辣根过氧化物酶(HRP)标记蛋白的方法

HRP 的NaIO4标记法

一．原理：HRP为一种糖蛋白（glycoprotein），其所带的糖基上的糖环能被氧化开环，在2，3—位的—C—C—断开。在适当的氧化条件下，2，3—位羟基能被氧化为醛基。醛基在碱性条件下可与被标记物的自由氨基（—NH2）形成Shiff碱（—N=CH—），Shiff碱不稳定，可由逆反应解离。Shiff碱可由还原剂还原成—CH2—NH—，在HRP与被标记物间形成稳定的共价交联。HRP的NaIO4标记法所用氧化剂为NaIO4，还原剂采用NaBH4。

Note:

1.产物A不稳定，故用NaBH4还原为产物B。

2.HRP的氧化要适度，氧化不够不能产生足够量的醛基，如氧化过度，醛基可

被进一步氧化为羧基，同样也得不到够量的醛基。可通过控制NaIO4的量或控

制氧化的时间来调节HRP糖基的氧化度。当糖基的氧化度为20～25%时，有

较高的结合效率。

3.为了防止HRP的过度氧化，在整个标酶的过程中应尽量避光。光照可加快过

碘酸钠对HRP糖基的氧化，如在标记过程中不避光，则不可控因素太多。

4.反应的最后一步用NaBH4来还原的反应比较剧烈，对酶活性的影响比较大。

有时可考虑在酶与糖基之间添加一个手臂，如联苯胺反应。

二．酶量的确定：被标记物在本实验室主要为抗原与抗体。抗原与HRP的比值通常为摩尔比1：1。而抗体与HRP的比值通常为质量比1.6：1。当然，这只是一个基点，可根据需要上下调整比率。统计本次标记所需酶的总量，设为x mg。

三．酶的氧化（全过程避光，操作中力防污染。酶的终浓度为10mg/mL，总体积为x/10mL）

1.称取HRP x mg。当HRP从-20℃取出后，一定要平衡到室温，否则HRP冻干品易潮

解。称量时不要用称量纸，不要用工具取HRP，应将HRP直接小心地倒入要用来溶

解HRP的器具中。在倒HRP时，不要在风口（如电风扇风，自然风，呼吸）操作，因为HRP冻干品质轻易飞扬；尽量不要说话，以防污染。HRP尽量不要回倒，以防

污染。当HRP量小于10 mg时，溶解器具可用干净Eppendoff tube，HRP量大于

10 mg时，则要求用体积稍大的小玻璃瓶。

2.加ddH2O（x/20-z）mL溶解（颜色为褐色）。量小可用枪轻轻吹打溶解，量大可用

搅拌子适速搅拌溶解。注意不要太剧烈，不要起泡沫，否则HRP易失活。

3.称取x mg NaIO4，加ddH2O x/20 mL溶解（一个原则为NaIO4的量应大于x mg，可

先配制成20 mg/mL，取适当体积来使用）。

4.往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌。

5.将混合好的溶液置于4℃，静置20 min（颜色为绿色）。

6.取x μL乙二醇溶于z mL DDW中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌，z值

尽量小，大约为总体积的1/20。

7.室温静置20min（颜色应回复为最初的褐色）。

8.酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/mL。

Note:

在酶的活化的过程中，注意NaIO4的浓度，不可太高，氧化时间不能太长，z值尽量的小，活化后的酶要马上使用。活化酶所用的溶解水应为Ulterpure water。

四．待标记蛋白的准备及标记（避光。防污染）

1.样品的处理：蛋白浓度选择最佳浓度（抗体一般要求5mg/mL 左右，抗原一般要

求1mg/mL左右，蛋白浓度过低可用PEG20000浓缩）。

2.用pH9.6左右的50mM CB（1×CB）透析去甘油或杂质（如Tris），换液视情况而定。

如样品中含有SDS，应在室温下透析去SDS。

（HRP活化的时间应掌握好，以便能与此步接上。一个原则是不能让氧化好的HRP

等样品的处理，应HRP一氧化好就可进行此步。）

3.将蛋白（抗原或抗体）与HRP按所需比例混合，于50mM pH9.5 CB中透析6小时

以上，头两个小时换液一次。

4.用新鲜配置的NaBH4溶液终止，NaBH4量为0.2x mg。摇匀，4℃静置2小时，每半

小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适。（NaBH4溶液浓度自定，一个原则是加

到透析袋的体积是一个合适的体积。袋子满，所能容纳的体积小，NaBH4可配浓一

点，反之亦然。）

5.用pH8.0的20mM TBS或pH7.2的10mM PBS透析过夜。应换液多次，尽量除去NaBH4

（NaBH4可影响酶联试剂的热稳定性）。如受条件限制，一次也可。

Note:

拿捏透析袋应戴手套。

五．成品酶的保存：

加等量的甘油，混匀后-20℃保存。

六．附录：

附录1：（标酶过程所用Buffer）

TBS为Tris-HCl等渗缓冲液，PBS为磷酸盐等渗缓冲液，CB为碳酸盐缓冲液。

10×（pH8.0 20mM）TBS的配制：

20×（pH9.6 50mM）CB的配制：

20×（pH7.0 10mM）PBS的配制：

Na2HPO4·12H2O 43.7g NaH2PO4·2H2O 12.16g

NaCl 170g 加水至 1000mL。

1.酶的氧化（避光）：

称取HRP 2.4mg，加ddH2O 100μL；

称取NaIO4 5.4mg，加ddH2O 270μL；

取NaIO4溶液120μL缓慢加入到HRP溶液中；

4℃避光放置30min；

取2.4μL乙二醇，加入20μL ddH2O，混匀，加到HRP溶液中；

室温静置30min；

酶的氧化过程完成，总体积为240μL，浓度为10mg/mL。

2.抗原的标记：

抗原蛋白已于前一天用50mM CB透析完成；

在抗原溶液中分别加入10mg/mL的HRP 100μL（HIV-Env9），25μL（梅毒4717），50μL（梅毒4715）；

50mM CB透析6小时以上，头两个小时换液一次；

称取NaBH44.6mg，加入ddH2O 460μL，浓度为10mg/mL，分别加入到标酶溶液中20μL（HIV-Env9），5μL（梅毒4717），10μL（梅毒4715），摇匀，4℃静置2小时，每半小时摇一次；

用pH8.0的20mM TBS透析过夜，其中换液三次即可。

从透析袋中取出样品，加等体积甘油混匀，-20℃保存。

附录3：（用夹子夹透析袋的方法）

在夹夹子时应排尽袋子里的气泡，如有气泡则袋子易浮于Buffer上，透析效果不好，并有生物活性原料易失活等弊端。

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG使用说明

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG使用说明 规格：0.1ml/1ml 抗体来源：Goat 克隆类型：Polyclonal 交叉反应：Rb 产品应用：WB=1:1000-10000ELISA=1:1000-10000IHC-P=1:100-1000IHC-F=1:100-1000 not yet tested in other applications. optimal dilutions/concentrations should be determined by the end user. 分子量：150kDa 性状：Lyophilized or Liquid 浓度：2mg/1ml 免疫原：Full length plasma protein 亚型：IgG 纯化方法：affinity purified by Protein A 储存液：0.01M PBS,pH7.4with10mg/mL BSA and0.1%Gentamicin 保存条件：Storage:Store at–20℃for one year.Avoid repeated freeze/thaw cycles. The lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater than a year when kept at-20oC.When reconstituted in sterile distilled water or diluent supplied,theantibody is stable for at least two weeks at2-4℃。产品介绍： Immunoglobulin G(IgG),is one of the most abundant proteins in serum with normal levels between8-17mg/mL in adult blood.IgG is important for our defence against

辣根过氧化物酶制作过程

过氧化物酶体与溶酶体不同，过氧化物酶体不是来自内质网和高尔基体，因此它不属于内膜 系统的膜结合细胞器。过氧化物酶体普遍存在于真核生物的各类细胞中，但在肝细胞和肾细 胞中数量特别多。过氧化物酶体含有丰富的酶类，主要是氧化酶，过氧化氢酶和过氧化物酶。氧化酶可作用于不同的底物，其共同特征是氧化底物的同时，将氧还原成过氧化氢。过氧化 物酶体的标志酶是过氧化氢酶，它的作用主要是将过氧化氢（H2O2，Hydrogen Peroxide）水解。氧化酶与过氧化氢酶都存在于过氧化物酶体中，从而对细胞起保护作用。 HRP的制备 ⒈水提取： 称取 10斤用水冲刷干净的鲜辣根（辣根皮中亦含有丰富的HRP），用菜刀切成小碎块，在 搅肉机中搅碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜（亦可采用高速抽提法）。次日用甩干机（或离心机）甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取一次， 合并两次滤液，量总体积和度，0。 ⒉硫酸铵分级分离： 在不断搅拌下，每升滤液中慢慢加入226克硫酸铵粉末（相当于0.40饱和度），大约在1~2 小时内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面浑浊液以3000转/分离心15分钟，弃沉淀，合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸铵粉末（0.8饱和度） 随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离 心机中以13000转/分离心20分钟，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150毫升蒸 馏水中（加水量要使沉淀全部溶解为止），分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析 1~2天，直到硫酸铵透析完毕为止（可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查）。然后改换成 用蒸馏水透析，中间更换2~3次，用0.1 mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。 将透析液合并，在冰冻离心机中以 4000转/分离心 15分钟；去沉淀，量上清液的体积。 ⒊丙酮分级分离： 将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃ 的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4，000/分离心15分钟，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积（按原上清液体积）-15℃丙酮，（操作同上），静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除丙酮。可得Rz值近于1的酶溶液。 ⒋精制： 将上步酶液适当稀释，滴加1M硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10-3M，5000转/分离心10分钟，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，对水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冷冻干燥（约得20毫克），产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的Rz值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。

PH0728 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒使用手册

1PH0728|DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒 Catalog No ：PH0728 Size ：?100mL Storage ：Store@-20℃避光保存 ◆产品简介DAB 辣根过氧化物酶显色液(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种依据辣根过氧化物酶(HRP)结合显色，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA 等膜显色的试剂盒。 DAB 即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride,是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下,DAB 会产生棕色沉淀。该棕色沉淀丌溶于水和乙醇。因此在DAB 显色后,还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。 本显色液可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可用于Western 等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。 ◆试剂组分 试剂(A):DAB 显色液A---50mL (-20℃避光) 试剂(B):DAB 显色液B---50mL (-20℃避光) 试剂(C):DAB 显色液C---100uL (RT) 自备材料： 1、洗涤液 2、蒸馏水◆使用参考 1、常规组织切片、细胞样品、膜不辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也可用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。 2、按(A):试剂(B):试剂(C)=5000:5000:3的比例混合,即为DAB 染色工作液，即配即用。 3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB 染色工作液，确保覆盖样品。 4、室温避光孵育或更长时间，直至显色至预期深浅。 5、去除DAB 染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。 6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。 ◆注意事项 1、DAB 是致癌物，请注意适当防护。 2、试剂(A)、试剂(B)避免反复冻融。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 ◆常见问题 1、背景显色太深 ①在免疫组化时如果背景显色太深，考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选购适当的封闭液或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。②在进行含内源性过氧化氢酶的免疫组化时，如果背景显色太深，需注意灭活内源性过氧化氢酶。 ③可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。 ④选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间。 2、没有显色或显色太弱 ①当提高一抗或二抗的浓度。检测二抗效果，滴一滴稀释二抗在膜上，检测二抗是否可以被正常显色。 ②考虑使用更加灵敏的放大检测体系，例如使用生物素检测体系。 ③适当延长显色时间，另外确定抗原修复是否对于使用的一抗是必需的。

PH0728 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒实验方法与常见问题

PH0728|DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒 DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit Catalog No：PH0728Size：?2×50mL|?2×100mL Store at-20℃ DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种借助辣根过氧化物酶(HRP)，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA等膜显色的试剂盒。 DAB，即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride，是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生棕色沉淀。该棕色沉淀不溶于水和乙醇。因此在DAB显色后，还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。 本试剂盒可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可以用于Western等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。 组分 Component2×50mL2×100mL Storage DAB显色液A50mL100mL-20℃避光 DAB显色液B50mL100mL-20℃ 使用参考 1.对于组织切片或细胞样品或膜，在与辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。 2.按照1:1的比例将显色液A、B液混匀，混匀后即配制成DAB染色工作液。 3.最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，加入适量DAB染色工作液，确保能充分覆盖样品。 4.室温避光孵育3-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。 5.去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应。 6.对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，如有必要可以用中性红染色液(neutral red staining solution)染色，以便于观察。对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。 注意事项 DAB对人体有害，请注意适当防护。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

辣根过氧化物酶在纤维材料生物整理中的应用研究进展

第40卷一第4期2019年4月纺一织一学一报Journal of Textile Research Vol.40,No.4Apr.,2019DOI :10.13475/j.fzxb.20180300407 辣根过氧化物酶在纤维材料生物整理中的 应用研究进展 周步光,王一平,王一强,范雪荣,袁久刚 (生态纺织教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡一214122) 摘一要一针对化学法整理纤维材料存在能耗高二纤维损伤大的缺陷,提出借助酶法在温和条件下对纤维材料进行生物整理加工三介绍了辣根过氧化物酶/双氧水/β-二酮类引发剂乙酰丙酮(HRP /H 2O 2/ACAC)三元催化体系的氧化机制,综述了该体系在淀粉二黄麻和丝蛋白生物改性中的应用,包括:通过酶促反应使丙烯酸甲酯与淀粉接枝共聚,提高淀粉浆料对疏水性纤维的成膜性;通过催化黄麻与丙烯酰胺或甲基丙烯酸六氟丁酯接枝,实现黄麻亲水或疏水化整理;通过酶促反应使丝素与丙烯酸接枝共聚,提升丝素材料的仿生矿化效果;通过催化丝胶与甲基丙烯酸甲酯接枝共聚,改善丝胶基生物材料的成型性三指出HRP 在纤维整理及生物材料制备中具有潜在的应用前景三 关键词一辣根过氧化物酶;三元催化体系;乙烯基单体;淀粉;黄麻;丝蛋白;生物材料 中图分类号:TS 195.5一一一文献标志码:A一一一 Research progress of horseradish peroxidase in bio-finishing of fiber materials ZHOU Buguang,WANG Ping,WANG Qiang,FAN Xuerong,YUAN Jiugang (Key Laboratory of Eco-Textiles (Jiangnan University ),Ministry of Education ,Wuxi ,Jiangsu 一214122,China )Abstract 一Considering the defects that chemical finishing on fiber materials has large energy consumption and potential fiber damages,enzymatic finishing of fiber materials under mild treating conditions were suggested.The oxidation mechanism of the ternary catalyst system of horseradish peroxidase (HRP ),hydrogen peroxide (H 2O 2)and β-diketone initiator acetylacetone (ACAC)were introduced,and its applications in bio-modifications of starch size,jute,silk protein were reviewed as follows.Methyl acrylate was graft copolymerized with starch to improve its film forming property onto the hydrophobic fibers.Acrylamide and hexafluorobutyl methacrylate were applied to modify jute fiber by enzymatic graft-copolymerization,respectively,realizing the hydrophilic or hydrophobic modification of jute fiber.Acrylic acid was used to enzymatically graft copolymerized onto silk fibroin to enhance the biomimetic mineralization effect of fibroin-based biomaterial.Furthermore,HRP-mediated graft copolymerization of methyl methacrylate onto silk sericin was also investigated to improve the formability of sericin-based biomaterials.In conclusion,HRP exhibits potential applications in bio-finishing of textile fibers and preparation of biomaterials.Keywords 一horseradish peroxidase;ternary catalyst system;vinyl monomer;starch;jute;silk protein;biomaterial 收稿日期:2018-03-01一一一修回日期:2018-12-12 基金项目:国家自然科学基金项目(51373071,31771039);青蓝工程资助项目(苏教师[2016]15号);中央高校基本科研业务费 专项资金项目(JUSRP51717A );高等学校学科创新引智计划项目(B17021) 第一作者:周步光(1994 ),男,硕士生三主要研究方向为纺织品生态加工技术三 通信作者:王平(1971 ),男,教授,博士三主要研究方向为纺织生物技术三E-mail :wxwping@https://www.wendangku.net/doc/a46873014.html, 三一一由于淀粉分子结构本身的特点,使得淀粉浆料 对疏水性纤维的黏附力不足[1]二成膜性差,为改善淀粉浆料对经纱的上浆性能,需要对淀粉进行接枝 改性三黄麻纤维存在刚度大二刺痒二易成褶二染色深度不高二染鲜艳色难等缺点,并且植物纤维与非极性二疏水性树脂间的界面黏结性差,使其应用受到很

DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒

DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒 简介： DAB 辣根过氧化物酶显色液(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种依据辣根过氧化物酶(HRP)结合显色，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western 、Southern 、Northern 、EMSA 等膜显色的试剂盒。DAB 即3,3N-Diaminobenzidine T ertrahydrochloride, 是辣根过氧化物酶的常用底物。本显色液可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可用于Western 等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、常规组织切片、细胞样品、膜与辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次。 2、按(A):试剂(B):试剂(C)=5000:5000:3的比例混合, 即为DAB 染色工作液，即配即用。 3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB 染色工作液，确保覆盖样品。 4、室温避光孵育或更长时间，直至显色至预期深浅。 5、去除DAB 染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。 6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。 注意事项： 1、 DAB 是致癌物，请注意适当防护。 2、 试剂(A)、试剂(B)避免反复冻融。 2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 编号 名称 PW0072 2×50ml Storage 试剂(A): DAB 显色液A 50ml -20℃ 避光 试剂(B): DAB 显色液B 50ml -20℃ 避光 试剂(C): DAB 显色液C 100ul RT 使用说明书 1份

辣根过氧化物酶

辣根过氧化物酶（HRP） 一种糖蛋白，由于在辣根中该酶的含量很高，故名。它以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。通常用做光学和电子显微镜的组织化学示踪物。 简介： 过氧化物酶，通常来源于辣根（因此称辣根过氧化物酶），是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。 用途： 1) RZ>3 活性 >250u/mg，主要应用于免疫学，是高纯度的过氧化酶。采用特殊色谱纯化技术以除去会影响免疫学反应的同工酶B . 2) RZ>2 活性>180u/mg ，主要应用于临床化学，我们的客户也有将这个规格的产品应用于免疫学研究的。此时，一个标准化的分析方法就变得尤为重要。 3) RZ>1 活性>100u/mg，主要应用于血糖试纸和尿液分析试纸。 4) RZ>0.6 活性>60u/mg ，主要应用于尿液分析试纸。 实验原理： 过氧化物酶催化以下反应： 2 H2O2 ─→ O2+2H2O

辣根过氧化物酶标记 Streptavidin

辣根过氧化物酶标记Streptavidin 产品简介： 本辣根过氧化物酶标记Streptavidin (HRP-labeled Streptavidin)也称HRP-Streptavidin、Streptavidin-HRP或辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，为进口分装，可以用于生物素(Biotin)标记的抗体、核酸、蛋白或其它生物素标记分子的检测。具体用途包括Western、ELISA、免疫组化或免疫细胞化学、原位杂交、Southern、Northern、EMSA等。 本HRP-Streptavidin用高纯度的Streptavidin和超纯的辣根过氧化物酶交联而成，确保产生最低的本底和最高的灵敏度。本产品的浓度为1mg/ml。 Streptavidin的分子量为66kD，可以高度特异性地和生物素(Biotin)结合。Streptavidin和生物素的亲和常数为K d=10-15M。 Streptavidin是一个4聚体蛋白，可以同时结合4个生物素分子。Streptavidin的中文名为链霉亲和素，从Streptomyces adidinii 中纯化获得，和鸡蛋清来源的Avidin(亲和素)在空间结构以及与生物素的亲和力方面具有高度的相似性。和Avidin不同的是，Streptavidin是一种非糖基化蛋白，并且基本不带电荷。Avidin的pI= ~10.5，在中性pH条件下呈碱性。由于Streptavidin 和Avidin相比在中性条件下不带电荷，因此Streptavidin的非特异性结合比Avidin低很多，这样检测时的非特异性背景就低很多。因此目前在生物素检测时通常使用Streptavidin替代Avidin。 辣根过氧化物酶即horseradish peroxidase (HRP)，可以在Western、EMSA、Southern或Northern等检测时催化ECL类试剂(如ECL、BeyoECL等)产生化学发光，可以在ELISA时催化TMB产生蓝色，也可以在免疫组化、免疫细胞化学或Western blot 检测时催化DAB产生棕色沉淀。 本辣根过氧化物酶标记Streptavidin用于各种常规用途的推荐稀释比例参考下表，实际实验操作过程中需根据具体情况适当调节辣根过氧化物酶标记Streptavidin的稀释比例。对于Western，推荐的稀释范围为1:2000-10000。 本产品如果用于常规的Western检测，以每次检测需10毫升1:2000稀释的本产品计，可以检测40次。 保存条件： -20℃保存，一年有效。 注意事项： 叠氮钠会抑制辣根过氧化物酶的活性，在含有辣根过氧化物酶的溶液中不可加入叠氮钠。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.Western、ELISA、免疫组化或免疫细胞化学、原位杂交、Southern、Northern、EMSA等请参考相关实验步骤进行。起始 稀释浓度按照产品简介中推荐的稀释比例进行稀释。 使用本产品的文献： 1. Liu H, Jiang C, Xiong C, Ruan J. DEDC, a new flavonoid induces apoptosis via a ROS-dependent mechanism in humanneuroblastoma SH-SY5Y cells. Toxicol In Vitro. 2012 Feb;26(1):16-23. 2. Liu J, Qian X, Chen Z, Xu X, Gao F, Zhang S, Zhang R, Qi J, Gao GF, Yan J. Crystal structure of cell adhesion molecule nectin-2/CD112 and its binding to immune receptorDNAM-1/CD226. J Immunol. 2012 Jun 1;188(11):5511-20. 3.P Xiao, X Lv. Immobilization of Chymotrypsin on Silica Beads Based on High Affinity and Specificity Aptamer and Its Applications.

辣根过氧化物酶的色原底物

辣根过氧化物酶的色原底物 HRP最常用的色原底物有邻苯二胺(OPD)、2，2’—吖嗪—(3—乙酰苯基噻唑磺酸—6)[2， 2’—azino-di(3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6)，ABTS](杂环吖嗪)、四甲基联苯胺(TMB)和4—氨基安替比林：苯酚耦联底物对等。上述色原底物受HRP作用主要有两种形式的反应：①氧化还原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一个氨基芳香剂与另一个芳香基化合物的氧化耦联，如4—氨基安替比林：苯酚等。 (一)氧化还原色原底物 OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯(DAB)。在pH5．0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收，当pH值降为1．0时，最大吸收波长移动至492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深(图4—2)。因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。实际工作中，用强酸尤其是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化OPD而产生非酶催化的DAB的结果。有人在强酸反应终止液中加入还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了OPD 的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。由于OPD的不稳定性，现在的商品试剂盒中，OPD均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液。 在ELISA测定时，OPD色原底物的具体配方为①显色底物溶液：在0．1mol／L枸橼酸盐缓冲液(pH5．0)中含20 mmol／L OPD和12 mmo!／L H202，或10 mmol／L OPD和5．5mmol／L H202；②终止液：2 mol ／L硫酸(含0．1 mol／L亚硫酸钠)；③测定波长：492nm。 TMB是一种优于OPD的新型HRP色原底物。其氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，过氧化氢溶液和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌(图4—3)。使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min，但随后本底显色就不断加深，国内有人认为使用1％SDS作为终止剂，可使鲜蓝色24h内保持不变，阴阳性对比十分明显，但在我们实验室发现1％SDS对上述显色有较强的褪色作用，目前仍以硫酸作为终止剂较为理想。ELISA中，底物反应显色后，常选择其具最大吸收的波长450nm比色测定结果。而’Madersbacher和Berger等为提高以TMB作底物的ELISA测定的敏感性，选择显色呈指数加深时的波长405nm比色测定。他们首先测定一系列已知浓度的标准品在450nm和405nm的值，证实A450nm／A405nm之比为3．2，然后在使用波长405nm测定含低浓度待测物的标本得到的OD值再乘以常数3．2，即为待测标本在波长450nm处的真值。该种双波长测定方法可使ELISA测定范围提高3倍。TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等)，则可反应显色迅速消退。TMB虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了OPD而成为HRP最为常的色原底物。

辣根过氧化物酶(HRP)标记蛋白的方法

HRP 的NaIO4标记法 一．原理：HRP为一种糖蛋白（glycoprotein），其所带的糖基上的糖环能被氧化开环，在2，3—位的—C—C—断开。在适当的氧化条件下，2，3—位羟基能被氧化为醛基。醛基在碱性条件下可与被标记物的自由氨基（—NH2）形成Shiff碱（—N=CH—），Shiff碱不稳定，可由逆反应解离。Shiff碱可由还原剂还原成—CH2—NH—，在HRP与被标记物间形成稳定的共价交联。HRP的NaIO4标记法所用氧化剂为NaIO4，还原剂采用NaBH4。 Note: 1.产物A不稳定，故用NaBH4还原为产物B。 2.HRP的氧化要适度，氧化不够不能产生足够量的醛基，如氧化过度，醛基可 被进一步氧化为羧基，同样也得不到够量的醛基。可通过控制NaIO4的量或控 制氧化的时间来调节HRP糖基的氧化度。当糖基的氧化度为20～25%时，有 较高的结合效率。 3.为了防止HRP的过度氧化，在整个标酶的过程中应尽量避光。光照可加快过 碘酸钠对HRP糖基的氧化，如在标记过程中不避光，则不可控因素太多。 4.反应的最后一步用NaBH4来还原的反应比较剧烈，对酶活性的影响比较大。 有时可考虑在酶与糖基之间添加一个手臂，如联苯胺反应。 二．酶量的确定：被标记物在本实验室主要为抗原与抗体。抗原与HRP的比值通常为摩尔比1：1。而抗体与HRP的比值通常为质量比1.6：1。当然，这只是一个基点，可根据需要上下调整比率。统计本次标记所需酶的总量，设为x mg。 三．酶的氧化（全过程避光，操作中力防污染。酶的终浓度为10mg/mL，总体积为x/10mL）

1.称取HRP x mg。当HRP从-20℃取出后，一定要平衡到室温，否则HRP冻干品易潮 解。称量时不要用称量纸，不要用工具取HRP，应将HRP直接小心地倒入要用来溶 解HRP的器具中。在倒HRP时，不要在风口（如电风扇风，自然风，呼吸）操作，因为HRP冻干品质轻易飞扬；尽量不要说话，以防污染。HRP尽量不要回倒，以防 污染。当HRP量小于10 mg时，溶解器具可用干净Eppendoff tube，HRP量大于 10 mg时，则要求用体积稍大的小玻璃瓶。 2.加ddH2O（x/20-z）mL溶解（颜色为褐色）。量小可用枪轻轻吹打溶解，量大可用 搅拌子适速搅拌溶解。注意不要太剧烈，不要起泡沫，否则HRP易失活。 3.称取x mg NaIO4，加ddH2O x/20 mL溶解（一个原则为NaIO4的量应大于x mg，可 先配制成20 mg/mL，取适当体积来使用）。 4.往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌。 5.将混合好的溶液置于4℃，静置20 min（颜色为绿色）。 6.取x μL乙二醇溶于z mL DDW中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌，z值 尽量小，大约为总体积的1/20。 7.室温静置20min（颜色应回复为最初的褐色）。 8.酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/mL。 Note: 在酶的活化的过程中，注意NaIO4的浓度，不可太高，氧化时间不能太长，z值尽量的小，活化后的酶要马上使用。活化酶所用的溶解水应为Ulterpure water。 四．待标记蛋白的准备及标记（避光。防污染） 1.样品的处理：蛋白浓度选择最佳浓度（抗体一般要求5mg/mL 左右，抗原一般要 求1mg/mL左右，蛋白浓度过低可用PEG20000浓缩）。 2.用pH9.6左右的50mM CB（1×CB）透析去甘油或杂质（如Tris），换液视情况而定。 如样品中含有SDS，应在室温下透析去SDS。 （HRP活化的时间应掌握好，以便能与此步接上。一个原则是不能让氧化好的HRP 等样品的处理，应HRP一氧化好就可进行此步。） 3.将蛋白（抗原或抗体）与HRP按所需比例混合，于50mM pH9.5 CB中透析6小时 以上，头两个小时换液一次。 4.用新鲜配置的NaBH4溶液终止，NaBH4量为0.2x mg。摇匀，4℃静置2小时，每半 小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适。（NaBH4溶液浓度自定，一个原则是加 到透析袋的体积是一个合适的体积。袋子满，所能容纳的体积小，NaBH4可配浓一 点，反之亦然。） 5.用pH8.0的20mM TBS或pH7.2的10mM PBS透析过夜。应换液多次，尽量除去NaBH4 （NaBH4可影响酶联试剂的热稳定性）。如受条件限制，一次也可。 Note: 拿捏透析袋应戴手套。 五．成品酶的保存： 加等量的甘油，混匀后-20℃保存。 六．附录： 附录1：（标酶过程所用Buffer） TBS为Tris-HCl等渗缓冲液，PBS为磷酸盐等渗缓冲液，CB为碳酸盐缓冲液。 10×（pH8.0 20mM）TBS的配制：

辣根过氧化物酶

用辣根过氧化物酶追溯周围神经联系法 辣根过氧化物酶(Herseradish Peroxidase)最早由Richard(1960)等人[1]用来研究肾近端小管的早期吸收情况，将HRP注入鼠静脉内，离隔一定时间进行观察。70年代Kristensen是将HRP用于神经系统联系的创妙人[2]，他的第一部分工作即是将HRP注入腓肠肌内而观察中枢（前角运动细胞）的HRP阳性标记颗粒。1972年Lavai和Lavai et al[3]首次将HRP用于中枢神经系统。他将HRP注入小鸡的中脑顶盖部分,30小时后取材, 观察视网膜节细胞内的HRP阳性标记细胞。1973年以后, 此法用于中枢神经系统者逐渐增多。 将HRP注入周围神经末梢部分, 观察其向中枢的联系, 近年来开展了各方面的探索：里见肇及山本悌司等人进行的试验：是将HRP 注入胃壁包括胃体、胃底、幽门等处,观察延髓迷走背核及孤束核的内侧部的酶标颗粒, 以及将HRP注入猫心脏窦房结观察延髓迷走背核及孤束核的酶标颗粒[1,5]。 Dalsgaard, Elfvin(6)等人将HRP注入肠系膜下节及交感颈上节, 观察脊髓内五个交感核的酶标颗粒及其节段性。 至于用HRP法追踪周围神经联系的研究工作, 目前国内外开展很少。只有Lowrence[7]将HRP注入一侧牙髓后观察同侧三叉神经半月神经节细胞内的HRP阳性颗粒；此外他还切断坐骨神经将断端浸入HRP液内, 在后根脊神经节细胞内找到HRP阳性颗粒。Elfvin还将HRP 注入荷兰猪的肠系膜下节, 观察脊神经细胞内HRP阳性细胞的节段性。国内从事HRP法研究的学者也多是研究中枢神经系内各核团的联

HRP辣根过氧化物酶标记抗体的方法

HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体的方法 酶标记抗体－HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法【医学基础免疫学实验指导】 来源： 医学基础免疫学实验指导,主编金伯泉李恩善,第1版.北京:世界图书出版社,1990 酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关 系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗 体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、 活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧 化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方 法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。 (一)酶制剂及其底物

凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的 酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能 用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶 (AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容 易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕 色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等 电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和 58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一 般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应 在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活 性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。