酒精性肝损伤造模
酒后饮绿茶对小鼠肾功能影响的实验性研究
李佳陈路军陈洁徐立思齐慧娟陆妙君
指导老师：黄品贤
（上海中医药大学03中西（七）上海201203）
[摘要]目的观察给最佳酒醉状态的小白鼠灌茶对肾功能的影响。方法检测给小白鼠
0.15ml/10g白酒后20min灌入低、中、高浓度茶、解酒阳性对照药枳椇子各0.20ml/10g，连续7天后血肌酐、血尿素蛋及尿蛋白含量。结果⒈高中浓度茶组、模型组的尿蛋白与正常组相比有显著差异，P<0.05。⒉各组生存曲线比较的Log-rank检验结果：χ2=20.39，
P<0.01。⒊肾脏病理改变：低浓度茶组小鼠肾小球、肾小管未见明显病变，但间质血管扩张充血明显，有较多量红细胞漏出，可见炎症反应，间质未见纤维化；中浓度茶组肾组织结构完整，肾小球、肾小管未见明显病理变化，间质未见明显充血，少量红细胞漏出，间质未见纤维化；高浓度茶组肾脏组织结构与中浓度茶组接近。阳性对照组肾组织结构基本完整，肾小球、肾小管未见明显病理变化，间质少量充血。结论根据尿蛋白、实验小鼠的生存曲线分析、肾脏的病理结果的一致性得出：⒈酒后饮茶均可导致小鼠的死亡，但是酒后高浓茶对肾脏的损害作用最小。⒉酒后饮淡茶及阳性解酒药枳椇子能起到一定解酒作用，但对肾脏有明显的损害。但本次实验由于死亡率高致样本含量不够，确切的结论有待继续研究。
[关键词]酒，茶，小白鼠，肾功能，病理学
在中国，茶能解酒是自古以来就流传的说法。日常生活中，人们通常用绿茶来帮助消食解酒，且认为茶越浓解酒效果越好。人们认为，饮茶能够使人大脑兴奋、清醒，酒后饮茶能够让被酒精冲昏了的头脑清醒一些，从而达到“醒酒”的效果。
但近年来，有越来越多的报道指出：过量饮酒后饮茶对肾脏有害无益。其理论依据为：绿茶的主要成分茶碱有利尿作用，浓茶中的大量茶碱更能迅速发挥利尿作用，促使尚未分解的酒精代谢产物——乙醛过早地进入肾脏，而乙醛对泌尿系统有很大的损害作用。
本实验采用56度白酒以最佳致醉量对小鼠灌胃后，用等量不同浓度的绿茶及阳性对照药物枳椇子对醉酒小鼠进行灌胃的方法，通过检测鼠尿中的尿蛋白、血样中血肌酐、尿素氮指标及对肾脏组织病理切片的观察，对以上两种观点的正确性作出验证。
现将实验研究结果报告如下。
1 材料与方法
1.1实验动物：昆明种小鼠120只，体重：20-35g，雌雄各半，由上海中医药大学动物实验中心提供。动物房饲养温度：20-23℃，相对湿度：50-70％，标准饮食，饮自来水。
1.2实验仪器和试剂及其制备：
1.2.1实验仪器：针筒灌胃针、天平、试剂瓶、代谢笼、离心机、气象色谱仪、生化分析
1.2.2 实验试剂及其制备：
1.2.2.156度红星二锅头：北京红星酿酒总厂生产。
1.2.2.2 绿茶：黄山毛峰（一级，散装）。绿茶制备：低浓度茶：10g 绿茶加入100度蒸馏水1000ml，浸泡30分钟，用两层纱布过滤；中浓度茶：25g绿茶加入100度蒸馏水1000ml，浸泡30分钟，用两层纱布过滤；高浓度茶：40g绿茶加入100度蒸馏水1000ml，浸泡30分钟，用两层纱布过滤。
1.2.2.3 枳椇子：由张江孙桥饮片厂提供。枳椇子水煎剂制备：枳椇子25g，加200ml水煎煮1.5小时，纱布过滤，滤渣加200ml水煎煮1小时，过滤，两次滤液合并。提取液含生药62.5mg/ml。[1-4]
1.2.2.4 尿蛋白测定试剂盒（考马斯亮蓝法）；尿素氮试剂盒-BUN(OPA法)；肌酐试剂盒-CRE(苦味酸不除蛋白法)。
1.3实验方法：
1.3.1 预实验：以0.25ml/20g，0.30ml/20g，0.35ml/20g 56度红星二锅头分别对三组小鼠进行灌胃，每组5只。观察令小鼠出现翻正反射消失而无小鼠死亡的所需酒量。找出最佳致醉量为0.30ml/20g。[5-6]
1.3.2 动物分组：称重后，按体重将105只小鼠随机分为6组，空白对照组、模型组、枳椇子组，每组17只；低浓度茶、中浓度茶、高浓度茶组，每组各18只。每日11点开始灌胃，连续7天。
1.3.3 给药量见下表1。
表1 酒后饮绿茶给药量方法
组别第一次灌（0.15ml/10g）20min后再灌
空白组0.9％生理盐水0.9％生理盐水0.2ml/10g
造模组白酒0.9％生理盐水0.2ml/10g 枳椇子组白酒枳椇子水煎剂0.2ml/10g
高浓度茶组白酒高浓度茶0.2ml/10g
中浓度茶组白酒中浓度茶0.2ml/10g
低浓度茶组白酒低浓度茶0.2ml/10g
注：每日灌白酒的量相当于成人每天饮用三两酒的量。
1.4生化检测及病理检查
第8天以小鼠代谢笼法搜集尿样，并断头取血，取肾脏。样品由上海中医药大学附属曙光医院检验科检测生化指标：尿蛋白、血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）；由曙光医院病理实验室制作病理切片。
1.5统计方法：
计量资料以均数±标准差表示；计数资料用百分率表示。资料经正态性检验和方差齐性检验后，再进行方差分析和LSD检验；以及采用Log-rank检验，用SPSS12.0统计软件
2 结果
2.1.各组小鼠实验中的死亡情況和各组生存曲线比较的Log-rank检验。见表2。
表2 各组小鼠实验中的死亡情況
组别实验
前第1
天
第2
天
第3
天
第4
天
第5
天
第6天第7天死亡率
(%)
正常
组
17 0 0 1 1 0 0 0 11.7
模型
组
17 3 1 0 1 0 0 1 35.3
阳性对照
组
17 4 2 3 1 0 1 1 70.5 高浓度茶
组
18 6 1 1 0 0 2 3 72.2
中浓度茶
组
18 7 2 2 0 2 0 0 72.2 低浓度茶
组
18 3 4 2 1 1 1 1 72.2 合计105 23 10 9 4 3 4 6 56.2 注:各组间有显著差异: P<0.05.
表3 各组生存曲线比较的Log-rank检验结果
组别n 平均生存时间（天）95%可信区间生存率(%)
正常
组
17 6.59 6.05～7.13 88.24
模 型
组
17 5.47 4.19～6.75 64.71 阳性对照
组
17 4.22 3.01～5.43 33.33 高浓度茶
组
18 4.39 3.07～5.71 27.78 中浓度茶
组
18 3.44 2.22～4.61 27.78 低浓度茶
组
18 4.11 2.96～5.27 27.78 合 计 105 44.34
Log-rank 检验结果：χ2=20.39，df=5，P=0.0011。
图2 各组动物生存曲线的比较
2.2 各组小鼠尿液中尿蛋白含量比较 见表4。
表4 各组小鼠尿液中尿蛋白含量比较（μmol/l ）
组 别 ｎ 尿蛋白 正 常 组 5 1.32±0.51#
模 型 组 5 0.73±0.17*
枳 椇 子组 5 1.01±0.39
高浓度茶组 5 0.72±0.27*
中浓度茶组 5 0.640±.13*
低浓度茶组 5 1.320±.65#
合 计 30 0.950±.39
注：*表示与正常组比较ｐ<0.05；#表示与模型组比较ｐ<0.05
S
X 正 常 組
模 型 组
枳椇子组
高浓度茶组
中浓度茶组
低浓度茶组
2.3各组小鼠血肌酐（Cr）含量比较见表5
组别n Cr
正常组 4 34.2527.96
模型组 2 17.50±0.71
枳椇子组0 0.00±0.00
高浓度茶组 4 27.751±2.84
中浓度茶组0 0.00±0.00
低浓度茶组 2 20.50±0.71
合计12 27.001±7.37
注：n为0，说明该组小鼠血肌酐值不在测定范围，没有测出来。
根据专业知识得到血肌酐应该是服从正态分布的资料，但是，本次试验有的组别因未能测到血肌酐，同时，各组样本量比较少，而且个体差异也比较大，经方差分析得出各组间无显著差异。仅作参考。
2.4肾脏病理切片结果：
正常小鼠肾组织（10×10）
低倍镜下肾组织结构完整，肾小球、肾小管
未见异常，间质血管可见
正常小鼠肾组织（10×40）
高倍镜下肾小球、肾小管结构基本正常，间
质未见炎性充血
低浓度茶组小鼠肾组织图（10×10）低倍镜下肾小球、肾小管未见明显病变、但
S
X
间质血管扩张充血明显
低浓度茶组小鼠肾组织图（10×40）
高倍镜下见肾小球有较多量红细胞漏出，
肾小管上皮未见水肿、间质血管扩张充血
较明显，可见有炎症反应，但间质未见纤
维化
中浓度茶组小鼠肾组织图（
10
×10）
低倍镜下肾组织结构完整，肾小球、肾小管
未见明显病理变化，间质未见明显充
中浓度茶组小鼠肾组织图（10×40）
高倍镜下见肾小球有少量红细胞漏出，肾小
管未见明显病变、间质血管少量充血，未见
纤维化。
高浓度茶组小鼠肾组织图（10×10）
与中浓度茶组类似，未见明显差异
高浓度茶组小鼠肾组织图（10×40）
与中浓度茶组类似，未见明显差异
枳椇子组小鼠肾组织图（10×10）
低倍镜下肾组织结构基本完整，肾小球、肾
小管未见明显病理变化，间质少量充血
枳椇子组小鼠肾组织图（10×40）
高倍镜下见肾小球有少量红细胞漏出、间质
血管未见明显充血，间质未见纤维化
模型组小鼠肾组织图（10×10）
低倍镜下肾小球、肾小管未见明显病变、但
间质血管扩张充血较明显
模型组小鼠肾组织图（10×40）
高倍镜下见肾小球有较多量红细胞漏出，间
质血管扩张充血较明显，可见有炎症反应，
间质未见纤维化（7）
2.5饮酒人群流行病学问卷调查结果：
调查总人数138人，喝酒人135人。喝酒人群中用茶来解酒的有52人，占38.52%。知道茶能解酒的有46人，占喝酒人群的34.07%，其他解酒方式有催吐、吃水果、解酒药、吃饭、睡觉、喝饮料、休息，其中，催吐13.04%；吃水果解酒18.12%；解酒药5.80%；其他28.99%。真正了解饮酒后用茶解酒是否对肾脏有损伤的人为0%。
3讨论
3.1 从各组小鼠实验中的死亡情况来分析：实验的前4天，小白鼠死亡率较高，可能与其体质有关，个体差异较大，实验动物选择小鼠，生命力较脆弱，对高度酒精的耐受能力较差。空白组的死亡率又明显低于其他各组，也与所给药物对小鼠的作用有关。
通过各组生存曲线比较的Log-rank检验结果可说明各组的生存曲线有显著的差异，饮酒后无论饮高、中、低浓度的茶，都可导致小鼠的死亡，尤其是中浓度组的平均生存时间低于其他任何组别，其次是低浓度组。这说明酒后饮中、低浓度的茶对小鼠的健康很不利，而高浓度茶组的生存时间相对于中、低浓度组较长一些，这一结果与病理切片所得结果的判断是一致的。
在造模方面，我们查到的文献中，小鼠多用于做酒精中毒的急性实验，其实验周期多为1-3天，大鼠多用于做慢性酒精毒理实验，实验周期多为1-4个月。我们的实验周期为八天，介于两者之间，由于实验时间及经费的限制条件，我们选择小鼠造模，而小鼠耐受酒精的能力较差是本实验中死亡率高的重要原因。
3.2由尿蛋白按检测结果得出：正常组与阳性组、低浓度组无差别；中、高浓度组，造模组低于正常组。根据这一结果，可推测：⒈适量饮酒有助于降低蛋白在肾脏的滤过率，酒后饮用浓茶，此效应更显著；⒉低浓度茶与枳椇子一样，具解酒的功效，中、高浓度茶无；
⒊饮酒及酒后饮中、高浓度茶有利尿作用，但小便清长，排出的杂质减少（由尿蛋白及尿量推测，尚需实验进一步证明）。
3.3按病理切片结果得出：饮低浓度茶和解酒的枳椇子水煎剂对肾脏有害无益，我们推测其损伤机制如下：酒精首先在肝脏内进行代谢，在氧化酶的作用下先是被氧化为乙醛，进而被氧化为乙酸，乙酸又可进一步被氧化为二氧化碳和水，再分别经肾和肺排出。茶的主要成分茶碱有利尿作用，大量茶碱更能迅速发挥利尿作用，促使尚未分解的乙醛过早地进入肾脏，而乙醛对泌尿系统有很大的损害作用。有关报道指出，茶中的有效成分茶多酚确实可以用于治疗慢性肾脏的疾病。[8-9] 我们推测：中高浓度茶中的茶多酚含量较多，能有效的保护肾脏使其受到损伤的程度降低，但没有很好地解酒功效。但由于实验周期短，各组小鼠肾脏均未出现纤维化。
3.4结论
根据尿蛋白、实验小鼠的生存曲线分析、肾脏的病理结果的一致性得出：⒈酒后饮茶均可导致小鼠的死亡，但是酒后高浓茶可降低蛋白在肾小球的滤过率，对肾脏的损害作用最小。⒉酒后饮淡茶及阳性解酒药枳椇子能起到一定解酒作用，但对肾脏有明显的损害。但本次实验由于死亡率高致样本含量不够，确切的结论有待继续研究。建议过量饮酒后,
不宜使用茶及能加速酒精不完全代谢产物排出的解酒药，会对肾脏造成损伤。但本次试验由于死亡率高致样本含量不够，确切的结论有待继续研究。
3.5存在问题和改进措施
3.5.1实验动物选择小鼠，生命力较脆弱，对高度酒精的耐受能力较差。在实验中的死亡率较高。建议以后用大鼠进行此项实验。实验中一些可能影响结果、引起死亡的因素，如：学生灌胃技术不熟练引起死亡、群养的老鼠生活环境温暖，而代谢笼中的老鼠可能由于孤单、环境寒冷、酒精的作用，导致代谢笼中有老鼠死亡。
实验第一天灌胃后，见死亡率高，我们考虑到可能是酒量太大，后面几天的酒量按0.10ml/10g灌胃。
3.5.2预实验时间过短，只测出酒精的最佳致醉量，未考虑到造模是否稳定，小鼠是否能长时间（实验周期为八天）耐受酒精，以至于出现较高的死亡率。
3.5.3阳性对照组的死亡率也很高，这与药物的来源、药物的制备是否科学有关。
3.5.4各个浓度的茶的浓度界定不是很精确，每天制备的环境、条件有差异，也可能造成实验结果的偏差。应该选用倍比稀释的方法更为科学。
3.5.5实验中代谢笼的数量有限，只有三十个，导致最终的实验检验的指标的样本含量相对较少，使结果的可信度降低。
3.5.6代谢笼的网眼过大，使第一天和第二天搜集到的尿样中混有食物残渣，导致搜集的尿液无法用于检测。在最后一天搜集尿样时，我们采取了给小鼠禁食的方法，收集到了较纯净的尿液，符合检验样本的标准。此外，有老鼠从代谢笼中逃跑的现象。建议实验
前对代谢笼的结构进行调整。
3.5.7小鼠的血量小，加上经过8天的酒精试验，小鼠本身的状态不稳定，取血时遇到一定的困难，腹主动脉较细小，取血量少，之后采用断头处死取颈动脉血，采集到的血量也少，在1ml左右。送检时离心血浆量只有几百微升，以至于血肌酐和血尿素氮这两项指标的检测数据很不理想。此外，曙光医院检验设备的测定范围是以人的指标范围为标准的，小鼠的血肌酐和尿素氮的测定，部分不在此范围，对我们最终结果的统计分析有影响。
3.5.8标记小鼠不够清楚，用苦味酸做的黄色标记最后模糊掉了，具体代表号码全然不知，之后我们改用胶布贴在老鼠身上作标记，但老鼠在代谢笼中活动时，会将胶布蹭掉。
3.5.9我们选取的酒精灌胃剂量可能正好是健康饮酒的范围，不仅对肾脏没有损伤，反而还起到一定的保护作用。
参考文献：
[1] 孙法光，王宏．枳椇饮水提取物对小鼠急性酒精中毒的保护作用．承德医学院学报，2006，23（1）：81--82
[2] 梁赅，詹莉，汪晖，等．人参和枳椇子对小鼠乙醇急性中毒保护作用及其机制研究．医学新知杂志2006，16（2 ）
[3] 于斌如，汤银红．枳椇子的研究进展．时珍国医国药．2004，15（9）
[4] 时涛，王晓玲，陈振德，等．枳椇子化学成分及其药理活性研究进展．中药材．2006，29 （5 ）5
[5] 张健，张惟广，谢非．饮酒、醉酒及解酒．酿酒．2001，28（9）5
[6] 史红霞，张国庆，丁书文．解酒中药缓解长期白酒灌胃致大鼠生殖系统影响的作用研究．浙江中医杂志．2006，41（9）9：529--531
[7] 王会玲，张金元，等．马兜铃酸对大鼠肾功能和肾脏组织病理的影响．中药新药与临床药理．2006，17（9）5 ：331--335
[8] Shao-hua SHI,Shu-sen ZHENG,Chang-ku JIA,ect．Inhibitory effect of tea polyphenals on transforming growth factor-β1 expression in rat with cyclosporine A-induced chronic nephrotoxicity．Shi SH et al/Acta Pharmacal Sin．2003 Jan; 25(1): 98-103
[9] 杨钧，张艺芳．解酒茶长期毒性实验研究．医学信息．2003，9（16）9：525-527
致谢
感谢上海中医药大学为我们提供这样一个能充分锻炼我们科研能力，令人十分珍惜的自主设计的探索性实验机会。
感谢预防医学教研室黄品贤老师对整体实验及论文书写的指导。
感谢动物实验中心汤家铭老师为我们提供小鼠代谢笼，否则小鼠尿液难以收集；感谢教学实验中心尤银珍老师为我们准备器材和实验用品；感谢病理教研室卫洪昌教授为我们提供部分实验器材和药品。
感谢病理教研室李素云老师指导我们进行病理切片结果分析。
感谢上海中医药大学附属曙光医院检验中心、病理实验室为我们的实验结果提供检测和病理切片制作。
急性肝损伤模型的研究进展
急性肝损伤模型的研究进展 作者：刘彦双朱淑霞王永利作者单位：050200 河北省石家庄市卫生学校（刘彦双）;河北武警总队医院（朱淑霞）;河北医科大学药理教研室（王永利） 【关键词】急性肝损伤 肝损伤实验动物模型的复制是进行防治肝损伤药物研究的前提。目前，肝损伤动物模型的复制主要有生物性、免疫性、化学性等方法，生物学方法要求实验条件高且费用昂贵，限制了应用。免疫方法是造成免疫肝损伤，主要用于通过免疫机制而抗肝损伤的药物研究。化学方法则是通过化学性肝毒物质，如四氯化碳、氨基半乳糖、硫代乙酰胺、黄曲霉素等致肝损伤。在我国卫生部颁布的《中药药理实验指导原则》中明确指定应用四氯化碳和氨基半乳糖肝损伤动物模型进行保肝降酶新药的药理实验，应用四氯化碳和氨基半乳糖复制肝损伤动物模型，条件要求低，技术易于掌握，可靠性强，重复性好，是其他任何肝损伤模型无法比拟的，故目前研究抗肝损伤新药常采用四氯化碳和氨基半乳糖复制动物模型。 1 化学性肝损伤动物模型 1.1 四氯化碳性肝损伤四氯化碳（CCl4 ）溶于精致植物油，配制0.1%浓度，按10ml.kg小鼠腹腔注射，12～24h后处死动物。测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红质（TB）、总蛋白（TP）、白蛋白（A）、，肝匀浆脂质过氧化物（LPD）或丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）或还原性谷胱甘肽（GSH）等反映肝功能及脂质过氧化的指标，并进行组织病理学检查。 关于CCl 4 肝毒的作用机制，存在多种假设，但都一致公认，自由基的形成及引发的链式过氧化反应是其主要机制。CCl 4在体内可经肝微粒体细胞色素P450 代谢激活，生成两个活性自由基（CCl 3 O 2 和Cl）及一系列氧活性物，可与肝细胞质膜或亚细胞结构的膜脂质发生过氧化反应，膜磷脂大量降解，从而破坏细胞膜结构完整性，引起膜通透性增加，最终导致肝细胞死亡［1］。另外，CCl 4 的代谢产物能迅速与细胞成分如胞内脂质、蛋白、核脂质、核蛋白和DNA等多种大分子发生不可逆的共价结合而导致细胞死亡，特别是当自由基作用于DNA时，损伤核糖和碱基，使核酸直接破坏引起DNA链的断裂或DNA 链与蛋白间交联，影响其信息传递功能以及转录和复制特性。在CCl 4 代谢产物引起的脂质过氧化物和共价结合的双重作用下，导致膜脂质流动性降低、钙泵抑制、谷胱甘肽活性抑制、肝微粒和线粒体功能丧失、肝细胞内钙稳态失调及代谢紊乱，引起肝细胞损伤加剧［2］。 1.2 D-氨基半乳糖性肝损伤用生理盐水配制成100g.L的D-氨基半乳糖 （D-galactosanine，D-GalN）溶液，大鼠或小鼠腹腔注射600～900mg.kg，造成急性肝损伤模型，染毒24-48h后处死动物，检查肝功能、病理及脂质过氧化指标［3，4］。Keppler 首先于1968年应用D-GaLN制备大鼠肝损伤模型。D-GaLN在肝细胞内代谢，首先与尿苷酸（UDP）结合成尿苷二磷酸半乳糖（LIDP-GalN），并在肝细胞内聚集，由于这种结合的速度大大超过尿苷酸的生物合成速度，致使尿苷酸耗竭，进而导致依赖其进行生物合成的核酸、糖蛋白和糖脂等物质减少，限制了细胞器的再生及酶的生成和补充，使细胞器受损，肝细胞的结构和功能均出现异常，甚至死亡。另外D-GaLN还可以引起肝细胞内Ca 2+ 增多，
大鼠早期酒精性肝损伤诱导模型的建立及观察
大鼠早期酒精性肝损伤诱导模型的建立及观察[摘要目的探讨大鼠早期酒精性肝损伤模型的建立方法，为研究早期酒精性 肝损伤的发病分子机制提供理想动物模型。方法24只雄性SD大鼠随机分为模型组（16只）和对照组（8只）。对照组饮用自来水；模型组饮用7%～56%梯度递增的白酒12周。取材前24 h和12 h，分别以56%白酒急性灌胃后处死大鼠。每天记录大鼠食用饲料量及饮用量；每周称量大鼠体重。采用全自动生化分析仪测定大鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）含量。观察大鼠肝脏病理学和形态学改变。结果12周后，模型组大鼠体重增长率为（61.67±1.98）% ，明显低于对照组的（160.09±3.12）% （P＜0.05），肝脏指数模型组（3.74±0.54）高于对照组（2.85±1.26）（P 32%～65%；F3：>65%～75%；F4>75%。 1.3.6.2酒精性肝炎依据炎症程度分为4级（G0～G4）：G0无炎症；G1腺泡3带呈现少数气球样肝细胞，腺泡内散在个别点灶状坏死和中央静脈周围炎；G2腺泡3带明显气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死增多，出现Mallory小体，门管区轻至中度炎症；G3腺泡3带广泛的气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死明显，出现Mallory小体和凋亡小体，门管区中度炎症伴和（或）门管区周围炎症；G4融合性坏死和（或）桥接坏死。 1.3.6.3酒精性肝纤维化依据纤维化的范围和形态分为4期（S0～S4）：S0无纤维化；S1腺泡3带局灶性或广泛的窦周/细胞周纤维化和中央静脉周围纤维化；S2纤维化扩展到门管区，中央静脉周围硬化性玻璃样坏死，局灶性或广泛的门管区星芒状纤维化；S3腺泡内广泛纤维化，局灶性或广泛的桥接纤维化；S4肝硬化。 1.4统计学方法 采用SPSS 14.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；等级资料比较采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1一般情况 各组大鼠均无死亡。对照组大鼠活泼，毛发光泽，食量正常。模型组食欲减退，毛色发黄，光泽度差，部分大鼠精神状态较差。模型组饮用液体量和食量均比对照组少。 2.2两组大鼠体重增长率及肝脏指数的比较 模型组与对照组体重均有上升，与对照组比较，模型组体重增长较慢，后期
酒精性肝损伤和氧化应激
诱导肝脏产生TNF-α过程是急性酒精中毒氧化应激一个关键因素 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的生产是酒精性肝损伤的发病机制中的一个关键因素。氧化应激和内毒素在酒精诱导的肿瘤坏死因子生产过程中都有涉及。然而，这些因素之间的因果效应的关系没有得到充分的定义。目前的研究，一般使用的急性酒精肝损伤的小鼠模型用来确定急性酒精中毒诱导的TNF-α产生的关键因素。 酒精的灌胃剂量为6克/公斤剂量129/Sv，由测量蛋白质水平，免疫组化，和mRNA表达来证明能诱导肝脏Kupffer细胞产生的TNF-α。酒精中毒引起的肝损伤与血浆内毒素和肝脏脂质过氧化增加相关。用内毒素中和蛋白来治疗可以显著抑制酒精诱导血浆内毒素的高度，肝脂质过氧化和抑制TNF-α产生。治疗通过使用抗氧化剂，N -乙酰- L -半胱氨酸，或二甲基亚砜，虽然不能降低血浆内毒素的高度，但可以显著防止酒精引起的肝脂质过氧化反应，TNF-α产生和脂肪变性。这些所有的治疗可以防止酒精引起的肝脏坏死性细胞死亡。 因此，本研究将系统区分血浆内毒素升高，肝氧化应激，急性酒精中毒导致TNF-α产生之间的关系，结果表明，氧化应激在急性酒精中毒中介导了内毒素诱导的肝TNF-α产生 饮酒所致的肝脏疾病在美国的疾病和死亡中为首要原因。虽然有些药物已经用于预防和治疗酒精性肝病的实验模型或诊所试验评估，目前有没有FDA批准的治疗方案。对酒精诱导的细胞损伤的发病机制的调查可能会提供开发新疗法的基础。现已提出一些有关酒精导致细胞损伤的机制的假设中，氧化应激和促炎细胞因子的生产，被公认的首先的致病因素。 酒精代谢的主要途径存在于肝脏，位于不同的亚细胞间隔的每个细胞质，微粒体的乙醇氧化系统的内质网中的酒精脱氢酶和在线粒体中的醛氧化酶.所有三个结果会产生活性氧（ROS），包括超氧阴离子，羟基自由基和过氧化氢。当氧化应激发生在肝脏，细胞的抗氧化能力是在足以应付与活性氧的积累的。 酒精引起的肝脏氧化应激已反复检测ROS的来证明，在这病人和动物的模型中通过测量脂质过氧化反应和氧化应激标志物。积累在肝脏中的ROS被发现会导致细胞膜的功能系统障碍，蛋白质和DNA的氧化，最终导致肝细胞损伤。 炎性细胞因子如TNF-α在酒精性肝炎的启动和发展发挥了关键作用。Kupffer细胞是TNF-α当肝脏中出现酒精后的主要来源。有人曾建议，酒精介导内毒素（脂多糖，LPS）来引起的TNF-α产生，同时增加血浆内毒素水平和TNF-α表达已被反复报道于那些酗酒的患者。研究报告已经证明内毒素在Kupffer细胞上复杂的结合LPS CD14/toll样受体4引起NF-kB 激活和TNF-α的表达。 在内毒素的作用已被研究很多的时，氧化应激在酒精诱导的TNF-α表达也发挥了重要作用。肝脏灌注的研究表明，Kupffer细胞在急性酒精中毒和恢复期的早期阶段主要负责肝脏超氧化物歧释放。许多报告提出的假说认为酒精引起的活性氧不仅作为有毒物质，但也通过刺激激活氧化还原反应敏感的核转录因子NF -κB，进而导致TNF-α的信号转导，有越来越多的证据TNF -α信号在肝细胞中通过电子传递链导致线粒体ROS生成增加，.然而氧化应激是否反映了酒精诱导的TNF-α产生或作为一个内毒素诱导的TNF-α产生的重要因素仍存在争议。因此，本研究在急性酒精性肝损伤的小鼠模型之间内进行定义内毒素，氧化应激和TNF-α的关系。
肝损伤动物模型的建立和应用
万方数据
万方数据
肝损伤动物模型的建立和应用 作者：王福根， 孙静霞 作者单位：浙江杭州市第六人民医院,杭州市,310014 刊名： 中国药房 英文刊名：CHINA PHARMACY 年，卷(期)：2006,17(9) 被引用次数：12次 参考文献(10条) 1.Xu JQ;Lee G;Wang HM Limited role for CXC chemokines in the pathogenesis of a-naphthylisothiocyanate-induced liver injury[外文期刊] 2004(03) 2.黄正明;杨新波;曹文斌化学性及免疫性肝损伤模型的方法学研究[期刊论文]-解放军药学学报 2005(01) 3.Ayoub SS;Botting RM;Goorha S Acetaminophen-induced hypothermia in mice is mediated by a prostaglandin endoperoxide synthase 1 gene-derived protein[外文期刊] 2004(30) 4.Yasuda M;Okabe T;Itoh J Differentiation of necrotic cell death with or without lysosomal activation:application of acute liver injury models induced by carbon tetrachloride(CCl4) and dimethylnitrosamine(DMN)[外文期刊] 2000(10) 5.Horn TL;Bhattacharjee A;Schook LB Altered hepatis mrna expression of apoptotic genes during dimethylnitrosamine exposure[外文期刊] 2000(02) 6.Wang T;Shankar K;Ronis M Potentiation of thioacetamide liver injury in diabetic rat is due to induced CYP2E1[外文期刊] 2000(02) 7.Kin WH;Hong F;Radaeva S Statl plays an essential role in LPS/ D-galactosanine-induced liver apoptosis and injury 2003(06) 8.Kaneko Y;Harada M;Kawano T Angmentation of Va14NKT cell-mediated cytotexicity by interleukin4 in an autocrine mechanism resulting in the development of concanavalina-indued hepatitis[外文期刊] 2000(01) 9.赵冬梅;刘耕陶双环醇对刀豆蛋白A所致小鼠肝细胞核DNA损伤保护作用[期刊论文]-中华医学杂志 2001(14) 10.邱英锋;缪晓辉;蔡雄卡介苗加脂多糖建立的大鼠急性免疫性肝损伤模型的研究[期刊论文]-西北国防医学杂志2004(05) 本文读者也读过(4条) 1.王志彬药物性肝损害的特点分析-附70例报告[期刊论文]-医学信息（下旬刊）2010,23(9) 2.吴玉强.邓家刚.钟正贤.杨兴.WU Yu-qiang.DENG Jia-gang.ZHONG Zheng-xian.YANG Xing铁包金提取物抗肝损伤作用的研究[期刊论文]-时珍国医国药2009,20(4) 3.禄保平.白娟.江若霞.Lu Baoping.Bai Juan.Jiang Ruoxia以常用中西药物建立药物性肝损伤动物模型的分析与探讨[期刊论文]-河南中医学院学报2008,23(4) 4.马丽娜.华碧春药物性肝损伤动物模型研究进展[期刊论文]-亚太传统医药2011,07(2) 引证文献(12条) 1.徐伟.宋倩倩.苗双.刘宁宁.马健.王振勇青蒿素对CCl4致犬急性肝损伤模型抗氧化指标的时效影响[期刊论文]-兽药与饲料添加剂 2009(4)
酒精性肝损伤的基础医学研究进展
酒精性肝损伤的基础医学研究进展 发表时间：2018-07-16T14:02:39.033Z 来源：《中国误诊学杂志》2018年第12期作者：季福水 [导读] 随着人们生活水平的持续提升，人们的生活质量有了显著的改善。 天津市静海区医院天津静海区 301600 摘要：随着人们生活水平的持续提升，人们的生活质量有了显著的改善。因此部分人群在生活中都会饮用一些酒精类的饮品，以促进自身生活品质的提升。但是部分人群由于对于酒精的依赖性程度越来越高，致使自身的身体健康受到了酒精的严重影响，从而导致自身的肝脏器官受到了严重的损伤，最终形成了酒精性肝损伤的疾病。这种疾病不仅影响了自身的生活质量，同时也对自身的身体健康也有着严重的影响，因此为了避免自身受到疾病的严重影响，需要采取有效的措施进行疾病的治疗。本文主要对酒精性肝损伤的病理变化、发病机制以及治疗方式进行了深入的分析，从而通过这种方式，促使人们减少受到酒精性肝损伤的影响，促进自身身体健康状态的恢复。 关键词：酒精性肝损伤；基础医学；研究进展 引言 随着人们生活质量的显著提升，我国人民对于酒精类饮品的需求量越来越高，并且在酒精类饮品的消费方面也有了显著的提升。无论是在红白宴上，还是在日常聚会上，人们对于酒精类的饮品都有着极高的需求量。虽然酒精类的饮品对于气氛的调节有着极大的促进作用，但是如果人们在生活中长期大量饮用酒精类的饮品，就会造成人体中多中器官功能受到严重的损伤，尤其是酒精性肝损伤方面的问题，会对人体的肝脏器官的正常使用造成严重的影响。根据相关人员所进行的研究显示，在我国患病人口之中，酒精性肝病占同期住院肝病患者构成比呈逐年上升趋势。以此表明，酒精已成为继病毒导致肝损伤后的第二大因素，酒精性肝病也成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，对于人们的身体健康有着严重的影响。因此，为了帮助酒精性肝损伤患者进行疾病的治疗，对酒精性肝损伤进行相应的研究和治疗已成为基础医学的热点。本文主要对酒精性肝损伤的病理变化、发病机制以及治疗方式进行了深入的研究，并且取得了良好的研究成果，研究成果如下： 1.酒精性肝损伤的病理变化 在酒精性肝损伤方面的疾病之中，常见的酒精性肝病主要包括了脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化等方面的疾病，对于人体肝脏的正常运行拥有着极大的影响。而这其中，酒精性肝硬化作为酒精性肝损伤疾病的最终病变形式，又称为门脉性肝硬化。通常情况下，医护人员在对酒精性肝硬化患者进行疾病的治疗期间，都会通过肉眼观察的方式作为治疗疾病的主要步骤进行疾病的治疗工作。根据医护人员所进行的观察显示，酒精性肝硬化患者的肝脏在早中期的阶段会以肝脏体积正常或略大的形式展现在人们的眼前，并且经过触摸后发现肝脏器官会出现质地较硬的问题[1-2]。这种问题如果不进行合理而有效的解决，就会导致患者疾病严重程度的提升。等到了疾病的晚期阶段，肝脏体积就会持续缩小，并且疾病在发展的过程中会导致人体的肝脏逐渐呈现褐色的颜色状态。并且疾病在发展的过程中，肝切面可见弥漫性分布大小较为一致的肝结节，结节直径一般不会超过1.0厘米，并且呈黄褐色或黄绿色。病变如果进一步发展，结节内的肝细胞会因为缺血而坏死，并且疾病会呈现继续发展的态势持续恶化，纤维间隔不规则增宽，结节变得大小不一，会对人体造成极大的损伤[3]。因此为了帮助患者进行疾病的治疗，医护人员在对患者进行疾病的治疗期间，需要做好酒精性肝损伤的发病机制的研究工作，进而根据患者的发病机制做好患者疾病的治疗工作。 2.酒精性肝损伤的发病机制 人体肝脏器官之中含有大量的乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase，即ADH）和微粒体乙醇氧化酶系统（microsomal ethanol oxidizing system，即MEOS），这些物质在人体的肝脏之中会对肝脏起到一定的保护作用[4]。人们在饮用酒精类的饮品的过程中，酒精类的饮品之中的酒精就会因为乙醇脱氢酶和微粒体乙醇氧化酶系统的作用而发生氧化代谢，主要中间代谢产物为乙醛，乙醛进一步在乙醛脱氢酶的作用下生成乙酸，最终代谢出二氧化碳和水这两种产物，并不会对人体造成损害[5-6]。但是人们在生活中如果饮用了大量的酒精类的饮品，就会导致人体在酒精的影响之下出现酒精性的肝病。这种疾病会对人体的肝脏造成严重的损害，会因为乙醇及其衍生物乙醛的代谢过程中直接或间接的影响，从而诱导出炎症反应、氧化应激、肠源性内毒素、炎性介质和营养失衡等方面的问题，其发病机制主要包括了脂质过氧化、氧化应激及枯否氏细胞的激活等。脂质过氧化与氧化应激是酒精性肝损伤的发生中两个重要的机制。肝细胞氧化应激、脂质过氧化和被激活的枯否氏细胞加重氧化应激，致使肝细胞氧化和抗氧化力量失衡，若不对这些问题进行合理的解决，就会导致人体的肝病问题的持续严重、。 如果人体肝脏器官在发展的过程中受到大量酒精的影响，就会因为肠道菌群繁殖过度等方面问题的影响，致使人体的炎性细胞出现被激活的问题，使其释放大量的TNF-α、TGF-β、IL-1、血小板活化因子和前列腺素等不同形式的细胞因子和炎性介质。若不对这些问题进行合理而有效的解决，就会导致人体的肝脏出现进一步的损伤情况和纤维化方面的问题，并且在疾病发展过程中还会出现脂质沉积方面的问题，并且TNF-α可诱导4-HNE致敏的肝细胞产生细胞毒作用，从而诱导肝细胞死亡，可能是导致酒精性肝损伤的一个新机制[7-8]。因此医护人员在对酒精性肝损伤患者进行疾病的治疗时，为了促进患者身体健康情况的改善，需要采取有效的治疗方式对患者进行疾病的治疗。 3.酒精性肝损伤的治疗方式 根据酒精性肝损伤患者的病理变化和发病机制，医护人员需要采用积极而有效的措施对患者进行疾病的治疗，主要方式包括了以下几个方面。 3.1采取有效的戒酒措施进行疾病的治疗 根据相关人员所进行的治疗研究显示[9]，部分患者之所以会出现酒精性肝损伤方面的疾病，主要是因为患者在生活中饮用了大量的酒精类饮品导致的。因此为了帮助患者进行疾病的治疗，医护人员在治疗期间需要明令禁止患者饮用大量的酒精类饮品。长期大量饮酒会导致患者在生活中形成的酒依赖及慢性酒精中毒，不仅对自己的躯体，神经系统，心理状态带来恶劣影响，同时还会影响家庭关系，夫妻关系，还会带来一系列工作和社会问题。因此为了帮助患者改善自身的问题，需要采取有效的措施帮助患者进行戒酒。而在戒酒的过程中，可以通过个人的意志力进行个人强制治疗。要想成功戒除酒疾，就需要患者在治疗的过程中拥有极强的意志力，而且患者本人愿意配合戒
酒精性肝病的发病机制
６９０堂丛壁望坚型』坐堂蔓！！塑塑！！！型：！！：竺竺！婴：！！！！！：型Ｊ 酒精性肝病的发病机制 厉有名 【关■调】肝疾病，酒精性。发病机制一 Ｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｏｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆａｌｃｏｈｏｌｉｃｌｉｖｅｒｄｌｓｅａｓｔｓ．ＬＩＹｏｕ—ｒｕｉｎｇ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ｜Ａｌｃｏｈｏｌｉｃｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ［Ｆｉｒｓｔａｕｔｈｏｒ“ａｄｄｒｅｓｓ］ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．ＦｉＢｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ。ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１０００６．Ｃｈｉｎａ １．肝脏酒精代谢产物损伤：（１）乙醛的化学性损害：机体摄人的酒精９０％咀上在肝脏代谢，经过乙醇脱氢酶，肝微粒体乙醇氧化酶系统和过氧化氢酶氧化成乙醛，乙醛可损害各种细胞器和酶的结构功能；又能刺激免疫系统，诱发免疫反应性肝损害ｔ损害线粒体脂肪酸的日氧化，引起脂质过氧化反应，抑制谷胱甘肽（ＧＳＨ）的生物台成，减弱超过氧化物酶等抗氧化功能。（２）氧化还原反应的改变：酒精氧化引起氧化型的辅酶Ｉ（ＮＡＤ’）向还原型辅酶Ｉ（ＮＡＤＨ）转变，导致ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比例增加，进而影响了ＮＡＤ＋依赖的过程如脂质和糖的代谢。过多的还原型等价物通过促进脂肪酸合成并抑制其氧化，引起甘油三酯在肝细胞内沉积。ＮＡＤＨ也抑镧了草酰乙酸、丙酮酸、磷酸二羟丙酮和糖原合成酶的活性，进而干扰了糖原异生过程，导致患者低血糖症。氧化还原状态的改变和代谢紊乱是酒精代谢过程中的的急性改变，戒酒后可以逆转。而慢性嘈酒者因肝细胞的损害和阻止ＮＡＤＨ向ＮＡＤ＋的再氧化而延缓其逆转过程。（３）氧应激与脂质过氧化：酒精在肝细胞内通过细胞色素Ｐ４５０ｌＩＥ１（ＣＹＰ２ＥＩ）和酒精脱氢酶介导氧化形成很多自由基，包括羟乙基、超氧阴离子（Ｏ：）和羟基（ＯＨ），它们对细胞内物质产生氧化损伤。过多的ＮＡＤＨ促进铁蛋白向铁的转换，而铁在还原状态可与过氧化氢结台形成羟乙基；肝内炎症细胞也能产生过氧化物引起氧应激－酒精亦可自发的或通过其他途径激活库普弗细胞和嗜中性粒细胞产生过氧化物。自由基攻击不饱和脂质启动脂质过氧化反应，饮食中加人多不饱和脂肪酸可增强脂质过氧化，而多不饱和脂肪酸本身是ＣＹＰ２Ｅ１的诱导剂。并对肝细胞膜脂质沉积有叠加效应。酒精诱导的脂质过氧化反应和肝脏损害可因加入ＣＹＰ２ＥＩ而缓解。丙二醛和壬烯是两个强毒力的脂质过氧化终产物，常作为判断脂质过氧化的指标。它们可促进库普弗细胞与肝细胞释放细胞因子，并共同进一步介导肝细胞死亡、Ｍａｌｌｏｒｙ小体形成、肝星状细胞活化和肝纤维化形成。ＤＮＡ和脂质一样对氧应激很敏感。氧化剂可引起线粒体ＤＮＡ缺损和突变．进而导致线粒体功能障碍。慢性酒精摄人可导致肝内很多抗氧化剂如维生素Ａ、维生紊Ｅ和谷胱甘肽等耗竭。１４）线粒体损害：肝细胞线粒体肿胀是酒精性肝病特征作者单位：３１０００３杭州，浙江大学医学院附属第一医院 ?临床精萃? 病理之一。约２５％的酒精性肝病患者中可出现线粒体巨大症，而非酒精性肝病还不到１％。酒精性肝病线粒体改变影响了线粒体的功能，如氧化磷酸化和三羧酸循环被抑制４０＊／，。酒精性肝病中线粒体膜脂质、线粒体ＤＮＡ和其蛋白合成异常造成线粒体的损害。乙醛和自由基可诱导线粒体损害，而后者引起的损害因谷胱甘肽的耗竭而增强。（５）铁负荷：铁可诱导自由基的形成．促进脂质过氧化导致细胞器的破坏。当过量的铁持续聚积在肝脏内，长期作用可使细胞坏死并促进肝组织胶原形成启动肝纤维化，最终发展为肝硬化。铁有催化脂质过氧化的作用，并对酒精引起的肝细胞损害起到了协同的作用。酒精可以干扰正常的铁代谢，大约三分之一的嗜酒人群有铁的过渡沉积，进而引起肝脏的损害．其机制可能与自由基介导的毒性有关。酒精诱导的铁代谢紊乱的机制可能与铁是一种前氧化因子有关。 ２．炎症（免疫）机制：（１）细胞因子：很多炎症细胞因子都参与酒精性肝病的发病机制。酒精性肝病动物模型中发现肝脏有肿瘤坏死因子ｄ（ＴＮＦａ）ｍＲＮＡ表达增加，主要有由库普弗细胞产生，并在细胞坏死和炎症发生前开始表达。它可引起肝细胞和肝窦内皮细胞凋亡。可以增强细胞间黏附分子ｌ的表达并参与以中性粒细胞为主的炎细胞浸润－亦可诱导肝细胞产生嗜中性粒细胞趋化因子白细胞介素（ＩＬ）一８。慢性酒精摄人可诱导肝细胞产生ｌＬ一６和转化生长因子§（ＴＧＦ—Ｂ），酒精可以使ＩＬ“和ＴＧＦ—Ｂ升高２－４倍，与肝纤维化特异相关。ＩＬ一８在肝细胞和库普弗细胞中表达，可被氧化剂和ＴＮＦ一口诱导产生．（２）库普弗细胞和内毒素的作用：库普弗细胞是酒精性肝病炎症和纤维化细胞因子的主要来源，库普弗细胞的激活是酒精性肝病的一个重要的病理生理机制。内毒素是嗜酒者体内库普弗细胞激活的重要介质。慢性酒精中毒可诱导低水平的内毒索血症，可能是由于内毒素增加了小肠的通透性，与肠源性内毒素血症有关。如果内毒紊与库普弗细胞相互作用，可增强过氧化物和细胞因子的释放促进肝损伤。（３）免疫反应：肝细胞蛋白和乙醛及羟乙基形成加台物刺激机体产生抗体引起细胞免疫反应，抗原抗体复合物的形成及乙醛的化学性损伤可致白细胞浸润，库普弗细胞释放ＩＬ－６和ＴＮＦ—ａ增加，而多种细胞因子的产生可引起炎症和纤维化。乙醛蛋白加合物主要位于肝损害比较明显的中央静脉周围，可刺激肝脏胶原合成直接导致酒精性肝纤维化。 ３．缺氧：在肝脏，由于血流从门静脉和肝动脉到中央静脉的特殊性以及沿着肝窭细胞的耗氧代谢过程，肝脏内形成了明显的氧分压梯度，氧分压从门静脉周围区域６５ｍｍＨｇ降至中央静脉周围的３５ｍｍＨｇ。随着过量酒精的摄人，肝细胞处于相对缺血状态，特别是中央静脉周围、更易陷人低氧状态。酒精性肝病病理可表现为不同程度的脂肪变性、炎症、坏死和纤维化，且病变以肝小叶中心带（３区带）为主，早期脂肪变性多
小鼠急性酒精性肝损伤动物模型造模方法优化
小鼠急性酒精性肝损伤动物模型造模方法优化 【摘要】目的：探索急性酒精性肝损伤小鼠动物模型的造模方法。方法：通过三个实验比较不同剂量、不同灌酒方法、不同灌酒时间动物醉酒率、死亡率和血清转氨酶的不同情况。结果：一次灌酒0.28ml/10g体重小鼠可达中度醉酒，醉酒率70%，死亡率40%；采用小间隔分次灌服法后小鼠醉酒率60%，死亡率降为20%；连续灌酒时，较高剂量组第三天开始出现死亡现象并逐渐加重；血清转氨酶上升的高峰在第5天，此后逐渐下降。结论：白酒灌胃法造急性酒精性肝损伤模型时，采用中等剂量、分次灌胃法可降低死亡率，实验时间以5~7天比较适宜。 【关键词】急性酒精性肝损伤；小鼠；动物模型 随着人们对酒精性肝脏损害重视的提高以及相应实验研究的广泛开展，相关动物模型尤其是急性酒精性肝损伤动物模型在实际实验应用中的问题日益突出。我们在参考文献介绍的方法[1]制造急性酒精性肝损伤动物模型的实验中，对造模实际操作时的一些具体问题和检测指标的时间选择等有所比较和认识，现报告如下，以供同仁参考，在造模上少走弯路，节省经费。 1 实验材料 1.1 实验动物昆明种小鼠84只，体重24g~27g，合格证号分别为豫医动字第410115号，均由河南省实验动物中心提供。 1.2 实验试剂ALT试剂盒，迈克公司生产，批号100122；AST试剂盒，迈克公司生产，批号100103。 1.3 实验仪器雷勃微量移液器，芬兰雷勃集团中国区总部；DZKW型电子恒温水浴锅，余姚市亚星仪器仪表有限公司；752 N型分光光度计，上海第三分析仪器厂。 2实验方法 2.1 实验1普通级昆明种小鼠50只，21g~24g，雌雄各半。将50只小鼠按随机排列表分为5组，每组10只，雌雄各半。其中4组分四个剂量级 3.2灌酒时间与醉酒率、死亡率 实验1中，随着灌酒天数的增加，各组动物醉酒率变化不很大，但M3、M4两组的死亡情况日益严重，尤其是M4组，动物死亡数目过多。 3.3 灌酒方式与醉酒率、死亡率 实验2采用分次灌服的方式，仍观察醉酒情况，计算醉酒率和死亡率。结果
小鼠酒精性脂肪肝模型的建立
小鼠酒精性脂肪肝模型的建立 发表时间：2011-11-23T10:28:36.130Z 来源：《中外健康文摘》2011年第30期供稿作者：张劲松1 (通讯作者) 吴铁2 邹丽宜2 [导读] 酒精及高脂饮食对对小鼠一般情况及体重的影响每天观察小鼠的一般症状，进食变化等。 张劲松1 (通讯作者) 吴铁2 邹丽宜2 （1广东医学院实验动物中心 523808;2广东医学院药理教研室 523808）【中图分类号】R575【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）30-0096-03 【摘要】目的探讨建立小鼠酒精性脂肪肝动物模型的方法。方法 80只雄性昆明小鼠随机分成4组：NS组每天灌胃生理盐水和普通饲料喂养，HM组、MM组和LM组采用每天按照5g.Kg-1.d-1对小鼠灌胃浓度为 60%（V/V）、30%（V/V）和10%（V/V）的乙醇的方法，连续6周，观察其肝脏病理改变、血液等指标的变化。结果造模6周后，模型组小鼠肝脏重量明显升高，与正常组比较有显著性差异；病理表现为广泛的脂肪变性，血清甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶（AST）、总胆固醇(CH)升高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）显著降低，与正常组比较差异有显著意义 (P<0.05)；透明质酸（HA）变化不大（P>0.05）。结论本造模方法与人类酒精性脂肪肝病变类似，方法简单易行，实验周期短，模型稳定可靠。【关键词】酒精性脂肪肝动物模型高脂饲料小鼠Establishment of alcoholic fatty liver model with alcohol and fat emulsion in mice 【Abstract】 AIM: Tostudy the Establishment of alcoholic fatty liver model with alcohol in mice.METHODS: Eighty male mice were randomlydivided into 4groups with 20 rats pergroup: NSgroup(intragastric infusion ofsaline，5ml/kg，fed with commondiet)),hMgroup,mmgroup and LMgroup (intragastric infusion of alcohol by 60%V/V， 30%V/V or 10%V/V，5ml/kg.All mice weresacrificed at the end of the 6th week.The pathologic of the liver and the biochemistry index of plasma were observed.RESULTS:severe fattydeposition was appeared.serum TG，CH，ALT and AST ofhMgroup and LMgroup werehigher than NSgroup(P<0.05).CONCLUTION： The lesion of the alcoholic fatty liver model in mice issimilar to that inhumans.The experiment is verysimple and the experiment cycle isshort and the 【Key words】alcoholic fatty liver animal model mice 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 动物 2月龄清洁级昆明种小鼠80只，雄性，体重（22±4）g，由广东医学院实验动物中心提供（广东省动物质量合格证编号：A2010068 ）。饲养室内温度保持在24℃～26℃，湿度维持在50%～60%，专室饲养，专人负责。 1.1.2 药品、仪器与试剂 100%分析纯乙醇（广州化学试剂二厂，批号：2007061201）；丙氨酸氨基转移酶（ALT/GPT）测试盒，天冬氨酸氨基转氨酶（AST/GOT）和透明质酸（HA）测试盒均购于南京建成生物工程研究所，总胆固醇（TC）试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒购于北京中生生物技术股份有限公司， LEICA QWIN图象分析仪（德国莱卡）；UV-3010紫外分光光度计(日本岛津)；梅特勒－托利多AE240电子天平（梅特勒－托利多仪器公司上海分公司）。 1.2 方法 80只小鼠随机分为4组，分别为正常对照组（NS组）、高剂量模型组（HM组）、中剂量模型组（MM组）和低剂量模型组（LM组），每组20只。所有小鼠均于晚上10点后禁食不禁水，次日NS组每天灌喂生理盐水，HM组、MM组和LM组分别予60%（V/V）、30%（V/V）和10%（V/V）乙醇水按照5g.Kg-1.d-1灌胃，每天1次，连续6周，于第6周末禁食12小时后进行取材检测相应的指标。 1.3 观察指标及测定方法 1.3.1 酒精及高脂饮食对对小鼠一般情况及体重的影响每天观察小鼠的一般症状，进食变化等。 1.3.2 酒精对小鼠血清学指标的影响采用摘眼球取血后，分离血浆检测TC、 TG、HDL-C、BG（血糖）、AST、ALT和透明质酸HA 水平。 1.3.3 酒精对小鼠肝脏指数的影响抽血后，剪开右心房，尽量放出余血，迅速取出肝脏，在4℃预冷的生理盐水灌洗后，用滤纸吸干水分，迅速用电子天平称量肝脏的重量，计算肝脏指数。 1.3.4 酒精对小鼠肝脏形态组织学的影响称重后的肝脏迅速置于冰上，在肝左叶取10mm×10mm大小肝组织行石蜡包埋切片及HE染色作病理检查，剩余肝组织分别切成小块，置于-70℃冰箱中待测肝组织MDA含量和CAT与SOD活性。 1.4 统计学处理实验结果均以表示，应用SPSS11.0软件包进行统计分析，参数资料采用One-Way ANOVA检验，非参数资料采用Ridit 分析。 2 结果 2.1 酒精对小鼠一般情况及体重的影响 实验过程中每天观察动物的进食量和饮水量，每周称量体重，称重前禁食10-12小时。由表1可知，前两周动物的体重没有明显的变化，而实验4周后，模型组的体重明显比NS组增加（P<0.05）,但第六周开始，HM组的体重明显下降。提示酒精可使小鼠的体重明显增加。 表1 酒精对小鼠体重的影响（x-±s，g） Compared with NS: a:P<0.05。
酒精性肝损伤造模
酒后饮绿茶对小鼠肾功能影响的实验性研究 李佳陈路军陈洁徐立思齐慧娟陆妙君 指导老师：黄品贤 （上海中医药大学03中西（七）上海201203） [摘要]目的观察给最佳酒醉状态的小白鼠灌茶对肾功能的影响。方法检测给小白鼠 0.15ml/10g白酒后20min灌入低、中、高浓度茶、解酒阳性对照药枳椇子各0.20ml/10g，连续7天后血肌酐、血尿素蛋及尿蛋白含量。结果⒈高中浓度茶组、模型组的尿蛋白与正常组相比有显著差异，P<0.05。⒉各组生存曲线比较的Log-rank检验结果：χ2=20.39， P<0.01。⒊肾脏病理改变：低浓度茶组小鼠肾小球、肾小管未见明显病变，但间质血管扩张充血明显，有较多量红细胞漏出，可见炎症反应，间质未见纤维化；中浓度茶组肾组织结构完整，肾小球、肾小管未见明显病理变化，间质未见明显充血，少量红细胞漏出，间质未见纤维化；高浓度茶组肾脏组织结构与中浓度茶组接近。阳性对照组肾组织结构基本完整，肾小球、肾小管未见明显病理变化，间质少量充血。结论根据尿蛋白、实验小鼠的生存曲线分析、肾脏的病理结果的一致性得出：⒈酒后饮茶均可导致小鼠的死亡，但是酒后高浓茶对肾脏的损害作用最小。⒉酒后饮淡茶及阳性解酒药枳椇子能起到一定解酒作用，但对肾脏有明显的损害。但本次实验由于死亡率高致样本含量不够，确切的结论有待继续研究。 [关键词]酒，茶，小白鼠，肾功能，病理学 在中国，茶能解酒是自古以来就流传的说法。日常生活中，人们通常用绿茶来帮助消食解酒，且认为茶越浓解酒效果越好。人们认为，饮茶能够使人大脑兴奋、清醒，酒后饮茶能够让被酒精冲昏了的头脑清醒一些，从而达到“醒酒”的效果。 但近年来，有越来越多的报道指出：过量饮酒后饮茶对肾脏有害无益。其理论依据为：绿茶的主要成分茶碱有利尿作用，浓茶中的大量茶碱更能迅速发挥利尿作用，促使尚未分解的酒精代谢产物——乙醛过早地进入肾脏，而乙醛对泌尿系统有很大的损害作用。 本实验采用56度白酒以最佳致醉量对小鼠灌胃后，用等量不同浓度的绿茶及阳性对照药物枳椇子对醉酒小鼠进行灌胃的方法，通过检测鼠尿中的尿蛋白、血样中血肌酐、尿素氮指标及对肾脏组织病理切片的观察，对以上两种观点的正确性作出验证。 现将实验研究结果报告如下。 1 材料与方法 1.1实验动物：昆明种小鼠120只，体重：20-35g，雌雄各半，由上海中医药大学动物实验中心提供。动物房饲养温度：20-23℃，相对湿度：50-70％，标准饮食，饮自来水。 1.2实验仪器和试剂及其制备： 1.2.1实验仪器：针筒灌胃针、天平、试剂瓶、代谢笼、离心机、气象色谱仪、生化分析
非酒精性脂肪肝的发病机制
【关键词】非酒精性脂肪肝 非酒精性脂肪肝nafld(nonalcoholic fatty liver disease,nafld)是一种无过量饮酒史的以肝 实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征，疾病谱随病程的进展而表现不一，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和肝硬化[1]。在1986年schaffner和thaler等人考虑到这类疾病的病变 谱包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化，建议称之为nafld后被人们广泛接受[2]。早期研 究认为，nafld预后良好，进展缓慢，或不进展。近来研究显示，约20%的nash患者可进展为肝硬化，其 中30%~40%患者死于肝相关疾病，部分发生亚急性肝衰竭和肝细胞肝癌[3]。dixon等[4]对105例严重肥 胖患者行临床生化和组织学检查，结果显示26例(25%)患者有nash，其中11例(42%)发生严重的肝纤维化。这些患者的患病危险性与中等量饮酒者相似，说明nafl在严重肥胖患者中很常见，并可进展为肝硬化和肝功 能衰竭。致病因子通过以下机制诱发ｎａｆｌ［5］:(１)游离脂肪酸(ｆｆａ)输送入肝过多,进而肝细胞对ｆ ｆａ的摄取及用于合成甘油三酯ｔｇ相继增多,最终造成肝内脂肪蓄积。(２)肝细胞合成ｆｆａ增加或从碳水 化合物转化为ｔｇ增多,当肝细胞合成ｔｇ能力超过其分泌能力时,则诱致ｎａｆｌ。(３)脂肪酸在肝细胞线粒体内氧化利用减少,肝细胞通过加速合成以防细胞内脂肪酸蓄积中毒,诱发ｎａｆｌ。(４)低密度脂蛋白(ｖｌ ｄｌ)合成或分泌障碍,引起ｔｇ排泄减少,从而导致肝细胞脂肪蓄积形成ｎａｆｌ。1988年，nafld的“2次打击”假说被提出。当时“第1次打击”是指脂肪储积;“第2次打击”是指氧应激和异常的细胞因子，导致肝脏 的坏死性炎症和纤维化。而近年来研究发现，随着胰岛素抵抗发病率的增高和胰岛素抵抗药物对肝脏脂肪储积 的改善，表明胰岛素抵抗可能才是真正的“第1次打击”[6]。 1 胰岛素抵抗与非酒精性脂肪性肝病的关系胰岛素抵抗是指外周组织对胰岛素的敏感性及反应性 降低，胰岛素的生物学效应下降。samuel等通过建立高脂大鼠模型研究发现胰岛素抵抗和糖代谢紊乱是大鼠 非酒精性脂肪肝病发生过程中的始动和重要因素，并且也与非酒精性脂肪肝病的预后有关，提示胰岛素抵抗不 仅是首次打击也是二次打击[7]。胰岛素抵抗与非酒精性脂肪性肝病相关，这不仅在动物实验中得到了验证， 最近的几个临床研究亦发现几乎所有的nafld病人都既存在外周胰岛素抵抗又存在肝脏胰岛素抵抗，且不依赖于糖尿病或糖耐量受损及肥胖。此外，nafld中代谢综合征的组分如中心性肥胖、高血压、高甘油血症及2型糖尿病的发生率甚高，nafld被认为是代谢综合征的肝脏表现[8]。胰岛素在nafld发生中的作用与调节脂 肪生成的转录因子—甾体调节元件结合蛋白1(srebp1)有关。是调节肝脏脂肪合成有关的酶，包 括脂肪合成酶(fas)、乙酰辅酶a羧化酶(acc)和磷酸甘油酞基转移酶(gpat)等活性和表达的一个关键转 录因子，其过度表达可使fas、acc等的水平升高，从而导致tg含量升高，促进脂肪变性发生。 的表达受胰岛素调节[9]。胰岛素抵抗时，由于胰岛素对脂肪分解的抑制作用减弱(主要与胰岛素对 脂蛋白脂酶合成的刺激作用下降有关)，脂肪组织脂解大于合成，储脂能力下降，从而造成脂肪的异位沉积，包括肝脏、肌肉和胰岛等。而肝脏的脂肪沉积使肝脏对额外的打击(如活性氧)易于发生更严重的肝细胞损伤。另 一方面，胰岛素抵抗引起ffa增加，肝脏氧化应激水平增强。这主要是通过损伤线粒体及诱导微粒体过度表达cyp2el来实现的。ffa水平升高不仅促进nafld发生，还可刺激胰岛β细胞分泌胰岛素增多而产生或加重 高胰岛素血症，并使胰岛素介导的葡萄糖摄取和利用降低及促使肝糖异生，使肝葡萄糖输出增加，进一步加重 胰岛素抵抗。另一方面，异位脂质沉积(包括脂肪肝)亦可加重胰岛素抵抗。国内外均有研究表明使用胰岛素增 敏剂如二甲双胍、罗格列酮可以改善脂肪肝患者的肝功能及降低甘油三酯，并有组织学改善。美国nairs等[10]使用二甲双胍治疗脂肪肝患者三个月后，肝脏生化指标、肝组织学炎症、坏死、纤维化及胰岛素敏感性均有所好转，但继续到六个月时，生化指标、胰岛素敏感性又出现反复。使用罗格列酮治疗脂肪肝可以改善肝 脏组织学的临床实验也有报道[11]。
酒精性肝病的发病机制
酒精性肝病的发病机制 酒精性肝病(ＡＬＤ)是因长期、大量饮用各种含乙醇的饮料所致肝脏损害性病变。在组织病理学上主要表现为三种形式:酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化,这三种形式可单独或混和存在。酒精性肝病的发病机制相当复杂,涉及到酒精及其代谢产物对肝脏的直接和间接损伤,同时酒精性肝病的发生和进展还与营养状态及遗传易感性密切相关。 酒精及其代谢产物对肝脏的损伤 摄入的酒精主要在十二指肠和上段回肠通过单纯扩散吸收,胃也能缓慢吸收少量的酒精。进入血循环中的酒精随着血流分布迅速扩散,在肝、肺及脑部等血管分布较多的器官很快达到平衡。酒精不能储存,必须被代谢,肝脏是体内酒精代谢的最主要器官,其中90%～95%酒精在肝脏通过乙醇脱氢酶(ＡＤＨ)和微粒体乙醇氧化酶系统(ＭＥＯＳ)进行氧化代谢。人类ＡＤＨ基因位于4号染色体,为含锌的金属酶, 具有4个同工酶,其中ＡＤＨ2与酒精代谢有重要关系。当血循环中乙醇含量较低时,主要由ＡＤＨ参加酒精代谢。ＭＥＯＳ与ＡＤＨ有着明显不同的特点,其功能依赖于细胞色素Ｐ450。当乙醇水平很高时或长期饮酒者,则主要由ＭＥＯＳ起作用,乙醇诱导的细胞色素Ｐ450称为Ｐ450ＩＩＥ1或ＣＹＰ2Ｅ1。乙醇如何诱导ＣＹＰ2Ｅ1的表达相当复杂,涉及到转录、转录后和翻译后的调节。大部分学者认为在低浓度乙醇诱导ＣＹＰ2Ｅ1增加并不是通过转录增强,而是在翻译后水平减少ＣＹＰ2Ｅ1 的降解实现的。但当酒精的浓度高于3ｇ/Ｌ时,ＣＹＰ2Ｅ1ｍＲＮＡ则明显增加。酒精经上述酶解途径代谢后的主要代谢物是乙醛,同时还产生氧应激产物(详见后) 。乙醛随后又被乙醛脱氢酶(ＡＬＤＨ)氧化代谢乙酸,最终的产物是二氧化碳和水。哺乳动物有几种ＡＬＤＨ,ＡＬＤＨ存在于各种细胞,但在肝细胞中活性最高。根据其催化活性、结构特点和亚细胞分布,ＡＬＤＨ可分成三类,目前认为只有Ⅰ和Ⅱ类与相应基因位点的ＡＬＤＨ1和ＡＬＤＨ2具有乙醛氧化作用。长期酒精摄入也能致ＡＬＤＨ活性减低,因此,大量饮酒的患者体内ＡＬＤＨ不足以及时处理体内产生的乙醛,因而导致过多的乙醛在体内(主要在肝脏局部)储溜。肝静脉血乙醛的浓度与肝组织的损伤程度具有相关性。 乙醇对肝脏的影响表现在:乙醇对组织和细胞直接损伤作用;乙醇在肝脏代谢过程,可使2分子的ＮＡＤ+(氧化型辅酶Ⅰ)转变为ＮＡＤＨ(还原型辅酶Ⅰ),于是ＮＡＤＨ/ＮＡＤ+的比值明显改变,使细胞的氧化还原状态改变,对葡萄糖合成、脂质代谢及蛋白质的分泌有广泛的影响。乙醇的主要代谢产物乙醛对肝脏的毒性作用更大,主要表现在:(1)降低肝脏对脂肪酸的氧化;(2)损伤线粒体、抑制三羧酸循环;(3) 影响肝脏的微管系统,使微粒蛋白分泌减少,造成脂质和蛋白质在肝脏细胞中沉积; (4)与细胞膜结合,改变其通透性及流动性,从而导致肝细胞的损伤;(5)抑制ＤＮＡ的修复和ＤＮＡ中胞嘧啶的甲基化,从而抑制细胞的分化及损伤组织的再生、修复;(6)乙醛能增加胶原的合成及ｍＲＮＡ的合成,促进肝纤维化的形成。另一方面,上述的级联氧化过程导致ＮＡＤＨ形成明显减少,ＮＡＤ+/ＮＡＤＨ比值明显改变,进