脂肪组织源性干细胞研究进展
?小专论?脂肪组织源性干细胞研究进展3
李惠侠 屈长青 罗 肖 杨公社△
(西北农林科技大学动物脂肪沉积与肌肉发育实验室,陕西杨凌712100)
摘要 增加具有完整功能的种子细胞数目是细胞移植的首要环节。近来研究发现,成体动物脂肪
组织中含有大量的具有多向分化潜能的间充质干细胞,在特定条件下可分化为多种组织细胞,如脂
肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞及神经星状细胞等,且具有极强的自我复制能力,有望成为组
织工程理想的种子细胞。本文综述了脂肪组织源性干细胞(ADSCs)的发现、生物学特性、多向分化
潜能、应用前景及存在的问题。
关键词 脂肪源性干细胞;细胞分化;组织工程
中图分类号Q81
白色脂肪组织在哺乳类动物整个生命过程中始终处于动态变化之中,不仅在机体整个能量调节中发挥重要作用,而且在胰岛素抵抗和2型糖尿病的发病机制中占有重要地位[1]。随着组织工程的迅速发展,Zuk等[2]2001年首次从人脂肪组织中发现了大量类似于干细胞的细胞,这些细胞在合适诱导剂的作用下可向成骨、软骨、脂肪和成肌等细胞分化。这样,对脂肪组织的研究不再局限于脂肪细胞。这些具有多向分化潜能的干细胞被称为脂肪组织源性干细胞(adi pose2derived ste m cells,ADSCs)。
一、AD SC s的发现
2001年以来,随着脂肪基质细胞分离和培养技术的完善,人们发现脂肪组织中除了能向脂肪与脉管细胞分化的细胞外,还存在着一些与骨髓间充质干细胞(bone marr ow mesenchy mal ste m cells,BM2 SCs)相似的具有多向分化能力的细胞。不同文献中,分别命名为抽脂处理细胞(p r ocessed li poas p irate cells,P LA),脂肪基质微管碎片细胞(str omal2vas2 cularfracti on cells,S VF),脂肪组织源基质细胞(adi2 pose2tissue derived str omal cells,ATSCs),脂肪源中胚层干细胞(adi pose2derived mes oder mal ste m cells, ADMSCs)等。这些不一致的名称均指从脂肪组织中分离的、可在体外大量扩增并具有多向分化潜能的细胞。Guilak等(2006)分离了人S VF细胞,然后通过细胞表面标记选择单一来源的ADSCs,传4代单克隆培养扩增细胞。出现45个克隆时在特异性诱导剂诱导下,发现可以向成脂、成骨、软骨和神经原细胞等分化。其中成骨分化率为48%,软骨43%,神经元细胞占52%,12%为脂肪细胞。进一步证明了ADSCs确实有多向分化潜能,是一类重要的成体干细胞。目前已经证实从人、鼠、猪及兔子等不同物种脂肪组织中均可获得这种细胞,本文通称这种细胞为ADSCs。
二、AD SC s的优点及分子标记
从人类医学角度讲,获取ADSCs比BMSCs容易,给患者带来的痛苦小。皮下脂肪切除术是一种普通的外科手术,其安全性高。其次,脂肪组织比骨髓中所含的间充质干细胞(mesenchy mal ste m cells, MSCs)比率大。成纤维细胞集落形成单位(fibr o2 blast oid2like col onies,CF U2F)试验表明,脂肪组织中干细胞数目至少是骨髓的500多倍[3]。我们以鼠和猪为实验动物,胶原酶消化获得大鼠腹股沟及仔猪肩胛部ADSCs,体外培养观察到ADSCs为梭形、呈平行排列;经过多次传代,细胞增殖速度无明显减慢,衰老和死亡细胞所占比例少,表明脂肪组织蕴含丰富的ADSCs。最后,从经济和社会效益看,从脂肪组织中获取ADSCs可将原本认为是废弃物的脂肪,如临床上脂肪抽吸术后的脂肪组织及动物屠宰后废弃的内脏脂肪等变为干细胞库的重要来源,具有极大的经济与社会效益。
一般认为ADSCs与BMSCs具有相似的生物学特性。ADSCs和BMSCs均表达4种通用多向分化潜能干细胞标记CD105、ST RO21、CD166及CD117。其中CD117是一种干细胞因子受体,在全能或多能
3国家重点基础研究发展计划(973计划)(2004CB117506)资助课题
△通讯作者
干细胞中表达,包括ESCs
。除了上述几种标记外,ADSCs 和BMSC 也表达其他多种分子标记,包括CD29、CD44和CD49e 等(表1)。
表1 ADS Cs 和B M SCs 表面标记比较[4]
表面标记
ADSCs BMSCs CD9++CD10++CD13++CD29+
+
CD3122CD342
2
CD44+
+
CD452
2CD49d +2
CD49e ++CD54+++CD55++CD59++CD90++CD105+
+CD1062
+CD117++CD146++CD166++STRO 21
+
+
三、AD SC s 的多向分化潜能
Zuk 等用0.075%的胶原酶消化人脂肪抽提物30分钟后,得到的ADSCs 可诱导向不同细胞分化。Cousin 等(2003)采用0.2%胶原酶II 型+0.2%BS A 消化C57B1/6小鼠腹股沟皮下脂肪45分钟
后,得到的细胞可重建致死辐射小鼠的造血系统。Rangappa 等(2003)采用胰酶、胶原酶+BS A 联合消化新西兰大白兔腹股沟皮下脂肪2.5小时,得到的ADSCs,在52氮胞苷作用下可向心肌细胞分化。我
们用0.1%胶原酶I 型消化猪肩胛部和皮下脂肪,发现获得的ADSCs 在合适诱导剂下至少也可以向脂
肪、成骨和肌细胞分化[5]
(成肌文献待发表)。综合近几年的研究,ADSCs 可向脂肪、软骨、成骨、神经元细胞、成肌细胞、血管内皮细胞等方向分化。其中脂肪、成骨、软骨和成肌细胞为中胚层来源细胞,而造血细胞和肝实质细胞的分化目前文献较少,需进
一步研究证实(图1)
。
图1 脂肪组织来源干细胞向多种细胞分化
(一)向脂肪细胞分化 在ADSCs 基础培养基
(DME M /10%F BS )中加入不同浓度的32甲基212丁
基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和噻唑烷二酮进行诱导培养。3～10天后,经油红O 或尼罗红染色,发现部分细胞中充满被染成红色的脂滴,表达脂肪酸结合蛋白(aP 22)、脂蛋白酶(LP L )和过氧化物酶体增殖
物激活受体2
γ2(PP AR γ2)。在多种动物模型(鼠、猪)中注入已分化或未分化的ADSCs,并配合不同的生物材料,如藻酸盐、透明质酸、纤维胶、多聚乳酸等,均能形成脂肪。我们的研究发现,从不同物种不同部位提取的ADSCs,其成脂诱导物可能存在差异:大鼠腹股沟脂肪基质细胞在不加任何诱导物的基础培养基中培养5～10天,显微镜下观察到80%以上细胞充脂;猪的肩胛部和皮下脂肪基质细胞需要在成脂诱导剂作用下分化。随着传代次数的增加,二者成脂分化率均降低。因此认为原代细胞中可能含有较多的前体脂肪细胞,传代可以去除脂肪,使AD 2SCs 纯度增加。
(二)向成骨方向分化 ADSCs 在成骨方面的研究已取得了相当快的进展。人、鼠和猪ADSCs 在
有VC 、β2甘油磷酸、地塞米松和1,252VD3的培养基中诱导,ADSCs 由狭长的类成纤维细胞形态转变为圆形、立体形状。2～4周可在细胞外基质中形成磷酸盐钙化沉积物,并表达骨原性基因和蛋白质,如碱性磷酸酶(ALP )、骨桥蛋白(OP N )、骨钙素(OC )
和胶原蛋白2I 等。D ragoo 等[6]
给ADSCs 转染骨形成蛋白22(BMP 22),成骨分化速度快于培养基中添加重组人BMP 22蛋白。比较转染BMP 22基因的
MSCs和ADSCs发现,后者可产生更多的骨祖细胞和细胞外钙化基质成分,成骨分化率为45%。Shi 等(2005)研究表明,ADSCs的成骨分化能力不受动物年龄限制,是一种理想的骨种子细胞。
(三)向软骨方向分化 用含胰岛素、TGF2β1和22磷酸抗坏血酸的软骨诱导液培养ADSCs,2～4周后ADSCs表现软骨细胞形态,并表达软骨特异性标记Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等,角质素阿辛蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性[7]。Masuoka等(2006)以蜂巢状胶原生物支架复合软骨诱导的大鼠AD2 SCs,植入膝关节软骨严重缺陷处,12周后发现受损软骨得到修复,并表达II型胶原。
(四)向成肌方向诱导 M izuno等(2002)在加入马血清的培养基中,大约有15%的ADSCs细胞诱导6周后表达肌肉特异性标志因子如Myo D1和肌细胞生成素,骨骼肌转录调节因子myf5、myf6等。最终,细胞融合形成多核的肌管,并表达骨骼肌细胞谱系的标志蛋白如肌球蛋白轻链激酶,说明ADSCs 可向骨骼肌方向分化。Bacou等(2004)用LacZ标记培养3天的ADSCs,自体移植到胫骨前肌肉损伤部位,2个月后发现大块新生肌肉断面。如果延长ADSCs体外培养时间到7天,导致肌肉修复能力降低。尽管ADSCs向肌肉方向分化与其向脂肪组织和成骨方向分化的水平相比较低,但通过应用一些外源性的因素进行干扰以及改善培养条件有希望提高ADSCs向成肌细胞分化的水平,提高其临床应用价值。
(五)向心肌方向诱导 Rangappa等(2003)分离新西兰大白兔ADSCs,传2代加入不同浓度52氮杂胞苷诱导培养2周,细胞形态逐渐向圆形转变,而对照组仍表现为纤维样的细胞。3周后细胞出现自发性搏动,2个月后免疫组化染色证明表达心肌特异性蛋白如肌钙蛋白、α2肌球蛋白重链、肌节蛋白、连接素,证实ADSCs有向心肌分化的潜能。以大鼠心肌细胞提取物(CEs)短期处理人ADSCs,结果也表达上述心肌特异标志物以及连接蛋白243(Cx2 43)[8]。Stre m等(2005)将分离的Rosa26小鼠(转β2牛乳糖基因鼠)ADSCs注入心肌缺损鼠(非转β2牛乳糖基因鼠)心室内,手术后7、14天后检测到β2牛乳糖标记的心肌细胞。
(六)向神经细胞分化 早期,用β2巯基乙醇诱导8小时,可使ADSCs快速表现神经元以及神经胶质细胞形态(细胞体积缩小,周围有多个神经突起),并表达早期神经系统标志物,包括巢蛋白(nes2
tin)、神经元特性烯醇化酶(NSE)和神经元特异核蛋白(Neu N)。A shjian等(2003)以替代诱导液I B2 MX、吲哚美辛和胰岛素诱导2周后,大约20%～25%的人ADSCs分化形成具有神经细胞形态特征的细胞。但是,诱导后的细胞只限于早期神经标志,并没有发现神经元树突标志物微管相关蛋白(MAP)和成熟星形细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(GF AP)。一种解释认为,这些早期神经标志物的出现是毒性刺激物诱导下基因表达异常的结果;另一种解释认为,现有的诱导剂不能使ADSCs和MSCs充分表现神经分化特性,只能部分表达神经细胞特性。动物活体移植试验证明了后一种解释的正确性:Kang等(2003)直接将ADSCs移植到大鼠大脑内,植入后14天检测到4%的移植细胞表达MAP22,9%表达GF AP,表明ADSC向成熟神经方向分化。但到目前为止,还未见资料证明ADSCs能分化成具有完全功能的成熟神经细胞,以及参与中枢神经系统的整合和修复。
(七)向其他类型细胞分化 除上述几种细胞类型外,ADSCs在血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等的诱导下向成熟内皮细胞分化,分化的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、CD34和CD144以及内皮细胞一氧化氮合酶(e NOS),并伴随内皮细胞吞噬功能。将诱导后的细胞移植到裸鼠内,能促进裸鼠局部缺血组织新血管形成以及在基质胶层上出现血管样组织结构[9]。Seo等(2005)提出在肝细胞生长因子(GHF)和抑瘤素M(OS M)的诱导下,人ADSCs表现肝(实质)细胞形态,并表达肝细胞标志物白蛋白和α2胎蛋白。还有报道认为,ADSCs在甲基纤维素半固体培养基中可以支持造血干细胞的生长,但到目前为止尚无充分的证据表明ADSCs能分化成造血细胞。
四、AD SC s的临床应用前景
近年来,干细胞研究成为生物学领域、生物医学领域中最活跃的部分,干细胞的迅速兴起必将给人类健康带来无限希望。通过对欧洲专利局世界专利数据库检索,目前已经公开的关于ADSCs的基本专利共有14项,充分显示出ADSCs广泛的临床应用前景和潜在的市场价值。
(一)组织工程种子细胞 各种组织如骨、软骨和肌肉等组织的缺损修复一直是一个难以解决的问题,以干细胞为基础的组织工程的发展为上述疾病带来新的希望。ADSCs不仅可分化为成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞等中胚层细胞,也可
以向外胚层如神经元及内胚层如肝细胞和心肌细胞分化,充分显示了ADSCs强大的“可塑性”(p lastici2 ty)。ADSCs诱导分化的各类细胞可作为组织工程种子细胞,配合相适应的三维生物材料,有望在骨组织工程、脂肪组织工程、软骨、肌肉的损伤修复、整形外科等方面的研究和治疗上得以广泛应用。
(二)作为基因治疗载体 基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过载体导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。目前基因治疗主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病。包括遗传病(如血友病、囊性纤维病、家族性高胆固醇血症等)、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病(如A I D S、类风湿等)。ADSCs能否作为基因治疗的病毒载体,最主要的是其对外源基因的表达能力。腺病毒、逆转录病毒载体和慢病毒在体外都能感染ADSCs。Moriz ono等在体外比较了上述三种载体对ADSCs的转染率并对其分化后的基因表达进行分析,结果慢病毒有较高的转染效率,转染后的ADSCs 诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞后,仍有外源基因的表达。因此推测ADSCs和慢病毒载体相结合可作为基因治疗的有力工具[10]。
五、待解决的问题
组织工程研究主要包括四个方面:种子细胞、生物材料、构建组织和器官的方法与技术、组织工程的临床应用。ADSCs的发现有望解决种子细胞来源问题,但我们认为目前大部分研究组分离的ADSCs 很可能是一种混合细胞群,虽然可能对特定方向的诱导有利无弊(如向成骨诱导时,存在前成骨细胞可能比用单一来源的ADSCs诱导率高),但这些已定向的细胞并不是干细胞,因而自我更新的能力较差,不宜作为种子细胞。因此,为了更好地满足组织工程和细胞治疗的要求,有必要进一步纯化ADSCs。另外,ADSCs虽然可诱导向不同方向分化,并可形成某些组织如脂肪、骨、肌肉等,但有关ADSCs的研究目前还处于起始阶段,体外培养的ADSCs最终要移入体内进行研究,然而用人体来做实验是不可能的,所以必须建立适合人体的理想的动物模型。猪可能比鼠类更适合人体动物模型,我们已成功地分离出仔猪肩胛部及皮下ADSCs,并在体外定向培养分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞,这为今后体内实验动物模型的建立奠定了基础。最后,种子细胞最终移入体内还需有合适的生物材料作载体,这种载体必须具有生物相容性,并可生物降解,易于生长因子等促细胞分化和组织形成的分子物质的连接和输送,易于生产和使用。目前关于生物载体的研究相对较少,因此,特异性组织生物材料也将是一个重要而广阔的研究领域。
总之,随着分子生物学和细胞生物学的迅速发展,ADSCs的研究也会更加深入,促进、支持ADSCs 生长分化的各种生物因子,模拟体内微环境的细胞外基质等均将成为研究热点,并将取得重大突破,为ADSCs成为现代组织工程学研究的理想种子细胞和最终用于以细胞为基础的临床治疗提供前提和保障。
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脂肪细胞的基础知识
脂肪细胞的基础知识 脂肪细胞的生长全过程及其形态变化脂肪母细胞，是指能向脂肪细胞分化的ADSCs在激素、生物活性因子、寒冷等因素刺激下均能逐渐分化成为单能干细胞。它可保持着干细胞增殖活跃的特性，脂肪母细胞再进一步分化为前脂肪细胞，即通常人们所说的脂肪细胞前体。前脂肪细胞再经历细胞融合、接触抑制和克隆扩增等步骤启动向成熟脂肪细胞分化，并在胰岛素、地塞米松等诱导剂作用下完成向成熟脂肪细胞的分化。全过程可以表示为：多能干细胞——脂肪母细胞——前脂肪细胞——不成熟脂肪细胞——成熟脂肪细胞。生长期前脂肪细胞的形态与成纤维细胞相似，经诱导分化，其细胞骨架和细胞外基质发生变化，开始进入不成熟细胞向成熟细胞转变。细胞形态由成纤维细胞样逐渐趋于类圆或圆形，胞体逐渐增大，胞质中开始出现小脂滴，脂质开始累积，以后小脂滴增多并融合为较大的脂滴，可经油红“O”染色等方法于显微镜下显色，从而获得成熟脂肪细胞的形态特征。此时的细胞无分裂增殖能力，为脂肪细胞分化的终末阶段。 张高娜,梁正翠.动物脂肪细胞的研究进展[J].饲料工业,2009,30(2):42-44. 脂肪细胞由起源于中胚层的间充质干细胞逐步分化形成,按间充质干细胞→脂肪母细胞→前脂肪细胞→不成熟脂肪细胞→成熟脂肪细胞的过程发展。前脂肪细胞在多种转录因子调控下,激活脂肪组织相关基因,并在这些基因的顺序性调控下,经一系列复杂的步骤分化为成熟脂肪细胞。 张艳.脂肪细胞分化过程中的分子事件[J].儿科药学杂志,2008,14(1):56-57.
间充质干细胞 概念： 不同文献中，分别命名为抽脂处理细胞（processed lipoaspirate cells, PLA），脂肪基质微管碎片细胞（stromal vascularfraction cells, SVF），脂肪组织源基质细胞（adipose-tissue derived stromal cells, ATSCs），脂肪源中胚层干细胞（adipose-derived mesodermal stem cells, ADMSCs）等。这些不一致的名称均指从脂肪组织中分离的、可在体外大量扩增并具有多向分化潜能的细胞。 李惠侠,屈长青. 脂肪组织源性干细胞研究进展[J]. 生理科学进展,2007,38(2) 脂肪细胞是由起源于中胚层的间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)逐步分化、发育而来，MSC主要分布于脂肪组织和骨髓中。脂肪细胞不同发育阶段的两类细胞系为多能干细胞系和前体脂肪细胞系，前者为不定向的细胞系，能转变为稳定的脂肪细胞、肌细胞和软骨细胞，后者为定向的细胞系，是目前体外研究脂肪细胞分化应用最为广泛的细胞系。 庞卫军,李影. 脂肪细胞分化过程中的分子事件[J]. 细胞生物学杂志,2005,27: 497-500. 脂肪来源的间充质干细胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells, ADMSCs) 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有自我更新及多向分化潜能,是一种 具有潜力的组织工程种子细胞。目前研究得比较多的是骨髓来源的MSCs,但骨髓中的间 充质干细胞数量很少(约占细胞总数的1/105),且存在取材困难等问题。MSCs广泛分布于 其他组织中,包括肌肉、血管、肝脏、胰腺和脂肪等。 ADMSCs表面有CD29、CD44、CD71、CD90、CD105/SH-2、SH-3、STRO-1等多 种抗原标志。 李冬艳,宇丽. 脂肪来源的间充质干细胞分离方法的改进[J]. 暨南大学学报(医学版),2007,28(6). 脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs） Zuk等从脂肪组织中分离出了一种成纤维细胞样细胞，它与骨髓间充质干细胞(MSCs)形态相似，称之为脂肪干细胞（ADSCs)，平均每300 ml脂肪组织可获得2×108～ 6×108个这样的细胞。ADSCs和MSCs具有相同的表现型，对CD29、CD44、CD71、 CD70、CD105/SH2和SH3为阳性反应，对CD31、CD34和CD45为阴性反应。此外， 它们还具有各自特征性的表达分化抗原：ADSCs具有特征性表达分化抗原CD49d，而MSCs具有特征性表达分化抗原CD106。 张高娜, 梁正翠. 动物脂肪细胞的研究进展[J]. 饲料工业,2009,30(2) 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具备干细胞特点的细胞系，具有自我更新能力、长期的活性和多系分化潜能。 脂肪来源的间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs），以其取材方便、来源丰富等多种优势逐渐取代骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）。 免疫表型：研究发现ADSCs主要表达CD13、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、CD29、CD49e和HLA-ABC，而不表达CD34、CD3、CD19、CD45、CD14、CD117、CD31、CD62L、CD95L和HLA-DR。这个结果和其他的MSCs几乎一致。但ADSCs与BMSCs也有差别：大部分BMSCs表达CD10，而表达CD10的ADSCs仅占5%～20%；几乎所有的ADSCs表达CD49f和CD54，而BMSCs极少表达。 周苏娜,张明鑫. 脂肪来源的间充质干细胞的生物学特征及临床应用[J]. 中国现代普通外科进展,2009,12(1). 不同细胞的表面标志是不同的，脂肪干细胞的表面标记为：CD9、CD10、CD13、CD29、CD10、CD44、CD49e、CD49d、CD54、CD55、CD59、CD90、CD105、CD107、CD146、
脂肪干细胞研究进展与应用前景
◇综 述◇ 脂肪干细胞研究进展与应用前景 周紫微综述 赵 宇审校 2013-01-24接收 基金项目：安徽省教育厅自然科学基金重大项目（编号： KJ2011ZD04、KJ2012ZD09）；国家自然科学基金（编号： 81171829） 作者单位：安徽医科大学第一附属医院整形外科，合肥 230022作者简介：周紫微，女，硕士研究生； 赵 宇，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E? mail ：zhaoyuzj@https://www.wendangku.net/doc/a610617009.html, 摘要 脂肪干细胞是一类存在于脂肪组织中，能够自我更新、具有多向分化潜能的成体干细胞，在一定的条件下可以分化成许多有特定功能的细胞系，具有一般干细胞的特点，可作为多种组织工程的种子细胞。现就脂肪干细胞的生物学特性、多向分化的潜能以及在骨组织工程领域中的研究进展作一综述。 关键词 脂肪干细胞；生物学特性；多向分化潜能中图分类号 R 318 文献标志码A 文章编号1000-1492（2013）07-0846-04 再生医学的兴起激发了人们对各种干细胞、组织工程支架和细胞生长因子的研究热潮，选用合适的干细胞作为种子细胞的来源已经成为研究的焦点。脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便，通过抽脂从中获得大量的脂肪干细胞（adipose tissue?de? rived cells ， ADSCs ）不仅在体内外具有多向分化潜能，在不同的诱导因子作用下可以像脂肪细胞、软骨 细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化，而且可以分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子。现就这一领域新的研究进展与应用作一综述。 1 ADSCs 的来源与培养 Zuk et al ［1］ 首次从人脂肪抽吸物中分离出AD? SCs ， 其方法简述如下：首先将脂肪抽吸物用生理盐水反复冲洗，加0.075%胶原酶，37℃消化1h ，1200r /min 离心10min ，弃上清，取细胞沉淀加入DMEM 培养液［含10%胎牛血清（FBS ）］。细胞计数，每100mm 2培养皿接种1×106个细胞，37℃、5% CO 2、100%饱和湿度条件下培养。24h 后首次换 液，以后每周换液2次，细胞融合达80%时传代，细 胞以2×104个/cm 2接种于新的培养皿内。初分离的细胞接种4h 后开始贴壁，24~48h 细胞形态呈小圆形，色深。48h 后细胞呈梭形，生长有方向性。 5~6d 后细胞呈集落样生长。传代后细胞仍呈成纤维细胞样生长，经多次传代，细胞增殖速度无减慢，这表明ADSCs 体外扩增能力强，易于传代培养。 Kurita et al ［2］ 研究不同的离心力对分离ADSCs 的影 响，发现过度离心会破坏ADSCs ，1200r /min 为最 佳离心力，能获得最大量的ADSCs 。Matsumoto et al ［3］研究发现，人脂肪吸取物在4℃下过夜保存，不 会影响ADSCs 的数量和生物活性。有研究者将ADSCs 冻存后复苏，发现其扩增和分化能力未丢失，形成的脂肪组织与新鲜分离的ADSCs 形成的一样。这使得建立脂肪来源干细胞库成为可能，为 ADSCs 的应用提供了广阔的前景。 2 ADSCs 的生物学特性 培养的ADSCs 传代后，形态上与骨髓来源的间 质干细胞没有区别。Dominici et al ［4］提出根据3个 标准来限制间充质干细胞：能黏附到塑料制品上、具有向成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞分化的多向 分化潜能及特殊的表面抗原表达。De Ugarle et al ［5］比较了ADSCs 和骨髓干细胞间表面抗原表达 的差异，发现两类细胞的表面标记相似，都表达CD13、CD29、CD44、CD58、CD90、CD105和CD166， 均不表达CD11c 、CD19、CD31、CD33、CD38、CD45 等。Kevin et al ［6］发现新分离的ADSCs 表达一些造 血干细胞的标记，包括普通白细胞的抗原CD45、单核/巨噬细胞标记CD11a 和CD14、MHCII 类DR 组织相容性抗原和协同刺激分子CD86，但传代后，以上的大多数表面标记会消失。3 ADSCs 的多向分化潜能 脂肪细胞来源于中胚层，实验证明其具有向骨、软骨、神经元、肌腱、脂肪等方向分化的潜能。 3.1 向成骨方向分化 Zuk et al ［7］用二羟维生素 D3、抗坏血酸磷酸酯、磷酸甘油诱导ADSCs 向成骨方向分化，并进行总钙测定及RT?PCR 检测骨钙素 ·648·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2013Jul ；48（7） 万方数据
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识 脂肪组织来源的干细胞(adipose tissue-derived stromal/stem cells，ASCs)是从脂肪组织中分离提取得到的，具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、可多向分化等优点。ASCs在人体修复重建、免疫调节及组织再生等方面的应用成为近年来干细胞研究的重要内容，也是组织工程及再生医学的研究热点。 大量研究表明，自体脂肪组织移植到软组织缺损部位后，其中40%~60%会被吸收，自体脂肪组织结合ASCs移植，能明显减少自体脂肪组织移植的吸收、液化、坏死及纤维化等情况发生，有利于构建具有生物学结构和功能的脂肪组织。同时，利用脂肪组织可以进行大规模的ASCs提取、制备、储存，为再生医学提供种子细胞。 目前，国内外尚缺乏ASCs提取、分离、制备及储存的标准和质量管理规范，导致各制备机构或研究应用机构之间无法进行统一评估和交流，严重制约了ASCs在皮肤软组织修复重建等相关领域的发展。为了建立安全、规范、稳定、可追溯的行业共识、指南及标准，从源头保证ASCs的提取、制备、储存的高质性和安全性，中国医药生物技术协会皮肤软组织修复与重建技术分会联合从事细胞制备和存储、皮肤软组织修复重建、分子生物学及整形和美容外科等多学科的专家，参照中国医药生物技术协会《细胞库质量管理规范》及《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，组织起草脂肪组织采集及ASCs制备、检测、储存的标准和质量管理专家共识，旨在促进ASCs在皮肤软组织修复重建技术等领域研究成果的转化，进一步促进多学科的交流和发展。 1 脂肪组织采集 1.1 脂肪组织采集机构要求 脂肪组织的采集工作应在取得《医疗机构执业许可证》的医疗机构中实施。采集人员应持医师或者护士执业证书，经过相应的专业技术培训。采集机构应具有完整的标准化操作规程(standard operation procedure，SOP)，并备有采集过程中的应急预案。采集过程应在层流手术室内进行无菌操作，最大限度地减少污染和交叉感染的发生。 1.2 脂肪组织供者要求 对供者健康状况进行全面检查(如一般信息、既往病史和家族性遗传病等)及病原微生物的感染筛查和在危险疫区停留情况的调查。身体状态良好、有完整体检报告、无遗传性家族病史、无恶性肿瘤、无急慢性传染病及血液系统疾病；血常规及分类、肝肾功能正常；人源性特定病毒(包括但不仅限于HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)阴性、梅毒螺旋体阴性(提供脂肪组织的同时，另需提供不少于8ml外周血用于复检，ABO血型、HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分型检查，以备追溯性查询)。若供者HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV检查结果为阳性，实验室应具有处理感染性样本的独立物理空间、独立的空调系统，能做到使用后的器具和相关物品可经过灭活处理后再移出该区域。感染性样本与非感染性样本的处理及制备不使用同一设备，方可进行脂肪组织的采集，但必须使供者知情，同时通知接收、制备、质控及医护人员等做好防护措施。当实验室不具备上述相对应病原体阳性制备/培养区时，不得采集上述阳性供者的脂肪组织。若供者HIV、梅毒螺旋体检查结果为阳性时，不得采集供者的脂肪组织。高度怀疑HIV感染或者考虑HIV感染窗口期的供者不予采集。 1.3 采集方式、采集部位和采集量 1.3.1 采集方式 用肿胀液(生理盐水250ml＋2%利多卡因10~15ml＋肾上腺素0.25mg)局部浸润麻醉供脂肪组织区域，以20ml注射器配备口径1.5~3.5mm、侧孔3.0~5.0mm的吸脂针，进入供区，形成负压，呈扇形手动均匀吸取脂肪组织，吸出3~5mm3脂肪组织颗粒，若脂肪组织颗粒
脂肪源性干细胞与整形美容医学
脂肪源性干细胞与整形美容医学 一、脂肪干细胞介绍 二、ADSCs研究应用的三优势（脂肪干C应用及三大优势） 三、ADSCs在整形美容领域的应用研究 四、展望 一、脂肪干细胞介绍 1976年Fridenstein等首先报道从骨髓中分离出克隆源性的具有多向分化潜能的基质细胞-骨髓间充质干细胞（marrow-derived mesenchymal stem cells，MSCs）。Zuk等于2001年发现脂肪组织中除了含有已经定型的前脂肪细胞外，也包含一种具有多向分化潜力的细胞群，其性质与MSCs十分相似，但又不完全相同。 这些细胞已被证实不仅具有分化成为骨骼、软骨、脂肪、心肌、神经等组织的能力，而且同样具有促进伤口愈合、损伤组织细胞再生和减少疤痕的能力及抗衰老能力。 这种细胞被称为脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）、脂肪来源成体干细胞（adipose-derived adult stem cells，ADAS cells）、脂肪来源成体间质细胞（adipose-derived adult stromal cells）、脂肪来源间质细胞（adipose-derived stromal
cells，ADSCs）、脂肪间充质干细胞（adipose mesenchymal stem cells，AdMSCs），成脂肪细胞（lipoblast）等等。现在被统称为脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）。 二、ADSCs研究应用的三优势（脂肪干C应用及三大优势） 作为以修复重建为主旨的整形外科及以年轻化为核心的美容医学，再生医学一直是备受关注与研究探索的领域。由于MSCs获取途径与疾病治疗性价比的差异，整形外科领域再生医学研究与临床应用受到限制。脂肪源性间充质干细胞一经报道，首先在整形外科领域引起轰动效应，这种关注大大推动了ADSCs的研究，它的临床应用也正在追赶着MSCs的步伐。 首先，来源取材方便不仅是ADSCs一个最大的优势，也是整形外科的优势。一方面，脂肪组织在体内分布广泛，储量丰富；另一方面，吸脂术是整形外科成熟的常规手术，手术风险小，其作为常规“废弃的副产品”获取容易。 对患者来说，吸脂雕塑体形的同时享受干细胞的年轻化神奇功效是一次双赢的生命重塑，痛苦与恐惧感少于骨髓提取，亦无血源污染与免疫排斥风险，由此形成临床应用的优势。据国外报道，1994~2000年开展吸脂术的初期阶段，进行的66570例吸脂手术中，死亡率为0，发生
干细胞研究现状及应用前景
干细胞研究现状及应用前景 在人类生命形成的开始，单个受精卵可以分裂发育形成不同的组织和器官，并通过进一步分裂分化，形成生命个体。在成体细胞中，大部分高度分化的细胞则失去了再分化的能力，而特定组织正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生，这种具有在分化能力的细胞，即为干细胞。干细胞（Stem Cells，SC）是一类具有自我更新能力的多向分化潜能细胞，在一定的条件下，它可以分化成多种功能的器官组织。 一、干细胞的研究现状 干细胞根据发育阶段，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞的分化和增殖是构成机体发育的基础，而成体干细胞的进一步分化则是机体组织和器官修复再生的基础。 1、胚胎干细胞（Embryonic Stem cell，ESC） 在受精卵发育成囊胚时，内细胞层（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，在体外培养条件下可以建立稳定的干细胞系，并保持高度未分化状态，可以分化形成成体的所有组织和器官，包括生殖细胞。 在1998年末，两个研究小组成功地培养出人类ESC，保持了ESC 分化为各种体细胞的全能性，这使得科学家利用人类ESC治疗各种疾病成为可能。随着ESC的研究日益深入，科学家对人类ESC的了解迈入到了一个新的阶段。目前，关于胚胎干细胞的研究大多以小鼠胚胎干细胞为基础的：德美医学小组成功地将由ESC培养出的神经
角质细胞移植到了小鼠体内，随后，密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。 2、成体干细胞(Adult stem cells，ASC) 成体干细胞存在于成年体的许多组织器官中，如表皮干细胞和造血干细胞，具有修复和再生能力。在特定的条件下，ASC或产生新的干细胞，或分化形成功能细胞，从而使组织和器官维持生长和衰退的动态平衡。最新研究表明，高度分化的神经组织仍包含神经干细胞，这证明了机体中成体干细胞普遍存在，关键在于如何寻找和分离特异性干细胞。 2.1造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC） 造血干细胞主要存在于骨髓、外周血、脐带血中，是体内各种血细胞的唯一来源，具有重要的临床价值。 20世纪50年代，临床上就开始应用骨髓移植来治疗血液系统疾病。八十年代末，外周血干细胞移植技术逐渐被推广使用，提高了治疗的效率并缩短了疗程。近年，脐血干细胞移植的成功，为造血干细胞移植技术注入了新的活力。与前两者相比，脐血干细胞无来源限制，对HLA配型要求不高，且不易受病毒和肿瘤的感染，在临床上具有明显的优势。随着脐血干细胞移植技术的不断完善，造血干细胞将成为治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法，为世界上更多的血液病和肿瘤患者带来希望。2.2间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC) 间充质干细胞主要来源于骨髓，在合适的条件下，MSC可以分化
T L诱导分化成熟脂肪细胞方案
Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018) Dexamethasone (Sigma D-4902) Insulin (Bovine; Sigma I-5500) gibco血清：小牛血清(GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198) 胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566) 培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084） MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070) Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016) 一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿，3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。 二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。 三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。 一、诱导液配制 1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。分子量222，几乎不溶于水，现配现用，0.22um 过滤除菌。100×母液（50mmol/L）：11.5mg IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。每毫升培养基加10ul IBMX. 2、胰岛素溶液配制。比较难溶，-20℃保存1个月，使用PH 2~3的稀盐酸溶液助溶，0.22um过滤除菌。100×母液（1mg/ml）：10mg INS+10ml 0.01mol/L HCL。每毫升培养基加10ul胰岛素。 3、地塞米松溶液配制。分子量516.41，0.22um过滤除菌，-20℃保存1个月。使用无水乙醇溶解，1000×母液（1mmol/L）。1mg溶于25ml无水乙醇，每1ml加10ul。 二、3T3-LI细胞系的培养、诱导 1、按常规贴壁细胞培养法培养于含l0% NCS DMEM高糖培养基中，37℃、体积分数为5％CO 2、饱和湿度条件下培养，2d换液一次。
脂肪源性干细胞在整形美容中的应用
脂肪源性干细胞在整形美容中的应用 施雨辰一、技术原理 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，并具有较高的端粒酶活性，是人体的青春活力因子。随着年龄的增长，人体内的干细胞数量会不断降低，增殖分化潜能也不断的衰弱，直接导致衰老和疾病的发生发展。 而选择脂肪源性干细胞是因为，脂肪移植后成活率难以预测，且随着时间而发生变化。但绝大多数研究表明，脂肪源性干细胞可以通过种种方式显著提高脂肪移植后的成活率，而其他方法提高脂肪成活率的程度相对不明显，甚至其价值有待考证。 脂肪源性干细胞就是从脂肪组织中分离提取出来的具有多样分化功能和可塑黏附性的细胞群,所以可以代替病变细胞和老化细胞,起到治疗的作用。同时，脂肪源性干细胞较其他成体干细胞的分化能力强，抗衰老效果显著，疗效更持久。 在整形美容医学中，首先对患者实施常规肿胀麻醉，通过在患者脂肪比较集中部位进行脂肪的抽取，抽取脂肪50mL，然后在其中置入适量的胶原酶液进行震动，以220r/min的条件进行离心处理，混合物充分消化后进行过滤处理；当混合液离心后，会出现脂肪层、生理盐水层以及沉淀层；借助移液管将脂肪予以抽出，并将抽出的脂肪注射进患者的皮肤真皮层中，来重整功能细胞的供应系统，增加正常细胞的数量、活性，从而达到恢复肌肤状况，起到“表面”对抗衰老的目的。 二、技术应用 目前，干细胞医学美容技术在欧美、日本等国发展较为迅速。在中国，在美容整形外科中脂肪源性干细胞主要是应用于凹陷的填充或者各部位的年轻化治疗，且多用于临床试验，在广泛的临床应用中仍存在障碍。同时，一些打着“干细胞”技术的产品使得市场质量参差不齐，市场上销售的大部分“干细胞”技术或产品不是很规
干细胞研究的历史、现状与未来
干细胞研究的历史、进展与未来 中国科学技术大学生命科学学院2004级胡文宝 干细胞是尚未分化发育的，能生成各种器官组织的全能细胞。它是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，即这些细胞可以通过细胞维持自身细胞群大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，从而构成机体各种复杂的组织和器官。干细胞可以来自胚胎、胎儿或成体。根据其来源不同，干细胞可分胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞的分化和增殖构成动物发育的基础，即由单个受精卵发育成为具有各种组织器官的个体，成体干细胞的进一步分化则是成年动物体内组织和器官修复再生的基础。 干细胞研究的历史： 1959年，美国首次报道了通过体外受精（IVF）动物。 60年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其来源于胚胎生殖细胞（embryonic germ cells, EG细胞）,此工作确立了胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells, EC细胞）是一种干细胞。 1968年，Edwards 和Bavister 在体外获得了第一个人卵子。 70年代，EC细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的SC细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。 1978年，第一个试管婴儿，Louise Brown 在英国诞生。 1981年，Evan, Kaufman 和Martin从小鼠胚泡内细胞群分离出小鼠ES细胞。他们建立了小鼠ES细胞体外培养条件。由这些细胞产生的细胞系有正常的二倍型，像原生殖细胞一样产生三个胚层的衍生物。将ES细胞注入上鼠，能诱导形成畸胎瘤。 1984—1988年，Anderews 等人从人睾丸畸胎瘤细胞系Tera-2中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的）细胞，称之为胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cells, EC细胞）。克隆的人EC细胞在视黄酸的作用下分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。 1989年，Pera 等分离了一个人EC细胞系，此细胞系能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的（比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜能是有限的。 1994年，通过体外授精和病人捐献的人胚泡处于2-原核期。胚泡内细胞群在培养中得以保存其周边有滋养层细胞聚集，ES样细胞位于中央。 1998年，Thomoson等从治疗不育症的夫妇捐献的正常人胚泡中分离得到内细胞群。细胞经培养可多次传代，保持正常核型，具有高水平的端粒酶活性，表达人ES细胞而灵长类ES细胞的特征。当将几种非克隆化细胞系的细胞注入免疫缺陷小鼠内后可形成畸胎瘤。畸胎瘤含有来源于原始胚层的多种细胞类型，这证明了人ES细胞的多能性。 2000年，由Pera、 Trounson 和 Bongso 领导的新加坡和澳大利亚科学家从治疗不育症的夫妇捐赠的胚泡内细胞群中分离得到人ES细胞，这些细胞体外增殖，保持正常的核型，自发分化形成来源于三个胚层的体细胞系。将其注入免疫缺陷小鼠错开内产生畸胎瘤。 2003，建立了人类皮肤细胞与兔子卵细胞种间融合的方法，为人胚胎干细胞研究提供了新的途径。 2004年，Massachusetts Advanced Cell Technology 报道克隆小鼠的干细胞可以通过形成细小血管的心肌细胞修复心衰小鼠的心肌损伤。这种克隆细胞比来源于骨髓的成体干细胞修复作用更快、更有效，可以取代40%的瘢痕组织和恢复心肌功能。这是首次显示克隆干细胞在活体动物体内修复受损组织。 干细胞研究的进展： 1.干细胞的来源 胚胎干细胞主要来源于胚胎组织，而用于治疗的应该是人的胚胎干胚胎干细胞，由于人
脂肪来源干细胞免疫原性和免疫调节作用的实验研究_韩铮
收稿日期：2009-05-22 作者简介：韩铮(1982-)，硕士，E-mail:allenhz520@https://www.wendangku.net/doc/a610617009.html, 脂肪来源干细胞免疫原性和免疫调节作用的实验研究 韩铮，姜平，高建华，鲁峰，付冰川，陈晓炜（南方医科大学南方医院整形外科，广东广州510515） 摘要：目的探讨脂肪来源干细胞(ADSCs)在体外的免疫原性，以及ADSCs 在家兔同种异体皮片移植中的免疫调节作用。方法将家兔淋巴细胞分别与自体和异体ADSCs 混合培养48h 后加入CCK-8试剂，并用酶标仪检测OD 值；在家兔同种异体移植皮片下注射自体ADSCs ，观察移植皮片的坏死时间，并于术后第7日切取移植皮片的周边组织进行组织学观察。结果家兔淋巴细胞与自体、异体ADSCs 混合培养后用酶标仪检测OD 值分别为（1.527±0.402）和（1.615±0.351），两组OD 值差异无统计学意义；家兔同种异体移植皮片下注射ADSCs 的移植皮片的坏死时间为（7.170±1.472）d ，未注射ADSCs 的对照组移植皮片的坏死时间为（5.830±1.169）d ，两组皮片坏死时间差异具有统计学意义；术后第7日组织学观察见实验组皮下浸润的炎症细胞较少，皮下组织结构完整、清晰；对照组皮下浸润的炎症细胞较多。结论脂肪来源干细胞在体外的免疫原性低，对家兔同种异体皮片移植有免疫调节作用。关键词：脂肪来源干细胞；免疫原性；免疫调节；组织工程中图分类号：Q813 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2009)10-2144-03 脂肪来源干细胞(ADSCs)是成体干细胞的一种，自Zuk 等［1］报道以来，以其来源广泛、取材简便的特点和可多向分化的潜能，成为干细胞及组织工程研究领域的热点［2］。近年来有关ADSCs 的研究主要集中于其多向分化潜能［3-6］，而对其免疫学特性仍未展开较深入的研究。本实验以家兔作为动物模型，对家兔 ADSCs 的体外免疫原性及体内的免疫调节作用开展 初步探讨，试为扩充组织工程种子细胞的来源及拓展ADSCs 的应用领域提供实验基础。1材料和方法 1.1实验动物与试剂 健康新西兰大白兔10只，雌雄兼有，体质量 2.0~2.5kg ，由南方医科大学SPF 级动物实验中心提供并饲养。DMEM 高糖培养基，RPMI 1640培养基， 胰酶，FBS （Hyclone ），Ⅰ型胶原酶，CCK-8试剂盒， Percoll 淋巴细胞分离液，PHA （植物凝集素）。1.2方法 1.2.1家兔ADSCs 的分离及体外培养取家兔腹股 沟皮下脂肪5ml ，PBS 缓冲液反复冲洗后剪成约1 mm 3大小的脂肪颗粒，0.1%胶原酶在37℃条件下消化30min 左右。使用等量完全培养基（含10%FBS 的DMEM 高糖培养基）中和，离心（1200r/min ）5min 后 去除上清，沉淀混悬后尼龙网过滤并接种于细胞培养瓶中，于37℃、5%CO 2孵箱培养。于24h 后更换培养液，此后每3d 换液1次。观察细胞生长情况，待 6~7d 细胞生长融合达80%~90%后，0.1%胰酶消化后按1∶3进行传代培养。1.2.2体外实验 1.2.2.1家兔淋巴细胞的刺激增殖实验取家兔耳缘静脉血5ml ，用Percoll 淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出外周血淋巴细胞，计数后与PHA 混 合培养于96孔培养板，具体实验分组如下，实验组：家兔淋巴细胞（1×104/孔）和PHA （100μg/ml ，20μl/孔）混合培养；对照组：单独家兔淋巴细胞培养组（1× 104/孔）。实验组与对照组各培养孔均培养48h 后加入CCK-8试剂（10μl/孔），继续混合培养4h 后用酶 标仪检测培养板上各孔的OD 值。 1.2.2.2家兔ADSCs 体外免疫原性检测实验通过前 述方法分离出家兔淋巴细胞，将其分别与自体 ADSCs 和同种异体ADSCs 混合培养于96孔培养 板，具体实验分组如下，对照组：家兔淋巴细胞（1× 104/孔）和自体家兔的ADSCs （3×103/孔）混合培养；实验组：家兔淋巴细胞（1×104/孔）和同种异体家兔的ADSCs （3×103/孔）混合培养。实验组与对照组各培养孔均培养48h 后加入CCK-8试剂（10μl/孔），继续 混合培养4h 后用酶标仪检测培养板上各孔的OD 值。 1.2.3体内实验家兔10只，随机分成5组（记为A 、B 、C 、D 、E 组），每组2只互为同种异体皮片移植对象。在每只家兔的两侧臀部设计直径为3cm 的圆形 皮片，切取后组内、同侧之间交互移植。实验组（左侧臀部）：皮片移植的同时在皮片下注射含自体ADSCs （1×106/kg ）的完全培养基2ml ；对照组（右侧臀部）：皮片移植的同时在皮片下注射不含自体ADSCs 的完全培养基2ml 。术后每天观察各组家兔臀部移植皮片的存活情况并记录移植皮片的坏死时间（移植皮片红润，质地柔软，视为皮片存活良好；若皮片变为暗褐色且质地坚硬的面积>2/3，视为皮片坏死），于术后第7日将C 组和E 组两组家兔的实验组及对照组移 南方医科大学学报(J South Med Univ)2009;29(10) 2144··
无血清原代培养人前脂肪细胞并诱导分化
无血清原代培养人前脂肪细胞并诱导分化1 朱惠娟，史轶蘩，邓洁英，龚凤英 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院内分泌科（100730） E-mail：huijuanzhu@https://www.wendangku.net/doc/a610617009.html, 摘 要：采用胶原酶消化法从人皮下脂肪中分离并原代培养人前脂肪细胞，通过对细胞形态学的观察、油红O对细胞内脂质染色，以及脂肪细胞标志性酶G-3-PDH活性的测定对细胞进行鉴定。摸索在无血清条件下培养并诱导人前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的条件。在无血清的基础培养基中前脂肪细胞可以维持增殖，增殖期的第3-10天为对数增长期。无血清分化培养基培养4天后细胞形态逐渐变圆，并出现球性脂滴，脂滴的数量逐渐增多至分化培养的第21天到达顶峰。在无血清培养的状态下成功诱导前脂肪细胞向脂肪细胞的分化，为研究激素或细胞因子对前脂肪细胞的增殖或分化机制的研究打下了的基础。 关键词：无血清培养，原代培养，前脂肪细胞，增殖，分化 1．引言 随着全球经济的迅猛发展和物质的高度丰富，肥胖症正在以惊人的速度取代感染性和营养不良性疾病威胁人类的健康。导致机体肥胖的脂肪组织是由脂肪细胞、前脂肪细胞、微血管内皮细胞和细胞外的基质成分组成的（1），过多热量以甘油三脂的形式存储在脂肪细胞内，脂肪细胞是在不同的转录因子诱导一系列特异基因表达下由前脂肪细胞分化而来的，而前脂肪细胞起源于胚胎中胚层的多能干细胞（2-4）。目前认为在胚胎期就存在分化的脂肪细胞，在胚胎发育的后期和出生后的儿童期脂肪细胞迅速分化，到了成人期，虽然主要以脂肪细胞的体积增加为主，但前脂肪细胞仍然保留了分化能力，在适当的生理条件诱导下能够不断地分化成为脂肪细胞。目前对前脂肪细胞的研究主要是通过体外细胞培养的方法进行的。目前体外用于前脂肪细胞和脂肪细胞研究的细胞系主要有三类：1）来自胚胎的全潜能（totipotent）胚胎干细胞,能生成各种细胞系（ES细胞）(5)。12）以C3H10T1/2、NIH3T3为代表的多潜能（multipotent）干细胞系；3）以3T3-L1、3T3-F442和Ob17为主的前脂肪细胞系是目前应用最广泛的前脂肪细胞分化为脂肪细胞研究的细胞系。此外2001年， Wabitsch M和他的同事报道了用一例Simpson- Golabi-Behmel syndrome (SGBS)的患者脂肪组织分离出前脂肪细胞首次建立的人前脂肪细胞系（6）。但是非整倍体的前脂肪细胞系在诱导成为永生细胞的过程中细胞的分化能力会受到影响，甚至丧失了其体内的固有生理环境，尤其是前脂肪细胞系不能反映不同年龄、不同部位的脂肪细胞的生物学特点。而原代培养的细胞刚刚离体， 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助（20020023051） - 1 -
人脂肪组织来源的干细胞在骨组织工程中的应用
?综 述? 人脂肪组织来源的干细胞在骨组织工程中的应用 冯 林综述 张锡庆审校 中图分类号 R687 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2005)08-0620-02 作者单位:苏州大学附属儿童医院骨科, 215003 作者简介:冯林,女,河南郑州人,在读博士。研究方向:小儿矫形。 1987年,美国国家科学基金会(NSF )在加利福尼亚举行的专家讨论会上,首次提出了“组织工程”的概念,其定义为[1]:组织工程就是运用工程学和生命科学的原则和方法,研究哺乳类动物正常和病理组织的结构与功能的相互关系,并发展可恢复、保留或改善组织功能的生物替代品。骨组织工程是组织工程的一个重要分支,并且被认为是目前最具有前途和可行性的一个领域。骨组织工程学的研究中种子细胞、支架材料和细胞与材料的相互作用是研究重点。其中种子细胞是组织工程研究中最基本也是首要的环节。 脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一群多能干细胞,具有向多种组织分化的潜能。2001年,Zuk 等[2]从人抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中第一次分离取得了多向分化干细胞,命名为Pr ocessed L i poas p irate (P LA )。研究发现这些P LA 细胞可以在体外稳定的增殖且衰亡率低。免疫荧光和流式细胞仪检测表明P LA 细胞中的大部分来源于中胚层或间质。因为脂肪组织取材容易,因此虽然发现较晚,但研究非常迅速深入,目前已证实脂肪组织来源的干细胞能向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向转化,可作为组织工程的种子细胞,有很重要的研究价值。 1 人脂肪组织来源干细胞的多向分化能力1.1 向成骨细胞的定向分化 Zuk 等 [2] 通过实验发现:在向成骨方向诱导4d 后,P LA 细胞的结构开始发生变化,由一个狭长的类成纤维细胞形态转变为一种圆形、立体的形状。7d 后,这些细胞开始分泌出岛状的细胞外基质。2周后内源性碱性磷酸酶染色阳性并形成矿化结节。从第2～4周,培养孔中钙化的细胞外基质的量明显增加,具有统计学意义。而且,P LA 细胞向成骨细胞分化的能力可以维持相当长的时间,其表达碱性磷酸酶活性最迟可达培养的175d 。研究证明了P LA 细胞向成骨细胞分化的能力。 1.2 向软骨方向诱导 Huang 、Zuk [3] 等应用组织学和分子生物学的方法证实在 高密度的培养条件下,培养基中加入TGF 2 β、胰岛素、干扰素和抗坏血酸,48h 内可以诱导P LA 细胞形成明显的软骨结节并表达软骨特异性标记Ⅱ型胶原,硫酸软骨素-4和硫酸角质素。逆转录多聚酶链反应分析也确认了Ⅱ型胶原和软骨 特异性蛋白聚糖—聚集蛋白聚糖的表达。因此认为这种多能干细胞确实具有向软骨方向转化的能力。尽管P LA 细胞不是真正的软骨细胞,但是它们所显示出来的原始软骨组织的特征使得其有望成为软骨组织工程的种子细胞。国内的余方圆等[4]从新西兰大白兔体内切取的脂肪组织进行一系列处理后,将获得的脂肪组织干细胞向软骨方向进行了诱导分化,结果发现细胞逐渐变圆,并聚集形成软骨样结节,Ⅱ型胶原呈强阳性、聚集蛋白聚糖表达阳性、番红0、阿利新蓝染色阳性,也说明了干细胞向软骨的定向分化。 1.3 向肌肉方向诱导 M izuno 等 [5] 将P LA 细胞置于肌源性诱导条件下6周后通 过结构学、组织学和逆转录多聚酶链反映观察到肌源性标记 MyoD1和肌球蛋白重链的表达。研究者发现,诱导3周后,P LA 细胞形成多核巨细胞并提示有肌管形成。另外;MyoD1 和肌球蛋白重链表达的时间不同,在P LA 细胞分化的过程中 MyoD1的表达先于肌球蛋白重链。研究结果揭示:大约有15%的P LA 细胞在诱导6周后向肌肉方向分化。目前,骨骼 肌组织工程主要用来治疗原发性的骨骼肌病变和因创伤和缺血继发的骨骼肌的丧失。对于这些疾病现今尚无有效的治疗,尽管P LA 细胞向肌肉方向分化与其向脂肪组织和成骨方向分化的水平相比较低,但通过应用一些外源性的因素进行干扰以及改善培养条件有希望提高P LA 的分化水平,提高其临床应用价值。 1.4 向非中胚层组织的分化 P LA 细胞为多能干细胞,它可以分化成为多种中胚层来 源的组织,如骨、软骨、脂肪和肌肉。A shjian 等[6]则通过研究发现P LA 细胞可以诱导分化为外胚层来源的早期神经祖细胞。未分化的P LA 细胞本身就表达一些特征性的神经细胞标记,如神经原特异性烯醇化酶(NSE )、波形蛋白和神经原特异性核蛋白(Neu N )。在用异丁基甲基黄嘌呤(I B MX )吲哚美辛和胰岛素诱导2周后,大约20%～25%的P LA 分化形成具有典型神经细胞形态特征的细胞;同时伴随着NSE 、波形蛋白和神经生长因子受体tr12A 表达增加。但是,诱导后的 P LA 细胞并没有表达成熟神经原标记MAP 或成熟星型细胞标 记GF AP 。而且向神经原方向诱导的P LA 细胞出现了一个延迟的整流器即K +电流(一种早期发育的离子通道),同时伴有形态学的改变和神经原特异性标记表达的增加。研究结果揭示,尽管向神经原方向诱导的P LA 细胞并未表现出成熟神经原细胞和神经胶质的特异性标记,但其表现出的早期神经
脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型
中国组织工程研究与临床康复第14卷第36期 2010–09–03出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 3, 2010 Vol.14, No.36 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 6685 1Department of Plastic Surgery, Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China; 2Seventh Department of Plastic Surgery, Plastic Surgery Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144, China Cai Zhen☆, Doctor, Attending physician, Department of Plastic Surgery, Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China caizhen1976@126. com Correspondence to: Jiang Hai-yue, Professor, Doctoral supervisor, Seventh Department of Plastic Surgery, Plastic Surgery Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144, China jianghaiyue@sohu. com Received:2010-05-28 Accepted:2010-06-24 脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型☆ 蔡震1，潘博2，林琳2，蒋海越2，庄洪兴2 Biological characteristics and phenotypes of adipose tissue-derived stem cells Cai Zhen1, Pan Bo2, Lin Lin2, Jiang Hai-yue2, Zhuang Hong-xing2 Abstract BACKGROUND: Adipose-derived stem cells (ADSCs) are capable of multi-directional differentiation and exist in human processed lipoaspirate. However, no in-depth studies have addressed biological characteristics of adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) in vitro, and there are some disputes on the results from phenotype studies. OBJECTIVE: To investigate biological characteristics and phenotypes of human ADSCs. METHODS: Human adipose tissue was collected from persons undergoing fat extraction. The ADSCs were digested with collagenase, cultured and subcultured in vitro. Cell morphology was observed and growth curves were drawn. The phenotypes of ADSCs were identified by immunohistochemistry and flow cytometry. RESULTS AND CONCLUSION: ADSCs grew well, presented fibroblast-like growth. No significant change in cell morphology was detected within passage 15. The results from immunohistochemistry showed that cells were positive for CD29, CD44, CD105, but negative for CD34, CD45. Flow cytometry results have shown that cells were positive for CD29, CD44, CD105, MHC-Ⅰ, but negative for CD3, CD14, CD19, CD31, CD33, CD34, CD45, CD106, CD117, CD184. Results have suggested that ADSCs can be abundantly harvested and have stable proliferation in poorly differentiated status in vitro. Stem cell-related antigens were highly expressed in ADSCs. Cai Z, Pan B, Lin L, Jiang HY, Zhuang HX. Biological characteristics and phenotypes of adipose tissue-derived stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(36): 6685-6688. [https://www.wendangku.net/doc/a610617009.html, https://www.wendangku.net/doc/a610617009.html,] 摘要 背景：研究证实脂肪组织提取物中存在脂肪来源的干细胞，并表现出多向分化的潜能，但是关于其体外的生物学特性研究不够深入，其细胞表型的研究结果存在一定争议。 目的：观察脂肪来源的干细胞的生物学特性与细胞免疫表型。 方法：取吸脂手术中废弃的人脂肪组织，胶原酶消化法获得脂肪来源的干细胞，体外传代培养，并进行细胞形态学观察，细胞生长曲线测定，免疫组织化学及流式细胞仪检测其细胞表型。 结果与结论：脂肪来源的干细胞生长旺盛，呈成纤维细胞样生长，15代以内细胞形态未见明显变化；免疫组织化学染色显示，细胞表面标记CD29，CD44，CD105表达阳性，CD34，CD45表达阴性；流式细胞仪检测显示，CD29，CD44，CD105，MHC-Ⅰ为阳性，CD3，CD14，CD19，CD31，CD33，CD34，CD45，CD106，CD117，CD184为阴性。结果说明脂肪来源的干细胞体外生长能力旺盛，高表达干细胞相关抗原，可长期传代且保持低分化状态。 关键词：表型；脂肪来源的干细胞；流式细胞仪；生物学特性；干细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.36.008 蔡震，潘博，林琳，蒋海越，庄洪兴.脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(36):6685-6688. [https://www.wendangku.net/doc/a610617009.html, https://www.wendangku.net/doc/a610617009.html,] 0 引言 间充质干细胞是一群存在于身体各个组织内较原始的细胞，具有自我更新及多向分化潜能[1]，基于这些能力，间充质干细胞在其临床应用上有很大的潜力。自2001年Zuk证实了经吸脂术获得的脂肪组织中存在具有多向分化潜能的细胞群后[2]，脂肪来源的干细胞(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)的概念得以明确，ADSCs因为其取材容易也被广泛研究。有研究表明ADSCs在体外培养中能迅速增长，累积细胞倍增数在第13代时仍无明显的下降趋势；更为重要的是细胞传至第10代时，仅有5%的细胞进入了细胞衰老期。因此ADSCs可以作为组织工程的种子细胞，成为具有广阔治疗应用前景。关于ADSCs的细胞表型研究，目前的研究结果没有得到统一的认定。本课题通过对ADSCs进行体外培养及对其体外生长的生物学性状及其细胞免疫表型做初步研究，为以后深入进行细胞组织工程的应用研究奠定了实验室基础。 1 材料和方法 设计：细胞体外培养与鉴定。 时间及地点：于2008-01/2008-06在中国医学科学院整形外科医院中心实验室完成。 材料： 实验标本：来自中国医学科学院整形外科医