关节软骨2
湖南医科大学学报
BULLETIN OF HUNAN MEDICAL UNIVERSITY
1999年第24卷第5期 Vol.24 No.5 1999
实验性骨关节病中软骨细胞的凋亡
彭丹孙材江周江南
提要应用兔膝关节伸直位石膏管型固定造成的实验性骨关节病模型，对其关节软骨细胞进行形态学及原位DNA断裂标记研究。结果显示：制动1周时即出现软骨表层细胞凋亡，2周后凋亡呈增加趋势，6周时出现全层软骨细胞大量凋亡，而正常及实验对照组很少出现凋亡细胞。提示制动可引起软骨细胞凋亡；软骨细胞凋亡可能是关节软骨出现退变的重要机制之一。
关键词骨关节炎；软骨细胞；脱噬作用；疾病模型，动物；兔
中国图书分类号R684.1
Apoptosis of chondrocytes in experimental osteoarthritis
Peng Dan Sun Caijiang
(Department of Orthopedic, The Second Affiliated Hospital,
Hunan Medical University, Changsha 410011)
Zhou Jiangnan
(Department of Orthopedic, Xiangya Hospital, Hunan Medical
University, Changsha 410008)
The right knees of rabbits were immobilized in full extension for up to eight weeks using plaster cast. Specimens of the articular cartilage obtained from tibial plateau were studied by histopathologic and
TDT-mediated fluorescein-dUTP nick-end labelling(TUNEL) techniques. The results showed that TUNEL-positive chondrocytes with apoptosis specific morphology were detected on superficial and middle layer of the articular cartilage from one to two weeks after immobilization, and these changes progressed until 4 weeks after immobilization. Six weeks after immobilization, TUNEL-positive chondrocytes were seen through the entire thickness of the articular cartilage. Our findings indicate that apoptosis of chondrocytes could be induced by immobilization and might be responsible for articular cartilage degeneration, and which is one of the pathways involved in the pathophsiological mechanism of osteoarthritis.
Key words osteoarthritis; chondryocytes; disease model,animal; apoptosis
骨关节炎(osteoarthritis, OA)系一严重危害老年人健康的慢性进行性骨关节病，又称退行性骨关节病。这是一种以关节软骨退变耗损为特征的无菌性炎症；典型的病理改变为软骨组织细胞结构进行性减少。目前对其发生机制不明了，亦无相应的有效治疗。
近年研究表明：细胞凋亡(apoptosis)不仅系机体维持正常生理之需，而且与某些疾病的发生密切相关［1］；细胞凋亡过盛可能是神经退行性变的原因［2］；骨关节病及类风湿性关节炎与滑膜细胞凋亡有关［3］。对于软骨细胞在骨关节病中是否存在凋亡，目前尚不清楚。对退行性骨关节病中关节软骨细胞凋亡的研究，有助于从另一角度探讨骨关节病的发病机制。本实验采用家兔膝关节制动引起的实验性OA模型，以原位末端标记法(TUNEL法)对软骨细胞凋亡进行检测，旨在探讨凋亡在关节软骨退变中所起的作用。
1 材料与方法
1.1 分组及模型制作
健康新西兰白兔32只(本院动物实验室提供)，平均体重2.5kg，雌雄不限。右后下肢膝关节伸直位石膏管型固定，左后膝关节为实验对照组。按不同制动时间分为1，2，4，6及8周5个观察组，每组6只。两只用于试验检查，为正常对照组。
1.2 标本制备
各组于观察期满后，麻醉下解剖双侧膝关节，在不中断血供情况下，尽快取胫骨平台处软骨组织置于10%中性福尔马林溶液中固定至少48h。递增浓度乙醇脱水，石蜡包埋，作连续切片。切片厚度为4～6μm。标本分别行HE染色及TUNEL 末端标记。
1.3 TUNEL末端标记法
以Boehringer公司的原位凋亡识别试剂盒(In situ apoptosis detection kit, catalogue: 1684809 Boehringer INC.)标记软骨细胞的DNA断端。步骤如下：切片常规脱蜡，递度酒精(100%, 95%, 90%, 85%, 70%)补水后，加入蛋白酶K(20μg+10mM Tris HCl pH7.4)，室温下消化15min，PBS洗两次，加50μl TUNEL 混合液(TDT 50μl+标记液450μl)。置37℃温箱中孵育60min，PBS洗3次，然后加入50μl Convert-Ap，加盖玻片置入37℃的温箱内反应30min；PBS洗2次，加入BCIP/NTB显色剂，室温显色10min；PBS洗片3次，脱水、封片；光镜辩认被标记的细胞核。
以正常兔软骨组织为正常对照。阴性对照中，除省略加TDT酶步骤而代之以50μl标记液外，余步骤同前述操作。
2 结果
2.1 不同制动时间关节软骨组织病理学变化
正常胫骨平台片软骨组织标本染色后显示关节表面光滑，软骨细胞排列有序(图1A)。制动1～2周时，可见关节软骨表面不光滑，较毛糙，软骨细胞排列紊乱。4周时关节软骨部分区域表层原纤维形成，各层软骨细胞排列紊乱，有软骨细胞丛出现(图1B)。6周时软骨表层裂隙形成，关节软骨出现空陷窝，软骨细胞
数量减少(图1C)。8周时软骨表面溃疡形成，软骨变薄，软骨细胞数量进一步减少，可见许多软骨空陷窝。
图1 制动后关节软骨的组织病理学改变 A.正常 B.制动4周 C.制动6周
HE, ×100
Fig. 1 Histopathological changes in the articular cartilage after
immobilization
A. Control
B. 4 weeks after immobilization
C. 6 weeks after
immobilization HE, ×100
2.2 TUNEL末端标记
正常对照及试验对照组，软骨细胞很少见TUNEL标记阳性细胞(图2)。制动1～2周时，关节软骨中、表层细胞骨细胞可见TUNEL阳性标记细胞；4周时，可见表层、中层大量TUNEL阳性标记细胞，尤以表层为甚；6周时，软骨各层均见TUNEL阳性标记细胞(图3)；8周时，TUNEL标记阳性细胞呈散在性分布(图4)。
图2 正常关节软骨未见TUNEL阳性细胞Tunel, ×100
Fig. 2 TUNEL being negative in chondrocytes of normal cartilage TUNEL,
×100
图3 制动6周后全层出现TUNEL阳性细胞TUNEL, ×200
Fig. 3 TUNEL-positive chondrocytes showing entire thickness of the articular cartilage after 6 weeks TUNEL, ×200
图4 制动8周TUNEL阳性细胞散在性分布TUNEL, ×200
Fig. 4 TUNEL-positive chondrocytes showing scattered 8 weeks after
immobilization TUNEL, ×200
3 讨论
细胞凋亡是指一定生理和病理情况下，机体通过基因调控使细胞自动消亡的过程，是细胞死亡的重要形式之一［4］。细胞凋亡起到维持内环境的稳定作用。它有其典型的形态学特点：细胞体积缩小，细胞核浓缩，核染色质聚集于核周边缘，核仁裂解，进而细胞内陷，将细胞自行分裂为多个核膜包裹，内涵物不外溢的细胞小体，即凋亡小体［4，5］(apoptotic body)，最后被邻近细胞所识别、吞噬或自然脱落而消亡。上述特点与细胞坏死(necrosis)时细胞膜通透性增加，细胞外形不规则变化，线粒体肿胀，进而溶酶体破坏，细胞膜破裂，胞浆外溢引起的炎症反应有显著的差别。凋亡细胞生化改变主要集中在细胞核，激活的内源性核酸内切酶将DNA双链分解于180～200碱基对处，将DNA成梯状切断而使细胞死亡。这种DNA链规律的片断化是凋亡最具特征性的改变［6］。1992年Gavriel等根据此特征设计了DNA链断端的标记技术。其基本原理是：由于凋亡，内源性核酸内切酶的激活，染色质或DNA被切割或割裂，产生DNA断裂数目相同的3’-OH 末端，而这些3’-末端可用分子生物学和免疫组织化学方法处理。在常规组织切片上，加入TDT，使荧光素化的dUTP与DNA末端结合形成多聚体，再以抗荧光素的碱性磷酸酶抗体与多聚体结合，从而显示多聚体。这一技术又称TUNEL
技术。由于这种结合反应的特异性，能准确地表达DNA链断裂的存在，故其所标记的软骨细胞核被视为具有凋亡特征［7，8］。
关节软骨主要由软骨细胞及其细胞外基质组成。每一软骨细胞被细胞外基质包绕。它是一种多机能细胞，能够合成和降解细胞外基质，而且在一定程度上控制细胞外基质的分布。故认为对骨关节病发病机制的研究必须从软骨细胞本身着手。业已证实，实验动物关节制动后的病理变化类似于临床上所见的骨关节炎。因此，可利用这种动物模型对骨关节炎进行研究［9］。研究发现，制动后关节软骨细胞的细胞突减少，体积缩小，核异染色质增加，核固缩等退行性改变［9，10］。笔者所见退变的软骨细胞特点与Kerr等对细胞凋亡的描述相似。本实验成功地复制了骨关节炎的动物模型，应用TUNEL标记法，通过对兔膝关节制动时间的动态观察发现，制动后1周即有软骨细胞凋亡的发生，且凋亡主要发生在表层软骨细胞，2周后凋亡呈进展趋势，4周时出现大量中层和表层软骨细胞凋亡，6周达高峰。此改变与光镜下软骨细胞发生退行性变的病理变化相符。8周时发现被标记的阳性细胞呈下降趋势，较前大为减少。这可能与制动时间较长有关。由于软骨细胞死亡增多，故软骨细胞总数相应减少。当成簇的软骨细胞凋亡脱落后，形成碎片，进入滑液，可刺激滑膜，引起滑膜炎，同时释放炎症介质和自由基等刺激原，进一步诱导软骨细胞发生凋亡，甚至坏死。如此周而复始，形成恶性循环，最终可能是软骨基质合成减少，软骨变薄并破坏，甚至溃疡形成。由于制动后关节软骨发生病理性凋亡，故笔者认为软骨细胞凋亡过盛可能是关节软骨退变发展成骨关节病的重要原因之一。至于何种机制引起关节软骨细胞病理性凋亡，尚待进一步探讨。
作者单位：彭丹孙材江第二附属医院创伤骨科研究室长沙410011 周江南附属湘雅医院骨科长沙410008
参考文献
1 Carson DA, Ribeiro JM. Apoptosis and disease. Lancet, 1993,341:1251～1254
2 Loo DT, Copani A, Pike CJ, et al. Apoptosis is induced bybeta-amliod in cultured central nervous system neurons. Proc Natl Acall Sci Usif, 1993,90:7951～7955
3 Gary S. Fivesteia Yeo. Apoptosis in rheumatoid arthritis synovium. J Chin Invest, 1995,96(9):1631～1638
4 Kerr JFR nyllie AH. Currie AR. Apoptosis is a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972,26:239
5 Areuds MJ, Morris RG, Wyllie H. Apoptosis: the role of endonuclease. Am J Pathol, 1990,136:593
6 Compton MM. A biochemical hallmark of apoptosis internucleosomal degradation of the genome. Cancer Metastasis Rev, 1992,11:105
7 Garvielli Y. Identification of PCD in situ specific labelling of nulear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992,199:4930～501
8 Jan H, Wjsman, Richard R, et al. A new method to detect apoptosis in paraffin sections in situ end-labelling of fragmented DNA. J Histochem Cytochem, 1993,411(1):1～2
9 邹先兴，王桂生.兔膝关节制动引起关节软骨退变的实验研究.中华外科杂志，1989，(3)：175～117
10 Gandolin T. Surface changes in the articular cartilage of rabbit knee during IZ: A SEM study of expericmental OA. Acta Pathol Microbiol Scand, 1980,88:297
(本文编辑薛绍莲)