有序的全基因组限制性内切酶图谱的方法。该技术提供了一种从纯菌株或混合样品中全面了解细菌、酵母或真菌的基因组结构的方法。这一技术方法的优势在于能够提供有序、高分辨率的多于100个限制性内切酶酶切位点/ 数MB的图谱，而不需要进行耗时和耗力的基因组测序。

3.2光学图谱技术的实验步骤[18]

1 提取DNA

从微生物细胞中提取高分子量的DNA(High molecular weight ,HMW DNA)。

将微生物细胞包埋在低熔点的琼脂糖中，用裂解液进行处理。再将裂解液完全洗净，在70℃下溶解琼脂糖，使用β-琼脂糖酶释放出HMW DNA。样品的预处理随微生物样品不同而异。

2 DNA固定与消化

基因组DNA以单分子的形式固定在带电的光学基质上，再使用限制性内切酶进行消化。将制备HMW DNA载入微流体光学芯片的阵列孔道中。基因组DNA 以单个DNA分子的形式固定在长的平行的阵列中，固定的DNA依然保持其原有的静电属性。DNA被限制性内切酶处理，切得的限制性酶片段按DNA原来的顺序保持不变。

3.染色与组装

将基因组DNA进行染色、扫描、计算、组装一系列工作，作出全基因组限制性内切酶酶切图谱。

消化的DNA使用荧光染料染色，再置于全自动的荧光显微观察仪采集数据。OpGen公司配套的图像分析软件测量每个DNA分子限制性内切酶片段的大小和顺序，光信号转化成数字信号生成单个DNA分子的限制性内切酶酶切位点图谱。通过DNA分子限制性内切酶酶切位点图谱相互重叠的部分拼接得到全基因组限制性内切酶酶切位点图谱——光学图谱。

4. 分析

应用OpGen的“MapSolver”光学图谱软件，可以比较不同的基因组的遗传变异，完成高分辨率的流行病学分析和加快基因组测序工作的完成。

3.3光学图谱技术的优点及应用

该技术拥有很大的优点：1.不用扩增；2.无需PCR反应；3.不需基因组抽提的试剂；4.不需末端配对的文库；5.不用具有序列信息；6.强大的分析软件基因组光学图谱技术在比较基因组学、流行病学、食品安全、菌种质量监控、全基因组序列拼接、菌株分型等有重要应用。

展望

随着HGP的实施与完成，DNA测序技术得到了飞跃的发展，在科技迅速发达的当今社会，新的测序技术提出的周期也越来越短。越来越多的生物全基因组的成功测序，也极大的推动了遗传学、免疫学、肿瘤学等的理论研究，也促进了基因组信息在临床医学中应用。测序技术发展的趋势就是不断发展，创造更为科学、廉价、更高效率的测序技术，使得其更好应用在临床应用中。但是随着个人基因图谱时代的来临，同样测序技术也面对很多挑战，比如隐私问题，基因图谱是个人的隐私，如何保证在治疗过程中被泄露或是被他人改变基因图带来很多的负面问题。伴随着测序技术的发展，整个社会的道德方面也要同时处理好才能使测序更好的造福人类。

参考文献

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[18]https://www.wendangku.net/doc/a310080907.html,

第三代测序技术的三种技术平台介绍

第三代测序技术的三种技术平台介绍 随着生物学的发展，人们对基因的功能研究更加透彻，为了进一步研究和改造基因的目的需要详细了解生物的基因组全序列，因为DNA序列是改造基因的基础，这就要求具有高效的DNA测序技术。DNA测序技术到目前为止已经发展到了第三代测序技术。 最早的Sanger测序在人类基因组计划中立下赫赫战功，但也给基因组测序贴上了数亿美元的价格标签，让人生畏。这两年发展迅猛的第二代测序仪——Illumina的Genome Analyzer、Roche 454的GS系列以及ABI的SOLiD系统——让人类基因组重测序的费用蹭地降低到10万美元以下。现在，能对单个DNA分子进行测序的第三代测序仪也加入到这场比赛中，让竞争更加激烈。 目前，第三代测序主要有三种技术平台。两种通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序。Helicos的遗传分析系统已上市，而Pacific Biosciences准备在明年推出单分子实时(SMRT)技术。第三种Oxford Nanopore的纳米孔(nanopore)测序还尚未有推出的时间表，但有可能是这三种当中最便宜的。纳米孔测序的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。 最近，Oxford Nanopore T echnologies的Hagan Bayley及他的研究小组正致力于改善纳米孔。根据他们之前的工作，他们以a-溶血素来设计纳米孔，并将环式糊精共价结合在孔的内侧(下图)。当核酸外切酶消化单链DNA后，单个碱基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用，并阻碍了穿过孔中的电流。每个碱基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅，因此很容易转化成DNA序列。每个碱基也有特有的平均停留时间，它的解离速率常数是电压依赖的，+180 mV的电位能确保碱基从孔的另一侧离开。

DNA测序技术的发展和其最新进展

DNA测序技术的发展及其最新进展 摘要：自从诺贝尔奖得主桑格于1977年发明了第一代DN测序技术以来，DNA测序技术已经作为重要的实验技术广泛的应用于现代生物学研究当中。经过了几十年的发展，DNA测序技术日臻成熟，并且以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经诞生。本文主要就每一代测序技术原理和特点及其最新进展做简要介绍。 关键词：DNA测序技术；第三代DNA测序技术；最新进展 The Development and New Progress of DNA Sequencing Technology Abstract: Since Nobel Prize Winner Sanger have founded the first generation of DNA Sequence technology in 1977, DNA sequencing technology has been widely used in modern biological researches as an important experimental. Over decades of year’s development, DNA sequence technology mature gradually and the third generation sequencing technologies characterized by single-molecule sequencing have also emerged. The mechanisms and features of each generation of sequencing technology and their latest progress will be discussed here. Key Words: DNA Sequence technology ; third generation DNA sequencing ;latest development 1.引言 DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术,它的出现极大地推动了生物学的发展。自从1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构后[1]，人类就开始了对DNA序列的探索，在世界各地掀起了DNA测序技术的热潮。1977年Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法[2]。同一时期,Sanger发明了双脱氧链终止法[3]。20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。最近几年发展起来的第二代DNA测序技术则使得DNA测序进入了高通量、低成本的时代。目前,基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现,该技术测定DNA序列更快,并有望进一步降低测序成本,推进相关领域生物学研究。本文主要介绍DNA测序技术的发展历史及不同发展阶段各种主要测序技术的特点，并针对目前新一代DNA测序技术及目前国际DNA测序最新进展做简要综述。

新一代测序技术的发展及应用前景

２０１０年第１０期杨晓玲等：新一代测序技术的发展及应用前景 等交叉学科的迅猛发展。 １．１第二代测序——高通量低成本齐头并进以高通量低成本为主要特征的第二代测序，不再需要大肠杆菌进行体内扩增，而是直接通过聚合酶或者连接酶进行体外合成测序¨】。根据其原理又可分为两类：聚合酶合成测序和连接酶合成测序。１．１．１聚合酶合成测序法Ｒｏｃｈｅ公司推出的４５４技术开辟了高通量测序的先河。该技术通量可达Ｓａｎｇｃｒ测序的几百倍，而成本却只有几十分之一，因此一经推出，便受到了国际上基因组学专家的广泛关注。４５４采用焦磷酸合成测序法ＨＪ，避免了传统测序进行荧光标记以及跑胶等繁琐步骤，同时利用乳胶系统对ＤＮＡ分子进行扩增，实现了大规模并行测序。截止到２０１０年４月，已有７００多篇文献是采用了４５４测序技术（ｈｔｔｐ：／／４５４．ｃｏｍ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｎｄ—ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｓｐ），对该技术是一个极大的肯定。 Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司推出的Ｓｏｌｅｘａ遗传分析仪是合成技术的进一步发展与延伸。该技术借助高密度的ＤＮＡ单分子阵列，使得测序成本和效率均有了较大改善。同时Ｓｏｌｅｘａ公司提出的可逆终止子”１也是该技术获得认可的原因之一。与４５４相比。Ｓｏｌｅｘａ拥有更高的通量，更低的成本。虽然片段长度较短仍是主要的技术瓶颈，但是对于已有基因组的物种来说，Ｓｏｌｅｘａ理所当然成为第二代测序技术的首选。２００８年以来，利用该技术开展的研究大幅度上升，报道文献达４００多篇（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｓｙｓｔｅｍｓ／ｇｅｎｏｍｅ—ａｎａｌｙｚｅｒ＿ｉｉｘ．ｉｌｍｎ）ｏ １．１．２连接酶合成测序法２００７年ＡＢＩ公司在Ｃｈｕｒｃｈ小组拍１研究成果的基础上推出了ＳＯＬＩＤ测序仪。该技术的创新之处在于双碱基编码…的应用，即每个碱基被阅读两次，因此大大减少了测序带来的错误率，同时可以方便的区分ＳＮＰ和测序错误。在测序过程中，仪器自动加入４种荧光标记的寡核苷酸探针，探针与引物发生连接反应，通过激发末端的荧光标记识别结合上的碱基类型。目前ＳＯＬＩＤ３．０测序通量可达２０Ｇ，而测序片段仅有３５—５０ｂｐ，这使得该技术与Ｓｏｌｅｘａ相比，应用范围还不够广泛。ＡＢＩ公司正加快研发进度，争取在片段长度方面做出重大突破。 ＤａｎａｈｅｒＭｏｔｉｏｎ公司推出Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ¨１测序仪同样也是基于Ｃｈｕｒｃｈ小组的研究成果，但是该设备的成本要低很多，同时用户在使用时可以根据自己的研究目的设置不同的测序条件。而ＣｏｍｐｌｅｔｅＧｅ—ｎｏｍｉｃｓ公司推出的ＤＮＡ纳米阵列与组合探针锚定连接测序法＂１则具有更高的容错能力，试剂的消耗也进一步减少，目前已顺利完成３个个体基因组的测序工作。 １．２第三代测序——单分子长片段有望实现第二代测序技术虽然在各方面都有了较大的突破，但是仍然建立在ＰＣＲ扩增的基础上。为了避免ＰＣＲ扩增带来的偏差，科学家目前正在研制对ＤＮＡ单个分子直接测序的第三代测序仪。最具代表性的包括Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ单分子测序仪，单分子实时合成测序法，纳米孔测序技术等。 Ｈｅｌｉｃｏｓ技术仍然是基于合成测序原理¨…，它采用了一种新的荧光类似物和灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了其他方法须同时测数千个相同基因片段以增加信号亮度的缺陷。ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｅｅｓ公司研发的单分子实时合成测序法充分利用了ＤＮＡ聚合酶的特性，可以形象的描述为通过显微镜实时观测ＤＮＡ聚合酶，并记录ＤＮＡ合成的整个过程。纳米孔测序技术［１１’１２１则是利用不同碱基在通过纳米小孔时引起的静电感应稍有不同，或者不同碱基通过小孔的能力各有差异，来加以区分不同的碱基信号。 ２应用与实践 Ｋａｈｖｅｊｉａｎ在２００８年的一篇综述中提到¨“：“如果你可以随心所欲地测序，你会开展哪些研究？”。人类基因组计划的完成和近年来高通量测序的兴起，使越来越多的科研工作者认识到，我们对于生物界的认识才刚刚起步。基因图谱的绘制并不意味着所有遗传密码的破解，癌症基因组的开展也没有解决所有的医学难题。ＤＮＡ变异的模式和进化机制，基因调控网络的结构和相互作用方式，复杂性状及疾病的分子遗传基础等，仍是困扰生物学家和医学家的难题，而高通量测序的广泛应用，也许可以让我们知道的更多。 ２．１ＤＮＡ水平的应用 ２．１．１全基因组测序新一代测序技术极大地推

一代、二代、三代测序技术

一代、二代、三代测序技术 (2014-01-22 10:42:13) 转载 第一代测序技术-Sanger链终止法 一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。 第二代测序技术-大规模平行测序 大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开

三代测序原理技术比较

导读从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。 摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序 技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 图1：测序技术的发展历程 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA 合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为 sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。 值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。

DNA测序技术发展简史

DNA测序技术发展简史 摘要：本文回顾了1965年一来DNA测序技术的发展，重点介绍了双脱氧链终止测序法及Maxam-Gillbert DNA化学降解法的出现，以及其他的一些相关技术的发展，以简练清晰的脉络梳理了DNA测序技术的发展史。 关键词：DNA测序；双脱氧链终止测序法；Maxam-Gillbert DNA化学降解法 l953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型以后，人们就开始探索研究DNA 一级结构的方法。1965年，美国Cornell大学以Rober Holley为首的科学家小组，第一次完成了长度为75个核苦酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定并将结果发表在Science杂志上。其办法是利用各种RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化之后，再分别测定这些寡核苷酸短片段的核苷酸顺序掀开了DNA测序技术研究的序幕[1]。但那时由于没有找到分别降解四种脱氧核糖核酸的专一酶，只能通过测定RNA 的序列来推测DNA的序列，即先将RNA用酸水解或外切酶降解，再经双向电泳同系层析将其分开（小片段重叠法）。 1971年，华裔分子生物学家吴瑞博士（Dr．Ray Wu）在1968年独创性地设计了一种崭新的引物-延伸测序策略，发展出了测定DNA核苷酸序列的第一个方法，提高了DNA序列分析的速度，并于1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个粘性末端的完整序列[2]。 l977年，英国剑桥大学分子生物学实验室的Fred Sanger领导的研究小组在吴瑞博士的基础上分别在Nature和PNAS发表文章，提出DNA聚合酶的双脱氧链终止原理测定核苷酸序列的方法，Sanger作为世界上第一个解决DNA测序的科学家，再一次荣获诺贝尔奖（1980年）[3]。DNA双脱氧链终止测序法，也称酶法或末端终止法，是利用2’,3’-双脱氧三磷酸核苷(2’,3’-ddNTP或简称ddNTP)来终止DNA的复制反应。ddNTP可以在DNA聚合酶作用下通过其5’-磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于ddNTP在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键（由M．R．Atkinson等人于1969年发现），从而中断延伸反应。该法将待测DNA样品分成四组，在每组DNA合成反应混合物的四种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，这样一来，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，最终得到反应一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离，由于这四组独立的酶反应中分别采用四种不同的ddNTP，将产生四组分别终止于模板链的每一个A、G、C或T的位置上的寡核苷酸，使用变性测序凝胶电泳分析这四组反应的产物，即可从放射自显影片上直接读出DNA的序列[4]。 而美国哈佛的Alan Maxam和Walter Gilbert领导的研究小组也几乎同时发明出DNA序列测定方法——Maxam-Gillbert DNA化学降解法测序，其基本原理是用特异的化学试剂修饰DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。该法设计四组特异的反应：①G反应，用硫酸二甲酯使鸟嘌呤上的N7甲基化，加热引起甲基化鸟嘌呤脱落，导致多核苷酸链可在该处断裂；②G+A反应，用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂；③T+C反应，用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基；④C反应，在有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。这样一来，同一个末端标记的DNA片段在四组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基，生成四组放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点，每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。最后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离此后组产物，再从放射自显影片上即可读出序列[5]。

一、二、三代测序技术

一代、二代、三代测序技术 第一代测序技术-Sanger链终止法 一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。 第二代测序技术-大规模平行测序 大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa

technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA 聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解。（4）数据分析 第三代测序技术-高通量、单分子测序 被称为第三代的测序的He-licos单分子测序仪，PacificBioscience的SMRT技术和 Oxford Nanopore Technologies 公司正在研究的纳米孔单分子测序技术正向着高通量低成本长读取长度的方向发展。不同于第二代测序依赖于DNA模板

三代测序原理技术比较

导从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1,发展至今三十多年时间，测导序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从读长到短，再从短到长。 摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到 长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势 位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变 革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在 这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 图1 :测序技术的发展历程 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson ）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam和吉尔伯特（Gilbert ）发明的化学法（链降解）?并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱 基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。 研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基 因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2' 和3'都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA 合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为san ger测序法制作了一个小短片，形象而生动。 值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了San ger法之外还出现了一 些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2 - 4,而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方 法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP 图2: Sanger法测序原理

三代测序技术的比较

一代、二代、三代测序技术 张祥瑞 2013/04/22 11:43 第一代测序技术-Sanger链终止法 一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。 第二代测序技术-大规模平行测序 大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把 DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA 聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解。（4）数据分析 第三代测序技术-高通量、单分子测序

三代基因组测序技术原理(简介)

三代基因组测序技术原理简介 【写在前面的话】：首先，这一篇博文中的内容并非原创，而是对多篇文献中内容的直接摘录，有些图片和资料还来自身边的同事（在此深表谢意！），再夹杂自己的零星想法，写在这里分享与大家，同时也是为了方便自己日后若有需要能够方便获得，文章比较长。 摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 图1： 测序技 术的发 展历程 生命体 遗传信 息的快 速获得 对于生 命科学 的研究 有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。

一代、二代、三代测序技术

三代基因组测序技术原理简介 摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 图1：测序技术的发展历程 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和 ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。 值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。

第三代基因测序技术比较与总结

第三代基因测序技术比较与总结 [摘要]在第二代测序技术的协助下，个人基因组图谱正在如火如荼地绘制中。 在第二代测序技术的协助下，个人基因组图谱正在如火如荼地绘制中。但第二代测序技术很快就遇上了强劲的对手——第三代测序技术，也被称为“下、下一代的测序(next-next-generation sequencing)”。第三代测序技术是基于纳米孔(nanopore)的单分子读取技术，有着更快的数据读取速度，应用潜能也势必超越测序。 2012年2月5日，基因组科学家们齐聚美国佛罗里达州的基因组生物和技术进展会议，来了解哪家公司的第三代测序技术能实现人类基因组的3分钟测序或以5000美元的价格出售。尽管科学家们对公布的数据表示谨慎乐观，但他们对于此类测序仪的优越之处仍心存疑虑。 Complete Genomics 在2008年10月，美国加利福尼亚州的Complete Genomics公司曾宣称他们将在2009年以5000美元的价格售卖人类基因组，但当时没有公布支持数据。在这次会议上，该公司公布了一个人类基因组，据称是用9台仪器在8天内完成的。 该公司的CEO，Clifford Reid表示，他们将254GB的数据拼接成草图，覆盖某个匿名男性基因组的92%，每个碱基平均读取了91次。与目前应用中的高速测序，即第二代测序类似，Complete Genomics也产生短的DNA读长。通过对每个碱基的多次测序，它的目标是排除悄悄混入的可能错误。Reid认为这项技术非常准确，碱基错误的概率低于0.33%。这与目前的测序仪相当。 Complete Genomics并不出售测序仪，但用自己的测序仪来完成所有的内部工作。这让某些科学家质疑，但另一些却深受鼓舞。 速度和费用成为Complete Genomics的最大卖点。该公司并没有透露基因组测序的确切费用，但据称每个基因组的原材料费用低至1000美元。它的目标是在上个月推出市场，今年对1000个基因组进行测序，明年测序数量达到20000个。 Pacific Biosciences 在Complete Genomics做报告前的一小时，Pacific Biosciences的首席技术官Stephen Turner展示了大肠杆菌的完整基因组，并称每个碱基的平均读取了38次，准确率大于99.9999%。 Pacific Biosciences利用了单分子技术和DNA聚合酶，在反应的同时读取测序产物。尽管目前仪器的读取速度仅为3 碱基/秒，但它的目标是在2013年前实现三分钟读完人类基因组。它还有望实现更长的读长。Tuner表示大肠杆菌

测序技术的发展历程

测序技术的发展历程 随着1953年沃森和克里克发现了DNA的双螺旋结构，到2001年，首个人类基因组图谱的绘制完成，人们越来越多的认识到测序在生物医学中的重要作用。 测序技术的发展历史 Sanger测序技术 1975年由桑格和考尔森开创的链终止法测序技术标志着人类第一代DNA测序技术的诞生。1977年，人类历史上第一个基因组序列噬菌体X174由桑格团队测序完成。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。 SangerJ.D. Waston、F.Crick

虽然第一代测序技术的测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。从那时起人们开始了二代测序技术的探索。 第二代测序技术 第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。 现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX（已宣布停产）、Illumina Hiseq Miseq等系列和Applied Biosystems SOLID system。 Roche/454 FLX Illumina Hiseq 2500 AB SOLID 第三代测序技术 第二代测序技术虽然较Sanger测序有了巨大的突破，但是其测序的理论基础仍然建立在PCR扩增的基础之上。为了有效的避免测序过程中由于PCR扩增带来的偏差，科学家们积极投身到第三代单分子测序仪研究当中。目前最具代表性的包括Heliscope单分子实时合成测序法，纳米孔测序技术等。

三代基因组测序技术简介及其原理整理.

三代基因组测序技术简介及其原理整理 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法以及1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）。 1977年，桑格测定了第一个基因组序列——噬菌体X174，全长5375个碱基。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。 Sanger法原理： 1）在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP（N=A/G/T/ C）加到引物的3’- OH末端，合成出新的互补链。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，在互补链在DNA聚合酶作用下延伸时，一旦连接上ddNTP，由于双脱氧核糖的2’和3’都不含羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键而终止反应，随即形成一系列不同长度的、以同样引物为起始、以同一碱基终止的短片段混合物。 2）双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。 化学裂解法原理： 与Sanger法类似，将DNA模板分成4个反应。在每个反应中，先在模板5’端进行放射性标记，再加入能特异性在其中一种碱基处切开DNA的化学试剂。反应进行时，平均一个DNA分子只在随机位点产生一次裂解。接着，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。 第二代测序技术 第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不

转录组测序技术的应用及发展综述

转录组测序技术的应用及发展综述 摘要：转录组测序（RNA-Seq）作为一种新的高效、快捷的转录组研究手段正在改变着人们对转录组的认识。RNA-Seq利用高通量测序技术对组织或细胞中所有RNA 反转录而成cDNA文库进行测序，通过统计相关读段(reads)数计算出不同RNA的表达量，发现新的转录本；如果有基因组参考序列，可以把转录本映射回基因组，确定转录本位置、剪切情况等更为全面的遗传信息，已广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究和药物研发等。文章主要比较近年来转录组研究的几种方法和几种RNA-Seq的研究平台，着重介绍RNA-Seq的原理、用途、步骤和生物信息学分析，并就RNA-Seq技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论及在相关领域的应用等内容，为今后该技术的研究与应用提供参考。 关键词: RNA-Seq；原理应用；方法；挑战；发展前景 Abstract：Transcriptome sequencing (RNA-Seq) is a kind of high efficiency, quick transcriptome research methods are changing our understanding of transcriptome. RNA-Seq to use high-throughput sequencing of tissues or cells of all RNA reverse transcription into cDNA library were sequenced, through statistical correlation read paragraph (reads) numbers were calculated from the expression of different RNA transcripts, find new; if the genome reference sequence, the transcripts mapped to genomic, determine the position of the transcription shear condition, more genetic information, has been widely used in biological research, medical research, clinical research and drug development. This paper compared several methods of platform transcriptome studies and several kinds of RNA-Seq in recent years, RNA-Seq focuses on the principle, purpose, steps and bioinformatics analysis, and discusses the RNA-Seq technology challenges and future development prospect and the application in related field and other content, provide the reference for the research and application of the technology future. Key word：RNA-Seq ;application; principle; method; challenge; development prospects 前言：转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。转录组测序（RNA-Seq）是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。随着后基因组时代的到来，转录组学、蛋白质组学、代谢组学等各种组学技术相继出现，其中转录组学是率先发展起来以

第三代测序技术单分子即时测序

第三代测序技术:单分子即时测序 ?７１８? 第三代测序技术：单分子即时测序 刘岩吴秉铨 ＤＮＡ测序技术是分子生物学研究中最常用的技术，它的出现极大地推动了生物学的 发展。从人类基因组计划 （ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ），到人类基因组单倍型图计划 （ＨａｐＭａｐ），再到人类癌症基因组及个体基因组计划，第一代和第二代ＤＮＡ 测序技术功不可没。特别是近几年发展起来的第二代ＤＮＡ测序技术则使得ＤＮＡ测序进 入了高通量、低成本的时代。目前，基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现，该 技术测定ＤＮＡ序列更快，并有望进一步降低测序成本，为人类从基因水平深入理解疾病 的发生、发展、诊断和治疗提供新的手段，使个体化医疗成为现实。本文回顾了测序技术 发展过程，并对第三代测序技术的特点和优势进行详细论述。 一、第一代ＤＮＡ测序（ｆｉｒｓｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ） 成熟的ＤＮＡ测序技术始于２０世纪７０年代中期，１９７７年Ｍａｘａｍ和Ｇｉｌ ｂｅｒｔ…报道了通过化学降解测定ＤＮＡ序列的方法。同一时期，Ｓａｎｇｅｒ等拉１ 发明了双脱氧链终止法，基本原理是利用４种双脱氧核苷酸（ｄｄＮＴＰ）代替脱氧核苷 酸（ｄＮＴＰ）作为底物进行ＤＮＡ合成反应。一旦ｄｄＮＴＰ掺入到ＤＮＡ链中，由于 核糖的第３位碳原子上不含羟基，不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键，ＤＮＡ合成链 的延伸反应被终止，生成了若干长度仅相差单个碱基的ＤＮＡ片段。在４个ＤＮＡ合成反 应体系中，分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种ｄｄＮＴＰ，通过单碱基分 辨率的凝胶电泳分离不同长度的ＤＮＡ片段和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定 待测ＤＮＡ分子的序列。 ２０世纪９０年代初出现的荧光自动测序技术也是基于Ｓａｎｇｅｒ等¨１原理。但 用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了ＤＮＡ测序的速度 和准确性，将ＤＮＡ测序带入自动化测序的时代，这些技术统称为第一代ＤＮＡ测序技术。随后，平板电泳分离技术被毛细管电泳所取代，并且通过更高程度的并行化使得同时进行 测序的样本数量成倍增加。目前应用最广泛的ＡＢＩ３７３０系列自动测序仪，即是基于 毛细管电泳和荧光标记技术的ＤＮＡ测序仪，在一次运行中可分析９６个样本。