分子克隆实验准备
工厂2010-5-10
实验项目
1.植物基因组DNA提取SDS法(橡胶73-3-97)
2.特异性PCR（高和琼）
3.特异性PCR产物的回收（试剂盒）
4.大肠杆菌感受态的制备
5.T载体连接转化（DH5σ王老师）
6.质粒提取及酶切鉴定
7.农杆菌法烟草转化
实验一植物基因组DNA提取SDS法(橡胶73-3-97)
试剂：
1.液氮
2.DNA buffer：0.35mol/L的甘露醇,0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)、0.005mol/L EDTA(pH8.0)、
2%(W/V)PVP,2%(V/V)β-巯基乙醇(用前加入)
3.2×CTAB DNA提取液：0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0),0.05mmol/L EDTA(pH8.0),1.4mol/L
NaCl,2%CTAB，2%的PVP，2%(V/V)β-巯基乙醇(用前加入)
4.酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)
5.RNAase：10mg/mL
6.蛋白酶K：20mg/mL，50m mol/L Tris-HCl(pH8.0)+1.5m mol/L乙酸钙/CaCl2，50%甘油，
高压灭菌后，该混合溶液配制成含蛋白酶K浓度为20mg/mL的溶液，将配制的蛋白酶K溶液-20度保存。
7.氯仿/异戊醇（24∶1)
8.75%乙醇
9.ddH2O
10.50×TAE，琼脂糖，溴酚兰，EB（10mg/mL）
11.DNA Marker
耗材：
移液枪，15、2.0、1.5ml离心管，篮、黄、白枪头，
离心管架4个，离心管盒2个，水浴泡沫8个
研钵，小药勺，棉手套
薄膜手套，透明胶布，剪刀（303）
步骤：
1.取新鲜叶片0.5g，用液氮研磨均匀后置于15mL离心管中，并迅速加入1.5mL DNA buffe
混匀后，冰上放置20min；
2.4℃，4000r/min离心20min弃上清，沉淀中加入65℃预热的1.5mL2CTAB DNA提取
液，混匀后于65℃水浴中保温30min；
3.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀后，12000r/min离心15min，取上清；
4.加入2μL的RNAase于37℃温浴45min；
5.加入5μL的蛋白酶K于37℃温浴45min；
6.加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1)混匀后，12000r/min离心15min取上清；
7.加入等体积的异丙醇混匀后室温放置10min，12000r/min离心10min，弃上清；
8.75%乙醇洗涤2次，干燥沉淀，加入50μL ddH2O溶解DNA，4℃保存备用；
9.琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存备用。
琼脂糖凝胶电泳检测
1.根据分离DNA的大小确定琼脂糖凝胶浓度。可参照下表2-1：
2.称取适量的琼脂糖，加入电泳缓冲液在微波炉中融化，混匀，冷却至55℃，加入EB
（10mg/mL）,每20mL凝胶加1μlEB（0.5μg/mL），充分混匀倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳。
3.待胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，
缓冲液高出凝胶表面约1mm。
4.用适量的6×加样缓冲液制备DNA样品，然后用移液器将样品加入样品孔中。设一合适
的DNA分子量标准物。
5.接通电极，使DNA向阳极移动，在3～5V/cm凝胶的电压降下进行电泳。
6.当样品缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。
已染色的凝胶可以直接在紫外透射仪上照相。
琼脂糖凝胶浓度%线性DNA的有效分离范围/kb
表2—1琼脂糖凝胶分辨DNA 片段的能力
实验二、特异性PCR
目的基因：橡胶树死皮病抗性相关基因HbMyb1上游引物：5’TTACTGGCGTTGCATCGGTTG 3’，
下游引物：5’ATGGATCGGGGAATTGAA ATCCTCTCT 3’。全长为1280bp
试剂及耗材：
引物、10×Buffer 、MgCl 2、dNTPs 、Taq DNA polymerase 、ddH 2O 50×TAE 、琼脂糖、溴酚兰、DNA Marker PCR 管、PCR 板、200μl 管
PCR 反应体系：
10×buffer
2.0μl template DNA(10ng/μl ） 2.0μl MgCl 2(25mM ） 1.2μl dNTPs (2μM ） 2.0μl L-Primer(2μM ） 1.0μl R-Primer(2μM ）
1.0μl Taq DNA polymerase(5U/μl ）0.3μl ddH 2O to 20μl
PCR 扩增程序：（1）
94℃5min
0.30.60.91.21.5
5~601~200.5~70.4~60.2~4
（2）94℃30S
（3）Tm退火30S
（4）72℃70s35个循环
（6）72℃延伸7min
实验三、特异性PCR产物的纯化及回收
电泳---切胶---回收试剂盒回收---电泳检测
实验四、大肠杆菌感受态的制备
试剂及耗材：
0.1M CaCl2：10ml×50=500ml1000ml灭菌
甘油：灭菌
液体LB：10ml×50=500ml1000ml灭菌
10ml离心管×50、1.5ml离心管
步骤：
1.从LB琼脂平板上挑取E．coli DH5α的单菌落，接入到10ml LB液体培养基中，37℃，
300r/min振荡培养过夜；
2.取200μl菌液接种于10ml新鲜的LB培养基中，继续培养至OD600值为0.3-0.4之间(约
需2h左右)；
3.把10ml培养物先置于冰上10min左右，然后于4℃，5,000r/min离心2min；
4.弃上清，加5ml预冷的0.1mol/l CaCl2溶液重悬菌体；
5.4℃，5,000r/min离心2min；弃上清，加0.5ml预冷的0.1mol/l CaCl2重悬菌体，即成为
感受态细胞，置4℃保存备用。
实验五T载体连接转化
试剂及耗材：
LB固体培养基15ml×100=1500ml
LB液体培养基1ml×100=100ml
20mg/ml X-Gal：1g X-Gal用DMF（二甲基甲酰胺）充分溶解后定容至50ml，-20℃避光保存200mg/ml IPTG：2gIPTG用蒸馏水溶解后定容至10ml，过滤灭菌，分装-20℃保存
l00mg/ml Amp：1gAmp用灭菌水溶解后，定容至10ml，过滤灭菌，分装-20℃保存
T-Vector试剂盒
PCR回收产物
培养皿100套、封口膜、涂布棒
步骤：
连接体系：
2×Lingase buffer5μl
18T-Vector(50ng/μl)1μl
PCR回收产物3μl
T4-DNA Lingase(3U/μl)1μl
总体积10μl
1.于0.5μl离心管中加入以上成分，充分混匀，离心片刻将管壁液滴收到管底，置于
16℃冰箱中连接16-18h。
2.取0.1mol/l CaCl23
3.6μl和1×SSC16.8μl溶液于1.5ml离心管，混匀，加入连接产
物10μl，充分混匀后冰浴1.5min；
3.加入感受态细胞100μl，轻轻混匀，冰浴5-10min；
4.42℃静止水浴热激2min，然后立刻置冰上冷却5min；
5.加850μl LB液体培养基，37℃，200r/min摇床培养1h；
6.5000r/min，常温离心2min，收集菌体，加入200μl新鲜LB培养基重悬；
7.取100μl转化液涂布于含l00mg/ml Amp的LB培养基平板上(预先30min涂布8μl
20mg/ml X-Gal和4μl200mg/ml IPTG混合液)，进行蓝白斑筛选；37℃恒温培养过
夜。
\
实验六质粒提取及酶切鉴定
试剂及耗材：
含重组pUC18质粒的大肠杆菌DH5α
LB液体培养基
提取缓冲液Solution I：母液1000ml
50mmol/L葡萄糖20×1M50ml
25mmol/L Tris-Cl pH8.040×1M25ml
10mmol/L EDTA pH8.050×0.5M20ml
提取缓冲液Solution II：现配母液10ml
0.2N NaOH2N NaOH2ml
1%(m/V)SDS10%(m/V)SDS1ml
水7ml
提取缓冲液Solution III：1000ml
5mol/L乙酸钾294.42g
冰乙酸115ml
H20285ml
异丙醇、70%乙醇、RNase A、TE(pH8.0)
50×TAE、琼脂糖、溴酚兰、DNA Marker
步骤：
（一）质粒提取
1.从转化平板中挑白色单菌落接种到含l00mg/ml Amp的LB液体培养基中，于37℃，
300r/min摇床培养16-18h；
2.取1.5ml菌液于2ml离心管中，于4℃8,000r/min离心2min；
3.完全去上清，加入150μl预冷的Solution I，涡旋振荡悬浮菌体；
4.加入300μl新配制的Solution II，轻轻倒置混匀，室温静置5min；
5.加入200μl预冷的Solution III，轻轻混匀后置冰上5-10min；
6.12,000r/min，4℃离心5min，取上清于一新离心管，加入等体积的异丙醇，混匀室温放
置10min以上；
7.12,000r/min，室温离心6min，去上清，用1ml预冷的70%乙醇洗沉淀2-3次，超净台
中风干沉淀；
8.用20μl含RNase A(20μg/μl)的TE(pH8.0)溶解沉淀，于37℃温育30min左右，以除
去RNase；
9.质粒琼脂糖凝胶电泳检测，于-20℃冰箱保存备用。
（二）酶切鉴定
酶切反应体系：
10×buffer H 2.5μl
Eco RI(10U/μl)0.5μl
Ham III0.5μl
重组质粒(1μg/μl)10μl
ddH2011.5μl
总体积25μl
1.酶切：按照以上酶切体系各成分加于0.5ml离心管中,充分混匀后，置于37℃水浴酶
切3h以上；
2.检测：用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物，筛选阳性克隆。
实验七叶盘法转基因烟草技术
一、实验目的
学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程
二、实验原理
土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌,能够感染植物的受伤部位。农杆菌中有一种环形的Ti 质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物染色体上。这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养几天，转移到分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后生出完整的植株。
三、仪器、材料与试剂
（一）材料
普通烟草无菌苗叶片
（三）试剂
农杆菌YEB培养基配方:
Beef extract（牛肉浸膏）5g/L
Yeast extract（酵母膏）1g/L
Peptone（蛋白胨）5g/L
Sucrose（蔗糖）5g/L
MgSO4·7H2O（硫酸镁）0.04g/L
Agar（琼脂） 1.5g/100mL
pH7.4
利福平，Kan
MS液体培养基（稀释）2L
预培养/共培养基：MS+BA2.0mg/L十IAA0.5mg/L300瓶
选择培养：MS+BA2.0mg/L+IAA0.5mg/L+Kan+羧苄青霉素或头孢霉素
无菌滤纸，牛皮纸，培养皿，三角瓶，无菌水
四、实验步骤
1、无菌受体材料的准备：
先用自来水冲洗干净外植体，用70％的酒精表面消毒45秒，再用20％的次氯酸钠消毒10min，然后再用无菌水冲洗5次。然后用灭菌的剪刀将烟草叶片剪成5mm×5mm左右（尽
量多伤口），先浸泡在MS液体培养基中，以免叶片失水变干。
2、受体材料预培养：将叶盘接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下：预培养2～3天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。
3、农杆菌培养：
①从平板上挑取单菌落，接种到20mL附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃,180r/min培养至OD600为0.6～0.8。
②取OD600为0.6～0.8的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6小时左右，OD600为0.2～0.5时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；
4、侵染：于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5分钟，不同材料处理时间不同）。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
5、共培养：将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上（烟草为MS十IAA0.5mg/L+BA2.0mg/L)，在28℃暗培养条件下共培养2～4天（光对某些植物的转化有抑制作用，故需暗培养，共培养时间因不同植物而异）。
6、选择培养：将经过共培养的外植体转移到加有选择压（以NPT－Ⅱ为标记基因时一般使用卡那霉素，烟草以100mg/L的选择浓度为宜，其它植物需通过敏感实验确定）的脱菌（附加250～500mg/L的羧苄青霉素或头孢霉素，抑制农杆菌生长）分化或愈伤组织诱导培养基上，在光照为2000～10000lx、25℃条件下进行选择培养。
7、继代选择培养：选择培养2～3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入相应的选择培养基中进行继代扩繁培养，或转入附加选择压的生长或分化培养基中令其生长或诱导分化。
8、生根培养：待不定芽长到1cm以上时，切下并插入含有选择压的生根培养基上进行生根培养，两周左右长出不定根。
五、实验结果
观察实验现象并记录。
六、结果讨论与分析
七、思考题
1、简述农杆菌介导途径进行基因转化的机理及操作步骤。
2、根据实验结果，分析影响基因转化效率的因素。
整个基因克隆实验流程完整
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
常用分子克隆实验方法
常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的 溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口， 再用移液枪吸走大部分残余液体； (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残 液，晾干5min； (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。 方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏。
南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期 实验地点 2015- 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方 法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原 理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体
三、材料与方法： 1.实验材料： 质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂： 即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit） 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验仪器： 超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等 2.方法 分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子 四、实验具体流程 1.获取外源基因 1)碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒
分子克隆技术试卷
分子克隆技术 一、填空题 1.PCR反应中加入矿物油的作用是___________________________。 2.分子克隆实验中外源DNA和载体片段连接之前，要对载体进行去磷酸化处理，我 们在本次试验中去磷酸化使用的碱性磷酸酶是___________________________。它 的目的是___________________________。 3.用α互补筛选转化子是，带有外源片段的菌落显___________________________色。 4.Southern杂交中进行与杂交的目的是___________________________。 5.凝胶糖凝胶电泳时加入loading buffer作用是___________________________和 ___________________________。 6.影响琼脂糖凝胶电泳的因素主要有___________________________、 ___________________________、___________________________、 ___________________________、___________________________。 二、简答题 1.简述PCR反应体系中都有哪些成分及各成分的作用。 2.为得到质量较好的水稻RNA，抽提前应做如何准备？RNA抽提过程中、RNA的 保存及以后对RNA的操作过程中应特别注意什么？ 3.简述为防止放射性同位素外照射及内照射对人体造成伤害，在操作放射性同位素 时，我们可以采取哪些措施进行防护？ 4.简述影响电转化感受态细胞转化效率的因素有哪些？ 5.质粒抽提时用到的SolutionI，SolutionII，SolutionIII及异丙醇分别起什么作用？操 作时应注意什么？ 三、分析问答题 1.描述并图示pUC19载体DNA及其在HindIII位点克隆了外源DNA片段的质粒DNA 和水稻总DNA及它们的HindIII和BamH1酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时的带型。 2.利用质粒载体克隆外源DNA片段主要包括哪些步骤？涉及到哪些工具酶？要获得 理想的结果，各步骤操作中应主要注意哪些事项？ 3.在Southern杂交实验中，同一根杂交管内的膜曝光的····（原卷此处不清晰）冲 洗后，有些组X光片信号很强，有些组信号很弱，有的样品点样孔附近有较强的 信号，但是有的地方信号较弱，请分析造成这种结果的可能原因。 4.下面是本次课生物技术班某组β-active基因RT-PCR（反转录前没有对总RNA进 行去除DNA 的处理）试验的琼脂糖凝胶电泳图，凝胶上共点了6个样，PCR使用 的模板从左至右分别是：该组提取的水稻总DNA，该组提取的水稻总RNA，该组 的4个反转录产物。（原卷本题图不清晰） 请问： 提取的RNA的质量如何？ RT-PCR是否成功？为什么会出现这样的结果？ 有哪些地方需要改进？
基因克隆步骤
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 [实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知） 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。[仪器、材料与试剂] (一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器 (二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿 (三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB 培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(tryptone) 10g酵母提取物(yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。 3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。 [实验步骤]
1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。 2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。 3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。 4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。 5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。 转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。 3．冰上放置30分钟。 4．42℃水浴热激60秒。 5．冰上放置2分钟。 6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。 7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。
分子克隆实验标准步骤
分子克隆实验标准步骤 一、 常规分子克隆实验流程： 二、 分子克隆实验标准步骤（含实验编号）： 1. PCR 扩增目的基因（编号Clone SOP-1） 以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例 体系（50ul ）： 10×KOD buf 5ul dNTP(2mM) 5ul Mg 2+ 3ul Primer1 1ul Primer2 1ul Template50-200ng KOD0.5ul ddH 2O up to 50ul 程序： 95℃2min 98℃10s 58℃30s 35cycle 68℃2kb/min 68℃7min 12℃∞
2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2） 琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。 胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。 ③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀 的胶层。④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。 3.试剂盒回收DNA片段（编号Clone SOP-3） 以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例 使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 ①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL， 12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） ②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中， 称取重量。 ③向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPN 溶液），60℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。 注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA 的能力较强。 ④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑥重复操作步骤⑤。 ⑦将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附 柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 ⑧将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB或 ddH2O，室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。 4.酶切反应（编号Clone SOP-4） 以本实验室常用酶FastDigest restriction enzymes（Thermo）为例 双酶切体系（若是单酶切则只用加一种酶）： 10×FastDigest? buffer or 10×FastDigest? Green buffer 5ul FastDigest restriction enzyme 1 0.5-1ul FastDigest restriction enzyme 2 0.5-1ul DNAN ddH2Oupto50ul 酶切体系混合均匀后置于37℃条件下反应，反应时间应大于30min，若是载体（2-3ug）至少酶切2小时。 5.酶切产物的回收（编号Clone SOP-5） 以本实验室常用Axygen?AxyPrep?PCRClean-UpKit（Axygen）为例 ①在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加入3个体积的BufferPCR-A（若BufferPCR-A
植物基因克隆实验指导
植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。
4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。
实验室常用生化试剂配方
实验室常用生化试剂配方 1.常用抗生素配制以及使用说明（参考链霉菌室操作手册2019版） 抗生素 英文名称及缩写 抗性基因 贮藏液浓度(mg/ml) 100 25(无水乙醇配) 50 25 50 50 25(DMSO配) 100 50 35 25(0.15M NaOH配) 50(DMSO配) 50 50 MM 使用终浓度（μg/ml）链霉菌 2CM YEME 大肠杆菌 LA或LB 氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素紫霉素萘锭酮酸 TMP Ampicillin, Amp bla Chloramphenicol, Cml Hygromycin, Hyg Kanamycin, Km Spectinomycin, Spc Streptomycin, Str Thiostrepton, Thio Erythomycin, Ery Apramycin, Am Viomycin,Vio Nalidixic acid Trimethoprim cat hyg aac/aph aadA str tsr ermE aac(3)IV vph －* 10 10 2 5 10 5 100 10 －－ 25 25 20 25 10 － 50 －－－－－－ 2.5 － 5 50-100 25 － 25 50 25 25 20 10-30
注意事项： (1) –表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制，配制过程请 确保抗生素粉末充分溶解混匀后再分装； （2）Km 和Am有交叉抗性，同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并 设置阴性对照； （3）Hyg、Vio易见光分解，配制好后应用锡箔纸包好,使用过程中建议避光操作。有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, Vio （4）用无菌水配制的抗生素需在超净工作台内用0.22 μm一次性过滤器过滤除菌并 分装；氯霉素、TMP、硫链丝菌素可以在超净工作台外配制分装，无需过滤除菌，但需确 保配制贮存液所用溶剂（无水乙醇、DMSO）未遭受污染，建议配制氯霉素时使用新的无水 乙醇，不要使用抽提质粒或总DNA时用的无水乙醇，以防止污染；DMSO，即二甲亚砜，易 挥发，有剧毒； （5）长期不用的抗生素请置于-20℃保存，抗生素粉末按照使用说明一般置于4℃保存，经常使用时可以暂置于4℃保存； （6）抗生素的实际使用浓度请结合实验经验进行适当调整； (7)配制抗生素时应尽量一次性称取抗生素粉末，配制过程中建议穿工作服，戴一次 性橡胶手套及口罩，及时清理称量配制抗生素时使用的台面及器具，以避免抗生素及溶剂 对自身的损伤及对工作环境的污染。 注意事项： (1)表中所列酶均可以用无菌水配制，也可以用相应的缓冲液配制，缓冲液配制方法 参考《分子克隆实验指南（第3版）》： 蛋白酶 K缓冲液：50 mM Tris（pH 8.0），1.5 mM 乙酸钙； RNase A缓冲液：TE （pH 7.6）：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA；溶菌酶缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH 8.0）； (2) RNase A配制好后沸水浴处理5 min，取出贮存RNase A后首次使用时也需沸水 浴处理5 min后再使用； （3）制备原生质体时使用的溶菌酶配制时需过滤除菌，其他情况一般无需过滤除菌； （4）所有酶均应在-20℃保存，使用过程中避免反复冻融，配制过程中尽量避免外界 污染。 （1）IPTG用无菌水配制，0.22μm一次性滤膜过滤除菌，分装保存于-20℃；
整个基因克隆实验流程(完整)
整个基因克隆实验流程(完 整) -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研 钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置 3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相； RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个 新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心 5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室 温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，
分子克隆技术实验讲义(最终版)
分子克隆技术实验讲义 黑龙江大学生命科学学院 2016年3月 甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定 一、实验目的 1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。 2、学习和掌握质粒、T载体的特点。 3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。 4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。 5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。 6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。 7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。 8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。 二、相关知识
（一）T载体的制备 pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T-A Cloning）的商业化专用载体，由pΜC 18载体改建而成。在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点，用EcoRⅤ进行酶切反应后，再左两侧的3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。 （二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆） 把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒， 这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即DNA的重新组合。为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍 末端（compatible end），以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。 相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。 （三）大肠杆菌感受态细胞的制备 外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大 量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌 宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。感受态细胞（competent cell）是经过一定方法处理后，具有 接受外源DNA能力的大肠杆菌，只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。 相关知识点：（1）克隆；（2）宿主细胞的定义及分类；（3）感受态细胞定义及其功能；（4）转化定义及方法（DMSO、MnCl2、TB aq、PEG）等。 （四）重组DNA的转化及重组子的鉴定 将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两 个目的，一是大量产生重组DNA分子，在完成连接反应后，重组DNA分子往往只有纳克级的量，不易 操作和进行下一步的分析，若把重组DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆，克隆 中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子，这样重组DNA分子的量就多了；二是对重组DNA 分子进行纯化，在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子，连接过程完成以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接 上的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分子，未连接上的载体和DNA片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降 解掉；对克隆工作带来影响的是后两种分子，因为它们都为环状，在细菌细胞中都能复制，因而都能产 生克隆，但是每个细胞中只能导入一个质粒DNA分子，每个单克隆都是由一个细胞形成的，因此在每个
分子生物学实验
分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；
山羊基因克隆实验方案设计
山羊基因克隆实验方案设计 第五组 1. 提取DNA 2. DNA检测（电泳） 3. 目的DNA片段基因扩增（PCR） 4. DNA检测（电泳） 5. 目的基因片段与载体连接 6. 大肠杆菌感受态细胞的制备 7. 导入受体细胞与蓝白斑筛选 8. 阳性克隆鉴定 9. DNA测序 一、DNA提取 【实验目的】 指导DNA提取原理（羔羊片），熟悉DNA提取步骤。 【实验原理】 组织细胞被PK消化后，经过萃取漂洗获得纯净DNA。 【实验步骤】 1. ＜30 mg组织，用眼科剪剪碎，加入200 TL buffer＋20 μL PK，55℃水浴1-3 h。 2. 加入220 μL buffer BL，振荡15 s，70 ℃放置10 min，溶液变清亮。 3. 10000 r离心2 min，移上清液至新离心管。 4. 加220 μL无水乙醇，充分振荡15 s，可能会出现絮状沉淀。 5. 将溶液和絮状物加入到吸附柱中，12000 r离心30 s，弃废液。 6. 向吸附柱加入500 μL WB，12000 r离心30 s，弃废液。 7. 向吸附柱加入500 μL wash buffer，12000 r 离心30 s，弃废液，空滤一次。 8. 将吸附柱转入干净离心管，加入50 μL TE，放置5 min，12000 r离心2 min，备检。 二、DNA电泳检测 【实验原理】 琼脂糖凝胶电泳技术是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。琼
脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。 【仪器与试剂】 琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液（40mMTris，20mMNaAc，1mMEDTAPH8.0）、载体缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）、溴化乙锭水溶液（10mg/ml）、凝胶槽、电泳仪 【实验步骤】 1．取琼脂糖0.9g，加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，100℃加热溶解。 2．平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5~1mm）。 3．铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至50℃左右倒入凝胶槽，胶厚一般为5~8mm。 4．待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2~3mm，小心拔出梳子。 5．DNA样品与载体缓冲液5：1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）。 6．打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm。 7．据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的涌动距离在5sRNA和0.3kbDNA 带之间）。 8．电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。 三、目的DNA片段基因扩增（PCR） 方案1：遗传学实验31，PCR扩增基因片段 方案2： 【实验目的】 了解多聚合酶链反应DNA 扩增技术的基本原理和实验应用，掌握PCR反应基本技术。【实验原理】 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将
分子生物学实验教学大纲
分子生物学实验教学大纲 一、说明 1、课程类别 专业课 2、教学目的 通过实验教学使学生了解、验证、巩固和加深所学理论知识，掌握分子生物学研究的基本实验技能，如：质粒（植物/动物）DNA的分离及纯化、植物总RNA的提取，琼脂糖凝胶电泳等技术。培养科学、严谨、实事求是的学风，提高动手能力、分析问题解决问题的能力以及创新性思维。 3、教学内容 本门课教学主要以某一基因为主线，从基因的分离、纯化、克隆、及鉴定等方面入手，帮助学生掌握分子生物学基本的实验方法和技能，在此基础上对分子生物学方法的应用和意义有一个整体的把握，在可能的情况下同时提供多种实验材料让学生自行设计和准备实验，培养其独立科研能力。 4、教学方式 以实验操作为主，配合原理教授、实践性教学、多媒体教学和学生实验报告、撰写论文、自学等方法进行学习。 5、考核内容及方式 实验操作 30％，实验结果 30％，实验报告 30％，考勤 10％。参照以下几个方面评定成绩。 （一）认真预习实验并书写实验预习报告； （二）实验态度认真，操作规范，遵守实验室管理规定； （三）按规定步骤进行实验，实验结果准确； （四）认真撰写实验报告。 6、本课程授课时间（学期），总学时数。 本课程在三年级开设，总计36学时，学时分配见下表: 教学时数分配表
二、教学内容 1、教学目标（课程） 通过本课程的教学使学生了解和掌握现代分子生物学研究的基本原理、方法、技术和技能，包括DNA 提取、PCR 扩增等。通过学生的独立实验设计和实践，训练学生分析问题和解决问题的能力及实际动手能力，同时培养学生的创新思维以及对生命科学探索的兴趣和爱好。 2、教学内容（分章节描述） 实验一质粒DNA的提取 1．主要内容碱裂解法提取载体质粒。 2．教学要求学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术。 实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA 1．主要内容（1）电泳基本知识介绍（2）琼脂糖凝胶的制备（3）质粒的定量。 2．教学要求掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 实验三植物总RNA的提取及检测 1．主要内容（1）RNA的提取（2）核酸的琼脂糖凝胶电泳（3）紫外分光光度法测定核酸的含量和纯度。 2．教学要求掌握植物组织中提取RNA的基本原理和实验技术方法。 实验四动物总DNA的提取 1．主要内容（1）总DNA的提取（2）核酸的琼脂糖凝胶电泳（3）紫外分光光度法测定核酸的含量和纯度。 2．教学要求掌握动物组织中提取总DNA的基本原理和实验技术方法。 实验五 PCR基因扩增 1．主要内容（1）PCR基本原理（2）PCR溶液体系的制备（3）PCR仪使用 2．教学要求掌握聚合酶链式反应的基本原理和实验技术方法。 （二）重点和难点
分子克隆技术实验指导
分子克隆技术 DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆，是在体外对DNA分子按照既定的目的进行人工重组，并导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA 分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的过程。 其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）经过特定限制性酶切割以及与目标载体连接，组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质，并且来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。 分子克隆技术的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。 实验前准备 实验开始前，需准备好所需的试剂，如PCR扩增及酶切，连接所需酶类试剂及相应的buffer，均为TaKaRa产品分装，Buffer、dNTP、引物试剂等需要从-20℃取出至室温融化、涡旋震荡混匀离心后使用，酶类试剂从-20℃取出瞬时离心（小于4000 rpm）放置冰浴中备用。 还有各项实验所需的药品（如琼脂糖），以及配置好培养基，抽提质粒用的溶液一、二、三等试剂。 本次实验所涉及的常规仪器及耗材有：Thermo Scientific Arktik PCR仪，水平电泳槽，超净工作台，恒温水浴锅，紫外照胶仪，赛默飞公司提供的F1，F2和F3一系列量程的单道移液器等仪器，1.5ml离心管，玻璃试管，赛默飞公司提供的QSP盒装吸头及15ml离心管等。 接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先在GenBank中查询目的基因序列，然后根据得到的序列进行酶切位点分析及引物的设计，通过RT-PCR获取目的基因，酶切以及与载体连接，转化进入宿主菌中，针对得到的菌落进行菌落PCR快速筛选，得到初步的阳性克隆，最后通过质粒提取及鉴定，得到的阳
实验室常用液体配制标准操作规程
常用液体配制标准操作规程（SOP） 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心 二〇〇八年九月修订
目录 一、细菌培养系统（责任人：郑子峥） 二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜） 三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕） 四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛） 五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、） 六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉） 一、细菌培养系统 1、LB培养基:
每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨 10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。 2、固体培养基: LB培养基中加入琼脂至％，高压蒸汽灭菌15min后使用。 3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）： 注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。 注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。 4、%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan） 注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含卡那霉素。取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。 注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。 5、细菌培养： 配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm 培养。剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。
RNA干扰载体的构建的实验流程图
RNA干扰载体的构建的实验流程 RNA干扰载体主要用来研究基因表达调控，RNA干扰技术已已被广泛用于基因结构功能研究和传染性疾病及基因治疗领域，进行RNA干扰实验首先是构建RNA干扰载体，本文以pRI系列载体为例论述了干扰载体的构建的实验流程。 产品技术背景 pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。H1启动子在哺乳动物细胞合成类似siRNA分子的小分子RNA。由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA 经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。 pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。插入寡核苷酸设计
pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。 合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体XhoI，BglII位点之间，位于载体上H1启动子下游正确的位置上。连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。 1. 选择干扰序列 在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效果。我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列： 推荐长度为19 nt，采用21 nt序列也可以取得良好效果。 RNA干扰序列中不包含大于3 nt的连续相同碱基。 RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平(推荐GC含量在35%到50%之间)。 不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。 确保RNA干扰序列与其它基因没有较高的同源性。 方向：在编码mRNA的正义链上选择RNA干扰序列。