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微生物群落多样性测序与功能分析(总结版)

微生物群落多样性测序与功能分析（总结版）

微生物群落测序是指对微生物群体进行高通量测序，通过分析测序序列的构成分析特定环境中微生物群体的构成情况或基因的组成以及功能。借助不同环境下微生物群落的构成差异分析我们可以分析微生物与环境因素或宿主之间的关系，寻找标志性菌群或特定功能的基因。对微生物群落进行测序包括两类，一类是通过16s rDNA，18s rDNA，ITS区域进行扩增测序分析微生物的群体构成和多样性；还有一类是宏基因组测序，是不经过分离培养微生物，而对所有微生物DNA进行测序，从而分析微生物群落构成，基因构成，挖掘有应用价值的基因资源。

以16s rDNA扩增进行测序分析主要用于微生物群落多样性和构成的分析，目前的生物信息学分析也可以基于16s rDNA的测序对微生物群落的基因构成和代谢途径进行预测分析，大大拓展了我们对于环境微生物的微生态认知。

目前我们根据16s的测序数据可以将微生物群落分类到种（species）（一般只能对部分菌进行种的鉴定），甚至对亚种级别进行分析，

几个概念：

16S rDNA（或16S rRNA）：16S rRNA 基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因，长度约为1542bp，其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能体现物种间的差异。16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为主,核心是研究样品中的物种分类、物种丰度以及系统进化。

OTU：operational taxonomic units (OTUs)在微生物的免培养分析中经常用到，通过提取样品的总基因组DNA，利用16S rRNA或ITS的通用引物进行PCR 扩增，通过测序以后就可以分析样品中的微生物多样性，那怎么区分这些不同的序列呢，这个时候就需要引入operational taxonomic units，一般情况下，如果序列之间，比如不同的16S rRNA序列的相似性高于97%就可以把它定义为一个OTU，每个OTU对应于一个不同的16S rRNA序列，也就是每个OTU对应于一个不同的细菌（微生物）种。通过OTU分析，就可以知道样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度。

测序区段：由于16s rDNA较长（1.5kb），我们只能对其中经常变化的区域也就是可变区进行测序。16s rDNA包含有9个可变区，分别是v1-v9。一般我们对v3-v4双可变区域进行扩增和测序，也有对v1-v3区进行扩增测序。

?16s rDNA测序首先需要提取环境样品的DNA，这些DNA可以来自土壤、粪便、空气或水体等任何来源。

?提取DNA后需要经过质检和纯化，一般16s rDNA测序扩增对DNA的总量要求并不高，总量大于100ng，浓度大于10ng/ul一般都可以满足要求。如果是来自和寄主共生的环境如昆虫的肠道微生物，提取时可能包括了寄主本身的大量DNA，对DNA的总量要求会提高。微生物菌群多样性测序受DNA提取和扩增影响很大，不同的扩增区段和扩增引物甚至PCR循环数的差异都会对结果有所

影响。因而建议同一项目不同样品的都采用相同的条件和测序方法，这样相互之间才存在可比性。

?完成PCR之后的产物一般可以直接上测序仪测序，在上机测序前我们需要对所有样本进行定量和均一化，通常要进行荧光定量PCR。完成定量的样品混合后就可以上机测序。

?16s rDNA测序目前可以采用多种不同的测序仪进行测序，包括罗氏的454，Illumina的Novoseq, MiSeq，Hiseq，Life的PGM 或Pacbio 以及nanopore 的三代测序仪。不同的仪器各有优缺点，目前最主流的是Illumina 公司的MiSeq，因为其在通量、长度和价格三者之间最为平衡。MiSeq 测序仪可以产生2x300 bp 的测序读长，Hiseq 和Novoseq 可以生成2x250bp 或者2x150bp 的测序读长，且通量较大。

二、方法/步骤

1. 1

2.1 16s rDNA分析基本流程：

2. 2

2.2 原始数据处理：

原始测序数据需要去除接头序列，根据overlap 并将双端测序序列进行拼接成单条序列，同时对序列质量进行质控和过滤。提供已知数据库GreenGenes 作为参考，去除嵌合体序列得到最终可用的序列。

提取出的数据以fastq 格式保存，每个样本有fq1 和fq2两个文件，里面为测序两端的reads，序列按顺序一一对应。

原始fastq格式是一个文本格式用于存储生物序列（通常是核酸序列）和其测序对应的质量值。这些序列以及质量信息用ASCII字符标识。

3. 3

2.3 OTU分类和统计：

OTU(operational taxonomic units) 是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。通常按照97% 的相似性阈值将序列划分为不同的OTU，每一个OTU 通常被视为一个微生物物种。相似性小于97%就可以认为属于不同的种，相似性小于93%-95%，可以认为属于不同的属。样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度都是基于对OTU的分析。

2.3.1 使用QIIME（version 1.8.0）工具包进行统计注释。

使用QIIME（version 1.9.0, https://www.wendangku.net/doc/d12403000.html,/qiime/）的ucluster方法根据97%的序列相似度将所有序列进行同源比对并聚类成operational taxonomic units (OTUs)。然后与数据库GreenGenes（version gg_13_8, https://www.wendangku.net/doc/d12403000.html,/cgi-bin/JD_Tutorial/nph-16S.cgi）进行比对，比对方法uclust，identity 0.9 。

然后对每个OTUs进行reads数目统计。

下面的2个表，其中一个表是对每个样本的测序数量和OTU数目进行统计，并且在表栺中列出了测序覆盖的完整度（显示前10个样本）。

另一个表是对每个样本在分类字水平上的数量进行统计，并且在表栺中列出了在每个分类字水平上的物种数目（显示前10个样本）。

可以看到绝大部分的OTU都分类到了属（Genus），也有很多分类到了种（Species）。但是仍然有很多无法完全分类到种一级，这是由于环境微生物本身存在非常丰富的多样性，还有大量的菌仍然没有被测序和发现。

测序数目统计表主要是对每个样本的测序数量和OTU数目进行统计，并且在表格中列出了测序覆盖的完整度（显示前10个样本，如果样本超过10个，请查看结果中otu_stat.txt文件）

其中SampleName表示样本名称；SampleSize表示样本序列总数；OTUsNumber表示注释上的OTU数目；OTUsSeq表示注释上OTU的样本序列总数。

Coverage是指各样品文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低。该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。

计算公式为：C=1-n1/N 其中n1 = 只含有一条序列的OTU的数目；N = 抽样中出现的总的序列数目。

分类水平统计表主要是对每个样本在分类学水平上的数量进行统计，并且在表格中列出了在每个分类学水平上的物种数目（只显示前10个样本，如果样本超过10个，请查看结果中taxon_all.txt文件）

其中SampleName表示样本名称；Phylum表示分类到门的OTU数量；Class 表示分类到纲的OTU数量；Order表示分类到目的OTU数量；Family表示分类到科的OTU数量；Genus表示分类到属的OTU数量；Species表示分类到种的OTU数量。

2.3.2 我们还可以对这些种属的构成进行柱状图显示：

横坐标中每一个条形图代表一个样本，纵坐标代表该分类层级的序列数目或比例。同一种颜色代表相同的分类级别。图中的每根柱子中的颜色表示该样本在不同级别（门、纲、目等）的序列数目，序列数目只计算级别最低的分类，例如在属中计算过了，则在科中则不重复计算。

Q: 为什么要选择V3-V4区的测序长度？为什么有些文献是V6区，有什么区别？

A: 16S rRNA总长约1540 bp，包含9个可变区。由于高通量测序的测序长度的限制，不可能将16S rRNA的9个可变区全部测序，所以在PCR扩增时往往只能选择1-3个可变区作为扩增片段。Kozich 等评估了Miseq测序仪分析的不同16S rRNA可变区的准确性发现，测定V4 区效果最佳。根据我们的测序长度，v3-v4区是最佳选择。

5. 5

2.3.3 我们还需要对样本之间或分组之间的OTU进行比较获得韦恩图：

注意，韦恩图目前一般最多只能显示5个样本或分组，过多的样本无法进行韦恩图绘制

6. 6

2.4 样品构成丰度：

2.4.1稀释曲线

微生物多样性分析中需要验证测序数据量是否足以反映样品中的物种多样性，稀释曲线（丰富度曲线）可以用来检验这一指标。

稀释曲线是用来评价测序量是否足以覆盖所有类群，并间接反映样品中物种的丰富程度。稀释曲线是利用已测得16S rDNA序列中已知的各种OTU的相对比例，来计算抽取n个（n小于测得reads序列总数）reads时出现OTU数量的期望值，然后根据一组n值（一般为一组小于总序列数的等差数列）与其相对应的OTU 数量的期望值做出曲线来。当曲线趋于平缓或者达到平台期时也就可以认为测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种；反之，则表示样品中物种多样性较高，

还存在较多未被测序检测到的物种。

下图中的稀释曲线

横坐标代表随机抽取的序列数量；纵坐标代表观测到的OTU数量。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量，如果曲线趋于平坦表明测序已趋于饱和，增加测序数据无法再找到更多的OTU；反之表明不饱和，增加数据量可以发现更多OTU。

7.7

2.4.2 Shannon-Winner曲线

Shannon-Wiener 曲线，是利用shannon指数来进行绘制的，反映样品中微生物多样性的指数，利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。

与上图一样，横坐标代表随机抽取的序列数量；纵坐标代表的是反映物种多样性的Shannon指数。

样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量，如果曲线趋于平坦表明测序已趋于饱和，增加测序数据无法再找到更多的OTU；反之表明不饱和，增加数据量可以发现更多OTU。

其中曲线的最高点也就是该样本的Shannon指数，指数越高表明样品的物种多样性越高。

Q: Shannon指数怎么算的？

A: Shannon指数公式：

其中，Sobs= 实际测量出的OTU数目；ni= 含有i 条序列的OTU数目；N = 所有的序列数。

8.8

2.4.3 Rank-Abundance曲线

用于同时解释样品多样性的两个方面，即样品所含物种的丰富程度和均匀程度。物种的丰富程度由曲线在横轴上的长度来反映，曲线越宽，表示物种的组成越丰富；

物种组成的均匀程度由曲线的形状来反映，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度越高。

一般超过20个样本图就会变得非常复杂而且不美观，所以一般20个样本以下会做该图，图片保存为结果目录中rank.pdf。

横坐标代表物种排序的数量；纵坐标代表观测到的相对丰度。

样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的物种数量，如果曲线越平滑下降表明样本的物种多样性越高，而曲线快速陡然下降表明样本中的优势菌群所占比例很高，多样性较低。

9.9

2.5 Alpha多样性（样本内多样性）

Alpha多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性，常用的度量指标有Chao1 丰富度估计量（Chao1 richness estimator）、香农- 威纳多样性指数（Shannon-wiener diversity index）、辛普森多样性指数（Simpson diversity index）等。

计算菌群丰度：Chao、ace；

计算菌群多样性：Shannon、Simpson。

Simpson指数值越大，说明群落多样性越高；Shannon指数越大，说明群落多样性越高。表中显示前10个样本，如果样本大于10个，详见结果目录中的alpha_div.txt。

Q: 能不能解释下每个指数（如chao1、shannon）？

A: Chao1：是用chao1 算法估计群落中含OTU 数目的指数，chao1 在生态学中常用来估计物种总数，由Chao (1984) 最早提出。Chao1值越大代表物种总数越多。

Schao1=Sobs+n1(n1-1)/2(n2+1)

其中Schao1为估计的OTU数，Sobs为观测到的OTU数，n1为只有一条序列的OTU数目，n2为只有两条序列的OTU数目。

Shannon：用来估算样品中微生物的多样性指数之一。它与Simpson 多样性指数均为常用的反映alpha 多样性的指数。Shannon值越大，说明群落多样性越高。

Ace：用来估计群落中含有OTU 数目的指数，由Chao 提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一，与Chao1 的算法不同。

Simpson：用来估算样品中微生物的多样性指数之一，由Edward Hugh Simpson ( 1949) 提出，在生态学中常用来定量的描述一个区域的生物多样性。Simpson 指数值越大，说明群落多样性越高。

辛普森多样性指数=随机取样的两个个体属于不同种的概率

=1-随机取样的两个个体属于同种的概率

10.10

Alpha多样性指数差异箱形图

分别对Alpha diversity 的各个指数进行秩和检验分析（若两组样品比较则使用R 中的wilcox.test 函数，若两组以上的样品比较则使用R 中的kruskal.test 函数），通过秩和检验筛选不同条件下的显著差异的Alpha Diversity指数。

11.11

2.6 Beta多样性分析（样品间差异分析）

Beta多样性度量时空尺度上物种组成的变化, 是生物多样性的重要组成部分, 与许多生态学和进化生物学问题密切相关, 因此在最近10年间成为生物多样性研究的热点问题之一。2

2.6.1 PCoA分析

PCoA（principal co-ordinates analysis）是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，通过一系列的特征值和特征向量进行排序后，选择主要排在前几位的特征值，PCoA 可以找到距离矩阵中最主要的坐标，结果是数据矩阵的一个旋转，它没有改变样品点之间的相互位置关系，只是改变了坐标系统。通过PCoA 可以观察个体或群体间的差异。

每一个点代表一个样本，相同颜色的点来自同一个分组，两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小。PCoA有多张图，分别代表的PCoA1-2,2-3,3-1。

12.13

2.6.2 NMDS分析（非度量多维尺度分析）

NMDS（Nonmetric Multidimensional Scaling）常用于比对样本组之间的差异，可以基于进化关系或数量距离矩阵。

横轴和纵轴：表示基于进化或者数量距离矩阵的数值在二维表中成图。

与PCA分析的主要差异在于考量了进化上的信息。

每一个点代表一个样本，相同颜色的点来自同一个分组，两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小。

13.14

2.6.3 PCA分析

主成分分析PCA（Principal component analysis）是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，通过一系列的特征值和特征向量进行排序后，选择主要的前几位特征值，采取降维的思想，PCA 可以找到距离矩阵中最主要的坐标，结果是数据矩阵的一个旋转，它没有改变样品点之间的相互位置关系，只是改变了坐标系统。详细关于主成分分析的解释推荐大家看一篇文章，https://www.wendangku.net/doc/d12403000.html,/aywhehe/article/details/5736659 。通过PCA 可以观察个体或群体间的差异。

每一个点代表一个样本，相同颜色的点来自同一个分组，两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小。

2.6.4 以上三个图可能遇到的问题：

1：PCA，PcoA，NMDS分析分别是基于什么数据画的？

回答：PCA，PcoA，NMDS分析均是基于OTU分类taxon数据所画，用的是R语言Vegan包中的相关函数画成，其中PcoA与NMDS还要基于样本之间的距离矩阵才能画成。

2：PCA分析如果图中大部分点集中在一起，少数点在很远的外围，是什么原因造成的？

回答：是因为样本OTU分类时候，少数样本某些菌含量特别高所造成，导致这些样本偏离正常范围，建议单独拿出这些样本观察，看是否是实验错误。3：PCA分析时，不是有PC1，PC2，PC3三个坐标吗？是给出三张图吗？还是三维立体图？

回答：PCA作图时，会得出PC1，PC2，PC3三个坐标，可以根据PC12,PC13,PC23分别作图，一般给出的是PC12的图，当PC12图质量不好，看不出明显的样本分类效果时，可以看PC13或PC23的图分类是否清晰，也可以用R语言rgl包做出PC123三维图。

QIIME本身结果中有提供PCA的三维图结果，可以通过网页打开。

高通量测序：环境微生物群落多样性分析

(5)高通量测序：环境微生物群落多样性分析微生物群落多样性的基本概念环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面，对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量测序技术（尤其是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重要的理论和现实意义。在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微生物群

落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传染病病原微生物。研究方法进展环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学方法等等。近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分子生态学的研究策略注入了新的力量。目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:DGGE/TGGE/TTGE 、 T-RFLP 、SSCP、FISH 、印记杂交、定量 PCR、基因芯片等。 DGGE 等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不只一种 16S rDNA 序列，因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息，还需对每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，此实验操作相对繁琐；此外，采用这种方法无法对样品中的微生物做到绝对定量。生物芯片是通过固定在芯片上的探针来获得微

微生物多样性研究—β多样性分析概述

微生物多样研究中的—β多样性分析概述

一、β-多样性分析介绍 1. β（Beta）Diversity：是对不同样品/不同组间样品的微生物群落构成进行比较分析。 ?β多样性分析前的数据“来源”： 1）OTUs的丰度信息表； 2）OTUs之间的系统发生关系，计算Unweighted Unifrac及Weighted Unifrac距离。 ?通过多变量统计学方法主成分分析(PCA，Principal Component Analysis)，主坐标分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)，非加权组平均聚类分析(UPGMA，Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means)等分析方法，从中发现不同样品（组）间的差异。

2. PCA & PCoA分析 ?主成分分析（PCA）是多变量统计学中最为人熟知的分析方法，它通过线性变换，将原始的高维数据投影至少量新合成的变量（即主成分），从而简化数据结构，展现样品的自然分布。 ?主成分分析不考虑原始变量之间可能存在的相互关系，并且是基于欧式距离评价样品之间的相似度。 ?多维尺度分析与主成分分析类似，但是它可以采用任何距离评价样品之间的相似度。主坐标分析（Principal coordinates analysis，PCoA）是经典的多维尺度分析方法。

3.UniFrac距离 ?由于微生物极其多样，不同微生物彼此之间的系统发育关系往往千差万别，仅仅将群落中不同微生物成员视为相互独立的变量显然并不合理。 ?因此，在比较不同群落样品之间的差异时，需要考虑两个群落成员之间的系统发育关系是否相似。 ?基于这个思想，计算微生物群落样品间距离的UniFrac距离应运而生，通过比较两个群落各自独有的微生物成员之间系统发育关系的远近，更为客观地反映两个群落样品之间的相似程度。

微生物之微生物多样性分析-DGGE

变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳只能通过片段大小不同在同一浓度的胶上电泳迁移率不同而分离不同的DNA片段，对于片段大小接近或相同的DNA片段无法做到有效地分离；DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 即变性梯度凝胶电泳，是利用DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。 DGGE作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于环境科学（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、医学（各种疾病治疗前后，病变部位微生物的差异）、人体（鼻咽、口腔、黏膜、肠道）等领域进行微生物多样性分析。实验流程图：实验结果实验结果包括以下内容 1 引物设计以下是DGGE中常用的引物，我们将根据客户的不同需求，进行针对性的引物设计。引物序列（5’-3’）

细菌 16S V3 区扩增引物 357-F-GC CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG 518r ATTACCGCGGCTGCTGG 引物序列（5’-3’）真核 18S V1-3区扩增引物 Euk1A CTGGTTGATCCTGCCAG EukA516r-GC CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGACCAGACTTGCCCTCC 2 基因组DNA 抽提电泳检测图针对客户的样本来源不同，我们针对性优化不同的基因组抽提方法，已达到提取效果最佳。说明：1-8为样本所抽提基因组DNA，上样量3uL；M 为1kb Marker 上数第一条带为8 kb，中间的亮带为3kb，浓度为30ng/uL，其余为10 ng/uL。 3 目的片段PCR 检测说明：1-8为样本，负为负对照（说明我们的实验没有污染，这对分子实验是至关重要的），上样量为5uL；M 为DL2000 Marker，上样量3uL。其中亮带为20ng/uL，其余为10 ng/uL。 Reconditioning PCR：第一轮PCR 产物将会作为新的模板再进行少数循环的第二轮PCR 扩增，这叫做“Reconditioning PCR”。由于在“ Reconditioning PCR”的过程中引物和模板之

土壤微生物群落多样性研究方法及进展_1

第27卷增刊V ol 127,Sup 1广西农业生物科学Journal o f Guangx i A g ric 1and Biol 1Science 2008年6月June,2008 收稿日期:20080122。基金项目:广西大学博士启动基金项目(X05119)。作者简介:姚晓华(广西大学副教授,博士;E -mail:x hy ao@g xu 1edu 1cn 。文章编号:10083464(2008)增008405 土壤微生物群落多样性研究方法及进展姚晓华 (广西大学农学院,广西南宁530005) 摘要:微生物多样性是指群落中的微生物种群类型和数量、种的丰度和均度以及种的分布情况。研究土壤微生物群落多样性的方法包括传统的以生化技术为基础的方法(直接平板计数、单碳源利用模式等) 和以现代分子生物技术为基础的方法(从土壤中提取DN A ,进行G+C%含量的分析,或杂交分析,或进行PCR,产物再进行D GGE/T GG E 等分析)。现代生物技术与传统微生物研究方法的结合使用,为更全面地理解土壤微生物群落的多样性和生态功能提供了良好的前景。关键词:微生物多样性;生化技术;分子生物学技术;DN A 中图分类号:.Q 938115 文献标识码:A Advancement of methods in studying soil microbial diversity YAO Xiao -hua (Co llege of Ag ricultur e,G uangx i U niv ersit y,N anning 530005,China) Abstract:Species div ersity consist o f species richness,the total number of species,species ev enness,and the distribution of species 1Methods to measure microbial diversity in so il can be categ orized into tw o g roups:biochemica-l based techniques and m olecular -based techniques 1The fo rmer techniques include plate counts,sole carbon so urce utilizatio n patterns,fatty acid methy l ester analysis,and et al 1The latter techniques include G +C%,DNA reassociation,DNA -DNA hy br idization,DGGE/TGGC,and et al 1Ov er all,the best w ay to study soil microbial diversity w o uld be to use a variety of tests w ith differ ent endpoints and degr ees o f r esolutio n to o btain the bro adest picture possible and the most inform ation r eg ar ding the microbial co mmunity 1 Key words:microbial diversity;biochem ica-l based techniques,mo lecular -based techniques,DNA 微生物多样性研究是微生物生态学最重要的研究内容之一。微生物在土壤中普遍存在,对环境条件的变化反应敏捷,它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程,被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一[1] 。但土壤微生物的种类庞大,使得有关微生物区系的分析工作十分耗时费力。因此,微生物群落结构的研究主要通过微生物生态学的方法来完成,即通过描述微生物群落的稳定性、微生物群落生态学机理以及自然或人为干扰对群落产生的影响,揭示土壤质量与微生物数量和活性之间的关系。利用分子生物学技术和研究策略,揭示自然界各种环境中(尤其是极端环境)微生物多样性的真实水平及其物种组成,是微生物生态学各项研究的基础和核心,是重新认识复杂的微生物世界的开端。

污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性测定方法

第26卷第10期 2006年10月生态学报ACT A EC O LOGIC A SI NIC A V ol.26,N o.10Oct.,2006 污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性测定方法陈承利,廖　敏3 ,曾路生 (污染环境修复与生态健康教育部重点实验室,浙江大学环境与资源学院,杭州　310029)基金项目:国家重点基础研究发展规划“973”资助项目(2002C B410804);国家自然科学基金资助项目(40201026) 收稿日期:2005206227;修订日期:2006205220 作者简介:陈承利(1982～),男,浙江平阳,硕士,主要从事土壤环境化学与环境生态毒理学研究.E 2mail :clchen1982@1631com 3通讯作者C orresponding author.E -mail :liaom in @https://www.wendangku.net/doc/d12403000.html, or liaom inzju1@1631com Found ation item :The project was supported by National K ey Basic Research Support F oundation of China (N o.2002C B410804)and National Natural Science F oundation of China (N o.40201026) R eceived d ate :2005206227;Accepted d ate :2006205220 Biography :CHE N Cheng 2Li ,M aster ,mainly engaged in s oil environmental chem istry and ecotoxicology.E 2mail :clchen1982@1631com 摘要:土壤微生物在促进土壤质量和植物健康方面发挥着重要的作用,土壤微生物群落结构和组成的多样性及其变化在一定程度上反映了土壤质量。为了更好地了解土壤健康状况,非常有必要发展有效的方法来研究污染土壤微生物的多样性、分布以及行为等。回顾了近年来国内外污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性的测定方法,包括生物化学技术和分子生物学技术,现将它们的原理、优缺点、实用性及其发展动态作一阐述,同时指出结合这两种技术可为微生物群落分析提供一个更全面的、精确的方法。关键词:污染土壤;微生物多样性;分子生物学;BI O LOG;P LFA ;PCR ;DNA 文章编号:100020933(2006)1023404209　中图分类号:Q143,Q938,S154　文献标识码:A Methods to measure the microbial community structure and functional diversity in polluted soils CHE N Cheng 2Li ,LI AO Min 3,ZE NG Lu 2Sheng (MOE K ey Laboratory ,Environmental Remediation and Ecosystem H ealth ,College o f Environmental and Resources Sciences ,Zhejiang Univer sity ,Hangzhou ,310029,China ).Acta Ecologica Sinica ,2006,26(10):3404～3412. Abstract :S oil m icroorganisms ,such as bacteria and fungi ,play im portant roles in prom oting soil quality and im proving plant health and nutrition ,thus in fluencing terrestrial ecosystems.Increasing anthropogenic activities ,such as spraw ling urbanization ,agricultural development ,pesticides utilization ,and pollutions from all sources ,can potentially affect soil m icrobial community com position and diversity ,leading to deterioration of soil quality and fertility.H owever ,it is yet to be determ ined how these changes in m icrobial diversity can in fluence surface and ground ecosystems.T o that end ,there is an acute need for reliable and accurate methods to study the community structure and tax onomy of soil m icroorganisms.W ithout the development of effective methods for studying the m icrobial diversity ,distribution ,and behavior in polluted soil ,a thorough understanding of m icrobial diversity ,as well as its im pact on soil health ,cannot be achieved. The determ ination of species diversity depends on several factors including the intensity of each species ,the total number of species present ,species evenness ,and the spatial distribution of species.M ethods to measure m icrobial community structure and functional diversity in polluted soils can be classified into tw o groups ,i.e.,biochem ical 2based techniques and m olecular biological 2based techniques.T ypically ,diversity studies include the relative com parisons of communities across a gradient of stress and disturbance.W ith current techniques ,it is difficult to study true diversity due to lack of know ledge on com position and the techniques to determ ine the accuracy of the extraction or detection methods.T raditionally ,the analysis of soil m icrobial

微生物多样性研究进展

姓名：崔靖璞学号：2010212802 专业：生物科学微生物多样性研究进展摘要：微生物资源丰富,开发潜力巨大,是生命科学发展的主要动力之一.本文介绍了几种常用的研究微生物多样性的分子生物学技术,主要包括:16SrDNA测序、DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等,并对微生物多样性研究技术的未来发展进行了展望，同时本文也介绍几种微生物多样性的研究实验方法。关键词:微生物多样性聚合酶链式反应基因芯片平板纯培养微生物是地球上生物多样性最为丰富的资源,微生物资源的开发,是21世纪生命科学发展的主要动力之一.由于微生物的微观性,微生物多样性与其他高等生物相比有许多独特之处,包括:生存环境多样;生长、繁殖速度多样;营养、代谢类型多样;生活方式多样.微生物多样性的揭示与研究技术的发展和创新是密不可分的,研究技术的进步是微生物多样性研究向前发展的重要推动力量.近年来,随着微电子、计算机、分子生物学、物理、化学等技术的发展,微生物多样性研究技术也在吸收其他学科先进技术的基础上不断向前发展.各种研究方法的发展使得这种状况有了很大改观.现代分子生物学技术在微生物多样性研究上的应用克服了微生物培养技术的限制,能对样品进行较客观的分析,较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性.目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:16SrDNA 测序、DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。 1核酸探针杂交技术核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种分子生物学技术.该技术快速、灵敏、具有高度特异性,近年来被广泛应用于微生物多样性的研究中.用于微生物多样性研究的探针主要有三类:双链DNA、单链DNA和RNA以及寡核苷酸探针,杂交方式主要有荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)、全细胞杂交(whole-cell hybridization)、数量印迹杂交(quantitative dot blot)及生物芯片(biochip).对于环境微生物样品解析而言,最有意义的核酸杂交技术是原位杂交技术,在原位杂交技术中,应用最广泛的是荧光原位杂交技术。

人体微生物群落与疾病

人体微生物群落与疾病人体从一出生开始就有微生物寄生，在慢慢成长的过程中形成性对稳定的微生物菌落平衡。肠道微生物菌落与宿主健康状况的关系十分密切。大多数情况下，微生物菌落与疾病维持着一个简单的关联，但目前还不清楚微生物群的变化是否会精确地引起疾病或者只是简单地反映某种疾病的状态。进一步说，还不清楚微生物平衡是如何或者为什么会朝着菌群失调这种非健康的方向变化。目前的研究认为有三个因素可能会对人体肠道微生物群落产生影响：1、抗菌药的使用。抗菌药物的使用有可能大量杀死某一类型的微生物，从未破坏人体微生物群落。2、饮食。人们的日常饮食会影响人体内微生物的组成，而且食物中的一些化学制剂或者与某些化学制剂具有类似功能的成分都有可能影响体内的微生物菌落。3、心理压力。心理压力也会改变人体内的微生物群落状况，可能引起一些微生物的增加，同时也会降低某些微生物的数量。人体肠道微生物菌落异常与自身免疫疾病、肥胖、糖尿病、自闭症神经系统疾病等很多疾病或健康问题相关。治疗癌症法国巴斯德研究所等机构的研究人员在美国期刊《科学》上报告说，常用于癌症化疗的药物环磷酰胺能够破坏肠道黏液层，让肠道细菌进入循环系统，其中一些到达脾和淋巴结的细菌能促进形成免疫细胞，而后者会攻击癌细胞。但当研究人员用抗生素杀死实验鼠的肠道细菌后，环磷酰胺间接促生免疫细胞的能力会大大降低。《科学》同期发表的美国国家癌症研究院的另一项研究显示，科研人员选取正接受化疗、存活率为70%的癌症实验鼠，并用抗生素杀死其肠道细菌。结果导致这些实验鼠摄入的化疗药物不再起作用，它们的存活率在两个月后下降到20% 生物夺氧需氧微生物，特别是芽胞杆菌消耗肠道内的氧气，形成厌氧的环境，有利于乳酸杆菌等有益微生物的生长，抑制有害需氧菌和兼性厌氧菌的增值，防止发病。双歧杆菌 1、维护肠道正常细菌菌群平衡，抑制病原菌的生长，防止便秘，下痢和胃肠障碍等； 2、抗肿瘤； 3、在肠道内合成维生素、氨基酸和提高机体对钙离子的吸收；

环境微生物群落多样性分析

环境微生物群落多样性分析微生物群落多样性的基本概念环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面，对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量测序技术（尤其是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重要的理论和现实意义。在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微生物群落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传染病病原微生物。研究方法进展环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学方法等等。近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分子生态学的研究策略注入了新的力量。目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。DGGE等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不

微生物多样性研究—α多样性分析

微生物多样研究中的α 多样性指数分析

一、多样性指数介绍 ?多样性指数：是指物种多样性测定。 ?主要有三个空间尺度：α多样性，β多样性，γ多样性。?每个空间尺度的环境不同测定的数据也不相同。

?α多样性：主要关注局域均匀生境下的物种数目，因此也被称为生境内的多样性（within-habitat diversity） ?群落生态学中研究微生物多样性，通过单样品的多样性分析（α[Alpha]多样性）可以反映微生物群落的丰度和多样性，包括一系列统计学分析指数估计环境群落的物种丰度和多样性。

?β多样性：指沿环境梯度不同生境群落之间物种组成的的相异性或物种沿环境梯度的更替速率也被称为生境间的多样性（between-habitat diversity），控制β多样性的主要生态因子有土壤、地貌及干扰等。 ?β多样性意义：①它可以指示生境被物种隔离的程度；②β多样性的测定值可以用来比较不同地段的生境多样性；③β多样性与α多样性一起构成了总体多样性或一定地段的生物异质性。 ?群落生态学中研究微生物多样性，β（Beta）多样性是对不同样品/不同组间样品的微生物群落构成进行比较分析。

?γ多样性：描述区域或大陆尺度的多样性，是指区域或大陆尺度的物种数量，也被称为区域多样性（regional diversity）。控制γ多样性的生态过程主要为水热动态，气候和物种形成及演化的历史。 ?群落生态学中研究微生物多样性，γ多样性分析是指α多样性与β多样性相结合的分析。

二、α多样性指数 1.计算菌群丰度（Community richness）的指数 a)Chao -the Chao1 estimator Chao：是用chao1算法估计样品中所含OTU数目的指数，chao1在生态学中常用来估计物种总数，由Chao (1984) 最早提出。计算公式如下：S c?ao1=S obs+n1n1?1 2n2+1 ?其中，S c?ao1= 估计的OTU数；S obs= 观测到的OTU数；n1= 只有一条序列的OTU数目（如“singletons” ）；n2= 只有两条序列的OTU数目（如“doubletons”）。利用chao指数评估一个样本中OTU数目多少，chao指数越大，OTU数目越多，说明该样本物种数比较多。

微生物学微生物多样性

原核微生物物种多样性中国地域辽阔，地形、气候、土壤和植被等自然条件极为复杂多样，这些决定了中国微生物物种群必然丰富多彩，但是由于中国微生物资源尚未进行全面调查研究，目前在中国科学院微生物菌种保藏中心(非医学微生物保藏中心)保藏的细菌60属，266种，2003株，其中绝大部分是从各省土壤、水域和动、植物样品中分离获得的，有一定代表性，在工农业生产中使用能增产的菌株。 40多年来，中国有关研究单位曾对一些具有重要生态意义、经济价值和社会效益的原核类群进行了比较系统的调查研究，现根据调查结果简述如下： 1、放线菌目前国际上已经描述和发表的放线菌近60个属、2000多种，中国已对40个属中的一部分种进行过分类研究，现保藏有36个属，450种，1332个菌株；其中8个属是中国研究工作者描述和建立的，它们是类链霉菌属(Streptomycoides)、小链孢菌属(Microstreptospora)、异壁放线菌属(Actinoallotaichus)、三歧泡菌属(Trichotomous)、双孢放线菌属(Actinobispora)、游动四孢菌属(Planotetraspora)、动孢链霉菌(Streptoplanospora)和白黄孢囊菌属(Cathayosporangium)。它们具有科学和应用价值。 2、Frankia-共生固氮放线菌 Frankia是一类能与许多木本植物共生的结瘤固氮的放线菌，与这类菌共生的寄主植物广泛分布于世界各地，1978年组织了多学科协作研究，开展了全国放线菌结瘤植物调查，查明中国有6个属44个种的树木与放线菌共生结瘤固氮，其中19种是国际上未报道的新记录种(表1)。表1 中国新发现放线菌结瘤树种

生活污水处理厂微生物群落结构解析

生活污水处理厂微生物群落结构解析发表时间：2018-11-27T16:00:33.133Z 来源：《建筑学研究前沿》2018年第21期作者：安海金[导读] 其中共有19种优势微生物的丰度在1%以上，共有355中菌属的所占比例高于0.01%。通过试验结果可以分析得到A城的城市污水处理厂的水质中有比较丰富的微生物资源，这些微生物资源也为污水处理提供微生物基础。安海金山西华瑞鑫环保科技有限公司山西省太原市 030024摘要：本文的研究对象是A城的城市生活污水处理厂，研究方法为高通量测序技术，最终获得解析功能单元中微生物群体结构结果。通过高通量测序得出ACE指数为20653.4，Chaol指数为12145.8，Shannon指数为6.6，Simpson指数为0.005。其中共有19种优势微生物的丰度在1%以上，共有355中菌属的所占比例高于0.01%。通过试验结果可以分析得到A城的城市污水处理厂的水质中有比较丰富的微生物资源，这些微生物资源也为污水处理提供微生物基础。关键词：生活污水；微生物群体；结构解析引言：随着工业经济的不断发展，国家越来越重视对工业污染的处理要求，污水处理也是一项重要内容。如果污水处理不达标，排放出不符合要求的污水，会直接对湖水、河水产生负面影响，比较常见的就是水体富营养化。在城市污水处理的过程中，脱氮除磷是重要内容，污水处理厂中存在大量的微生物菌属，了解其群落结构特征可以为脱氮除磷在理论上提供帮助，便于脱氮除磷工作在实际工作中的推进。目前，城市污水处理厂使用的主要方法是氧化沟工艺，从微生物群体结构出发来解析的还比较少。本文以A城的污水处理厂为例，使用污水处理厂中的活性污泥作为研究对象，采用高通量测序技术从各级分类水平上分析污水处理厂中的微生物多样性以及其群落结构特征，希望能为氧化沟污水处理提供补充性的理论支持。 1材料与方法 1.1污水处理厂概况 A城污水处理厂位于市区东南河边，每天处理污水量达10—15吨。该污水处理厂的进水水质中TP（总磷）为2.7mg/L，氨氮为18.7mg/L，YN（总氮）为24.5mg/L，化学需氧量为242.8mg/L，升华需氧量为109.5mg/L。处理污水主要使用氧化沟，水力停留时间为十小时。 1.2高通量测序该方法是指将氧化沟厌氧池中的活性泥污放入冰盒后带回实验室立即试验，借助试剂盒的帮助提取微生物基因组DNA，为了检测抽取基因的完整性，需要使用到1%的琼脂糖凝胶电泳，之后用试剂盒来检验基因组DNA的浓度。每个样品需重复三道工序，首先进行3分钟的95℃预变；之后是保持30s的95℃、55℃、72℃的循环，包含25个循环；最后是在72℃下保持5分钟。对PCR产物进行琼脂糖电泳并回收，使用Qubit2.0DNA检测产物的定量，再通过IlluminaMiseq测试平台对PCR产物做高通量测序。 1.3微生物群落结构分析通过对所得序列的质量控制除去不合格的引物序列、短片段和低质量序列，对剩下的序列进行相似性分析，使用uclust软件划分操作分类单元。同时对所选序列进行物种分类，分为门、纲、目、科、属这几个基本单位，根据各单位内的序列数量进行统计分析，绘制物种有关图表。 2结果与讨论 2.1污水处理效果试验时的污水温度处于25—35℃的区间内，笔者对该污水处理厂的进水浓度进行了累计频率分析，结果为该污水处理厂的出水水质是符合一级B类排放标准的。在该污水处理厂升级改良后，出水水质满足一级A类排放标准。 2.2污泥中微生物多样性分析最初共获得了28560条有效序列，通过质量控制后分为4435个分类操作单元，即OUT。对有效序列进行的是α指数多样性分析，结果为ACE指数为20653.4，Chaol指数为12145.8，Shannon指数为6.6，Simpson指数为0.005。后续可根据OUT数目、ACE指数、Chaol指数等绘制丰富度稀疏图或Shannon指数图等，从数值中可以分析出序列数量是接近饱和的，这也表明了污泥中有较多的微生物物种，并且其丰度与多样性都很高。 3微生物群落结构解析 3.1门水平群落结构分析试验结果表明大部分的细菌为变形菌门和浮霉菌门这两类，这两类细菌也是比例超过了20%比例的细菌。变形菌门细菌都是革兰氏阴性菌，有学者指出变形菌门有利于污水中有机物的祛除。浮霉菌门对去除水体中的氨氮和亚硝酸盐氮也有很大的作用，它主要存在于淡水水体、海洋沉积物、污水处理系统、土壤等厌氧环境中。其他占比比较大的细菌还有酸杆菌门、衣原体门、放线菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门，这些细菌都可以处理污水中的有机物，具有相似的作用。 3.2纲水平群落结构分析在纲水平下，浮霉菌纲是最主要的，比例达23%左右，其他比较重要的有γ-变形菌纲、α-变形菌纲、β-变形菌纲等，加起来的比例在25%左右。α-变形菌纲是一种自养微生物，可以在硝化过程中发挥作用；γ-变形菌纲与β-变形菌纲具有相同点，都为兼性异氧菌，参与COD 的降解过程，在污水处理中发挥重要作用。 3.3目水平群落结构分析目水平下的细菌种类较多，比例最高的是浮霉菌目，比例在20%以上，明显高于其他目。变形菌门比例也不低，但种类很多，包括根瘤菌目、红螺菌目、假单胞菌目、黄色单胞菌目、军团菌目、交替单胞菌目、脱硫弧菌目、伯克氏菌目、交替单胞菌目等。衣原体目的比例也比较多，同样包括很多种类，比如鞘脂杆菌目和暖绳菌目等。 3.4科水平群落结构分析

微生物群落多样性测序与功能分析

微生物群落多样性测序与功能分析微生物群落测序是指对微生物群体进行高通量测序，通过分析测序序列的构成分析特定环境中微生物群体的构成情况或基因的组成以及功能。借助不同环境下微生物群落的构成差异分析我们可以分析微生物与环境因素或宿主之间的关系，寻找标志性菌群或特定功能的基因。对微生物群落进行测序包括两类，一类是通过16s rDNA，18s rDNA，ITS区域进行扩增测序分析微生物的群体构成和多样性；还有一类是宏基因组测序，是不经过分离培养微生物，而对所有微生物DNA进行测序，从而分析微生物群落构成，基因构成，挖掘有应用价值的基因资源。以16s rDNA扩增进行测序分析主要用于微生物群落多样性和构成的分析，目前的生物信息学分析也可以基于16s rDNA的测序对微生物群落的基因构成和代谢途径进行预测分析，大大拓展了我们对于环境微生物的微生态认知。目前我们根据16s的测序数据可以将微生物群落分类到种（species）（一般只能对部分菌进行种的鉴定），甚至对亚种级别进行分析，几个概念： 16S rDNA（或16S rRNA）：16S rRNA基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因，长度约为1542bp，其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能体现物种间的差异。16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为主,核心是研究样品中的物种分类、物种丰度以及系统进化。 OTU：operational taxonomic units (OTUs)在微生物的免培养分析中经常用到，通过提取样品的总基因组DNA，利用16S rRNA或ITS的通用引物进行PCR 扩增，通过测序以后就可以分析样品中的微生物多样性，那怎么区分这些不同的序列呢，这个时候就需要引入operational taxonomic units，一般情况下，如

微生物多样性研究—β多样性分析

微生物多样研究中的—β多样性分析

一、β-多样性分析 1. 样品间距离计算 ?样品间的物种丰度分布差异程度可通过统计学中的距离进行量化分析，使用统计算法Euclidean，Bray-Curtis，Unweighted_unifrac，weighted_unifrac等，计算两两样品间距离，获得距离矩阵，可用于后续进一步的beta多样性分析和可视化统计分析。例如：将距离矩阵使用热图表示可直观观察样品间的差异高低分布。 D Bray?Curtis=1?2σmin S A,i，S B,i σS A,i+σS B,i SA,i=表示A样本中第i个OTU所含的序列数；SB,i=表示B样本中第i个OTU所含的序列数。

样品间距离矩阵构建的相似度树状图物种丰度差异基于Bray-Curtis距离heatmap图示意图

2. PCA 分析 ?主成分分析(PCA，Principal Component Analysis)，是一种应用方差分解，对多维数据进行降维，从而提取出数据中最主要的元素和结构的方法。 ?应用PCA分析，能够提取出最大程度反映样品间差异的两个坐标轴，从而将多维数据的差异反映在二维坐标图上，进而揭示复杂数据背景下的简单规律。?如果样品的群落组成越相似，则它们在PCA图中的距离越接近。

3.PCoA分析 ?主坐标分析（PCoA，Principal Co-ordinates Analysis），是一种与PCA类似的降维排序方法，通过一系列的特征值和特征向量排序从多维数据中提取出最主要的元素和结构。 ?可以基于bray_curtis、Weighted Unifrac距离和Unweighted Unifrac距离分别来进行PCoA分析，并选取贡献率最大的主坐标组合进行作图展示。 ?如果样品距离越接近，表示物种组成结构越相似，因此群落结构相似度高的样品倾向于聚集在一起，群落差异很大的样品则会远远分开。

医药化工废水厂中微生物群落结构分析

抗生素的滥用诱导和加速了抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的产生、传播以及抗生素耐药菌(antibiotic resistant bacteria, ARB)形成的风险, 并且ARGs的存在是细菌表现耐药性的根本原因.ARGs作为一类新型的环境污染物, 可通过质粒、整合子以及转座子等可在细菌同种属菌株间和不同种属的菌株之间发生水平基因转移, 即使ARB死亡后, 携带ARGs的裸露DNA会在脱氧核苷酸酶的保护作用下长期存在, 故ARGs在环境中的持久性残留、传播和扩散比抗生素本身的危害还要大.目前, ARGs广泛存在于不同的生态环境中, 如水环境、土壤和大气, 其中作为水环境之一的污水厂被认为是ARB和ARGs巨大的储存地.以前针对ARGs的大多数研究主要集中在处理医院和生活污水的城市污水厂上.然而, 迄今为止, 很少有报道从医药化工废水中检测出ARB和ARGs. ARGs的检测方法有可培方法和非培方法这两大类.可培方法是通过培养基进行微生物分离, 而后根据所分离微生物的耐药性, 结合各种分子生物学方法或者对ARB进行全基因组.但是由于自然环境中超过99%的微生物不能用传统培养基方法进行分离培养, 故可培方法会遗漏大量ARB和ARGs.非培方法有PCR技术、qPCR技术、基因芯片技术及宏基因组学技术.无论是普通PCR技术还是qPCR技术只能局限于已知序列的单一耐药基因检测, 并且只能对少数的ARGs进行同时检测, 最后还需要测序分析来进一步确认.基因芯片技术虽然可以同时检测出大量的ARGs, 但仍然要依赖于根据已知的耐药基因序列设计出相应的特异性强的探针, 并且其制作复杂, 费用昂贵.而随着生物技术的不断发展, 宏基因组测序也越来越多地应用于医学研究及临床诊断领域, 如感染类型诊断、抗性基因的鉴定和传染病的防控等.宏基因组技术通过高通量测序, 打破了传统以培养为主的微生物研究方式, 直接提取遗传物质进行遗传操作, 不仅可以准确获得样品微生物物种组成及丰度等信息, 进入数据库预测微生物功能, 还能分析微生物代谢网络等多方面的信息, 并且可同时检测大量的ARGs, 为寻找新基因、研究微生物多样性提供了便利的工具. 本研究借助宏基因组技术调查医药化工废水厂中微生物群落组成, 并分析ARGs的多样性及两者之间的关系, 对掌握医药化工废水中ARGs的污染现状及控制其传播, 保护微生态环境具有重要指导意义. 1 材料与方法 1.1 样品采集本实验样品取自江苏某医药化工园区废水处理厂, 该废水厂主要功能是处理园区各医药化工企业排放的工业废水, 纳入废水厂管网的废水包括抗生素中间体废水及农药中间体废水等多种医药化工废水.该废水厂日处理量10万t, 收集的废水中含β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类和四环素类等几大类抗生素生产过程中产生的高浓发酵废水、化学合成废水、其他制剂废水及混合废水(清洗水、冷却循环水和生活污水等).废水中含大量残留的抗生素原材料、副反应产物, 还含有机溶剂二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、四氢呋喃和二氯甲烷等.废水厂主要采用厌氧-缺氧-好氧(A2O)工艺.本实验样品为活性污泥, 具体取自完全混合式好氧生物处理池.取样时先在池内前中后三段各取约500 mL泥水混合样品, 以保证样品具有代表性, 现场混合均匀后, 用无菌50 mL离心管分装后冰袋低温冷藏, 当日即进行基因组DNA提取. 1.2 基因组DNA提取