脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)

货号:QS1108-10 规格:10 管/9 样脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)活性试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意:正式测定之前选择2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

FAS是脂肪酸合成关键酶,催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成长链脂肪酸。FAS普遍表达于各种组织细胞中,在哺乳动物肝、肾、脑、肺和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。

测定原理:

FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成长链脂肪酸和NADP+;NADPH在340nm有吸收峰,而NADP+没有;通过测定340nm 光吸收下降速率,计算FAS活性。

自备实验用品及仪器:

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体10mL×1瓶,-20℃保存。用前取出置于4℃充分解冻后混匀。

试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入275 μL试剂四,充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入275 μL试剂四,充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂四:液体10 mL×1瓶,4℃保存。

试剂五:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入525 μL试剂四,充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

粗酶液提取:

1.组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加

入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。12000g,4℃离心40min,取上清置冰上待测。

2.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500

万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后12000g,4℃,离心40min,取上清置于冰上待测。

3.血清等液体:直接测定。

FAS测定操作:

1. 分光光度计预热30min,调节波长到340 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂四置于40℃水浴中预热30 min。

3. 测定管:在1mL石英比色皿中依次加入100μL上清液、20μL试剂二、20μL试剂三、820μL 试剂四和40μL试剂五,迅速混匀后于340nm处测定吸光值,记录第30s和90s时吸光值,分别记录为A1和A2。△A测=A1-A2。

FAS活性计算公式:

(1)按照蛋白浓度计算

活性单位定义:37℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反总×109) ÷(Cpr×V样)÷T

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